浙貝-甘草藥對調(diào)控NF-κB 信號通路抑制非小細胞肺癌的機制研究

周夏成 劉遠財 楊佳穎 張愛琴

肺癌又稱原發(fā)性支氣管肺癌，是一種源自支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，屬中醫(yī)學“肺巖”“息賁”“肺積”等范疇。截至2020 年，肺癌新發(fā)病例約209萬，死亡人數(shù)約180 萬，占癌癥死亡總?cè)藬?shù)的18.4%，大約85%的肺癌為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[1-2]。當前NSCLC 的治療方式依然是以手術(shù)、化療、放療、靶向治療及免疫治療等在內(nèi)的綜合治療為主，而中醫(yī)藥抗腫瘤具有多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點、整體調(diào)節(jié)的特點，聯(lián)合現(xiàn)代治療肺癌方法，在延長患者生存期，提高生活質(zhì)量，減輕毒副反應(yīng)等方面，發(fā)揮了重要作用[3-4]。浙貝母-甘草藥對選自吳良村教授治療NSCLC 經(jīng)典方新加沙參麥冬湯[5]。浙貝母[6]味苦性寒，歸肺、心經(jīng)，具有清熱化痰、降氣止咳、散結(jié)消腫之效。甘草味甘性平，歸十二經(jīng)，具有補中益氣、清熱解毒、潤肺袪痰之效，兩藥配伍，共奏清肺化痰、消結(jié)散核之效，是臨床治療NSCLC 的常用藥對，但具體作用機制尚不清晰。本研究擬根據(jù)浙貝-甘草藥對的網(wǎng)絡(luò)藥理學富集結(jié)果，從動物、細胞和分子水平研究浙貝-甘草藥對對NSCLC細胞增殖的影響，探索浙貝-甘草藥對治療NSCLC的具體作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材 料

1.1 小鼠與細胞株 1～8 周齡，體質(zhì)量18～20 g 雄性C57BL/6J 野生型小鼠30 只，購買于浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2021-0033，均飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%的清潔動物房內(nèi)，動物自由取食、飲水，自動控制光照/黑暗交替（12 h/12 h）。本研究經(jīng)動物實驗倫理審核通過（批準編號：202205-0602）。

LLC 小鼠Lewis 肺癌細胞，購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司（批號iCell-m027）。

1.2 藥 物 浙貝母15 g、甘草6 g 購于浙江省腫瘤醫(yī)院（批號20211006）。

1.3 主要試劑與儀器 細胞組織快速裂解液（RIPA）（批號090121211229）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（批號20220212）均購自碧云天；蛋白酶抑制劑（批號50321）購自康為世紀；二奎啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒（批號20220218）、預染蛋白marker（批號326G022） 均購自Solarbio；30%acylamide （批號H108KA8405）、1.5M Tris pH8.8（批號22011373）、1.0M Tris pH6.8（批號21230507）均購自Biosharp；10%過硫酸銨（批號H616BA1001）購自BBI Life Sciences；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）（批號R1NB74016）購自millipore；蘇木素-伊紅染色套裝（HE 染液）（批號20220305）購自Runnerbio；核因子-κB1（NF-κB1）抗體（批號12540-7）購自CST；Toll 樣受體4（TLR-4）抗體（批號16c5074）、NF-κB p65（RelA）抗體（批號 25h4677）、Goat Anti Mouse IgG HL Alexa Fluor647（批號GR2553287-3）均購自Affinity；牛血清蛋白（BSA）（批號220107）、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris-base）（批號WXBD176V）、乙二胺四乙酸（EDTA）（批號P2050518）均購自Sigma。低溫高速離心機（型號：Micro17R）購自Thermo；電泳儀（型號：EPS300）、電泳槽（型號：VE 180C）、轉(zhuǎn)膜儀（型號：VE186）均購自天能；化學發(fā)光儀（型號：610020-9Q）購自勤翔；組織攤片機（型號：KD-P）購自科迪，脫色搖床（型號：TSY-B）、渦旋混合器（型號：MX-F）、掌上離心機（型號：D1008E）均購自Servicebio。

2 方 法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

2.1.1 浙貝-甘草藥對活性成分篩選 本研究根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）以及類藥性（drug-likeliss，DL）[7]篩選出藥代動力學性質(zhì)良好的活性成分。

2.1.2 藥物靶點預測 將活性成分導入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，取可能性分值大于0.1，預測化合物發(fā)揮藥效的潛在作用靶點。運用Cytoscape3.8.2 把結(jié)果進行可視化展示，構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.3 NSCLC 相關(guān)疾病靶點篩選 利用GeneCards和DiSGeNET 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置搜索詞為“Non-small cell lung cance”或“NSCLC”進行檢索，獲取NSCLC 相關(guān)靶點。

2.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI） 將浙貝-甘草藥對潛在作用靶點與NSCLC 相關(guān)疾病靶點交集，并上傳到STRING 數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo sapiens”，互作分數(shù)選擇（interaction score）≥0.9，得到PPI 信息并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。把結(jié)果導入Cytoscape3.8.2 軟件，對交集靶點進行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并進行拓撲分析，將度值（Degree）≥2 倍中值的節(jié)點確定為關(guān)鍵靶點[8]。

2.1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析將關(guān)鍵靶點上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，進行GO 富集分析，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC），物種選擇“Home sapiens”，設(shè)定閾值（P）＜0.01。

2.1.6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將關(guān)鍵靶點上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，設(shè)定閾值（P）＜0.01，進行京都基因與KEGG 富集分析。

2.2 體內(nèi)實驗

2.2.1 實驗分組與造模 取20 只小鼠用Lewis 肺癌細胞制備小鼠皮下成瘤模型，并按隨機數(shù)字表法分為浙貝-甘草藥對等效劑量組與模型組各10 只，另取10 只未造模小鼠為對照組進行研究。

2.2.2 藥物干預 當瘤體體積達到500 mm3左右后灌胃給藥，每天0.2 mL/只，連續(xù)4 周。浙貝-甘草藥對等效劑量組的藥物濃度為臨床常用濃度（每50 kg體質(zhì)量浙貝母15 g，甘草6 g），模型組與對照組采用等量生理鹽水。

2.2.3 瘤徑測量 給藥后，剝離瘤體稱重，用游標卡尺測量腫瘤組織的長徑與短徑，計算體積（體積=長徑×短徑）。

2.2.4 HE 染色 將剝離下來的瘤體制作成切片，行蘇木素染色、伊紅染色，再行脫水封片，在鏡檢下行圖像采集分析。根據(jù)光鏡下腫瘤細胞壞死面積給以HE 染色評分：0 級：正常，為0 分；1 級：少量腫瘤細胞損傷，腫瘤壞死面積≤25%，為1 分；2 級：明顯腫瘤細胞損傷，腫瘤壞死面積＜25%～50%，為2 分；3級：明顯腫瘤細胞損傷，腫瘤壞死面積＜50%～75%，為3 分；4 級：大量腫瘤細胞損傷，腫瘤壞死面積＞75%，為4 分[9]。

2.2.5 免疫組化檢測 將組織切片脫蠟，修復，后用H2O2處理，再行血清封閉，進行一抗、二抗反應(yīng)后二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。蘇木素復染后脫水封片，行鏡檢和圖像采集分析。

2.2.6 Western blot 檢測 各組腫瘤組織經(jīng)處理后，用RIPA 裂解液抽提細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水與補間（TBST）洗膜3 次。再將PVDF 膜放入孵育盒中，進行封閉。結(jié)束后進行一抗及二抗反應(yīng)。加入電化學發(fā)光試劑后，于凝膠成像系統(tǒng)中顯影并觀察記錄。

2.2.7 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間計量資料若符合正態(tài)分布且符合方差齊性檢驗，用One-way-ANOAY 單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用Turkey 檢驗；若符合正態(tài)分布但方差不齊，則采用Dunnett’s T3 檢驗或獨立樣本t 檢驗；若不符合正態(tài)分布，則采用Kruskal-Wallis H檢驗。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s） 表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果

3.1.1 浙貝-甘草藥對的活性成分 根據(jù)OB≥30%及類藥性DL≥0.18 進行篩選，經(jīng)去重后，共篩選出97個活性成分，包括槲皮素（Quercetin）、β-谷甾醇（Beta-Sitosterol）、谷甾醇（Sitosterol）、山奈酚（Kaempferol）、甘草醇（Glycyrol）、柚皮素（Naringenin）等。

3.1.2 浙貝-甘草藥對的潛在靶點 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫、SwissTargetPrediction、PharmMapper 預測上述有效活性成分的靶點，經(jīng)過去重合并，共1026 個藥物靶點。利用Cytoscape3.8.2 軟件將結(jié)果可視化處理，并構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。

圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

3.1.3 NSCLC 相關(guān)疾病靶點及PPI 網(wǎng)絡(luò) 去重合并后共有6495 個NSCLC 相關(guān)疾病靶點。將浙貝-甘草潛在作用靶點與NSCLC 疾病靶點交集，共有690 個交集靶點。將其導入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫，獲得靶點聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖，導入Cytoscape3.8.2 后，拓撲分析得到關(guān)鍵靶點88 個。將關(guān)鍵靶點與對應(yīng)的化合物聯(lián)系，導入Cytoscape3.8.2 分析，得到浙貝-甘草藥對治療NSCLC 的關(guān)鍵成分，并根據(jù)Degree 值進行排序，顏色越深代表Degree 值越高。見圖2～4 及表1。

表1 藥物關(guān)鍵成分表

圖2 交集靶點PPI 互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 藥物關(guān)鍵靶點

3.1.4 GO 富集分析 GO 富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浙貝-甘草藥對主要是通過細胞溶膠（Cytosol）、細胞質(zhì)（Cytoplasm）、細胞核（Nucleus）、質(zhì)膜（Plasma Membrane）等細胞組分參與信號轉(zhuǎn)導（Promoter）、蛋白質(zhì)磷酸化（Signal Transduction）、凋亡過程的負調(diào)控（Protein Phosphorylation）、基因表達的正調(diào)節(jié)（Negative Regulation of Apoptotic Process）、細胞增殖的正調(diào)節(jié)（Positive Regulation of Gene Expression）等生物學過程，發(fā)揮了蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein Binding）、ATP 結(jié)合（ATP Binding）、酶結(jié)合（Enzyme Binding）、蛋白激酶活性（Protein Kinase Activity）等分子功能，從而起到干預NSCLC 的作用。見圖5。

圖5 DAVID 數(shù)據(jù)庫中GO 富集分析圖

3.1.5 KEGG 富集分析 通過DAVID 數(shù)據(jù)庫共獲得2215 條富集通路，按照P＜0.01 條件，得到159 條與NSCLC 相關(guān)的通路，根據(jù)Count 數(shù)選取排在前40的通路，利用氣泡圖進行可視化。X 軸是Enrichment，Y 軸是通路名稱，氣泡圖的大小代表Count 數(shù)目，顏色代表Fdr 值。富集結(jié)果分析得知，浙貝-甘草藥對干預NSCLC 可能與鳥苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶G（cGMP PKG）信號通路、TGF-β 信號通路、p53 信號通路、NF-κB 信號通路等相關(guān)。見圖6。

圖6 DAVID 數(shù)據(jù)庫中KEGG 富集分析圖

圖7 小鼠腫瘤圖

3.2 體內(nèi)實驗

3.2.1 浙貝-甘草藥對對小鼠皮下移植瘤瘤重、瘤體積的影響 藥對等效劑量組瘤重、瘤體積比模型組顯著減少（P＜0.01），見表2 和7 圖。

表2 各組小鼠瘤重、瘤體積變化情況（±s）

表2 各組小鼠瘤重、瘤體積變化情況（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.01

指標瘤體積（mm3）第0 天第3 天第6 天第9 天第12 天第15 天第19 天第23 天第28 天瘤重（g）例數(shù)10模型組藥對等效劑量組10 46.58±10.94 64.37±8.38 128.46±17.84 187.02±24.37 265.64±38.55 341.57±49.27 402.09±76.56 505.28±103.87 743.62±125.95 0.66±0.16 42.87±5.40 43.48±5.91a 46.06±6.33a 51.72±7.86a 58.72±9.57a 80.11±15.34a 130.90±31.38a 212.74±36.49a 358.74±50.54a 0.28±0.05a

3.2.3 浙貝-甘草藥對對腫瘤細胞損傷壞死的影響浙貝甘草藥對等效劑量組腫瘤組織中細胞損傷壞死較模型組增加（見圖8），HE 半定量評分較模型組升高[（3.20±0.45）分比（0.20±0.45）分，P＜0.01）]。

圖8 小鼠腫瘤組織病理學改變（HE 染色，200×）

3.2.4 浙貝-甘草藥對對NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達量的影響 免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，藥對等效劑量組瘤體組織中TLR-4、NF-κB 1、RelA 的蛋白表達量均顯著降低（P＜0.01）。見圖9 及表3。Western blot 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浙貝甘草藥對等效劑量組小鼠腫瘤組織中TLR-4、NF-κB1、RelA 蛋白表達水平降低（P＜0.01）。見圖10 及表4。

表3 瘤體組織中TLR-4、NF-κB 1、RelA 的蛋白表達量（±s）

表3 瘤體組織中TLR-4、NF-κB 1、RelA 的蛋白表達量（±s）

注：TLR-4 為Toll 樣受體4 蛋白；NF-κB1 為細胞核因子-κB1 蛋白；RelA（NF-κB p65）為細胞核因子-κB p65 蛋白；與模型組比較，aP＜0.05

組別模型組藥對等效劑量組鼠數(shù)5 5 TLR-4 0.460±0.027 0.237±0.033a NF-κB1 0.401±0.062 0.204±0.035a RelA（NF-κB p65）0.426±0.023 0.219±0.021a

表4 小鼠腫瘤組織中TLR-4、NF-κB 1、RelA 蛋白表達情況

圖9 各組Lewis 細胞中TLR4、NF-κB1、RelA 的蛋白表達情況（免疫組化染色，200×）

圖10 小鼠腫瘤組織中TLR-4、NF-κB1、RelA 蛋白表達條帶圖

4 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學對于浙貝母及甘草有諸多研究。唐曉勇[10]發(fā)現(xiàn)，從浙貝母中提取的浙貝母堿可逆轉(zhuǎn)人肺腺癌耐順鉑株（A549/DDP）細胞株的多藥耐藥，其機理與促進細胞凋亡、下調(diào)肺耐藥（L-RP）蛋白表達、抑制切除修復交叉互補基因1（ERCC1）mRNA 表達，從而降低DNA 的修復能力有關(guān)。李澤宇等[11]通過數(shù)據(jù)挖掘分析發(fā)現(xiàn)，甘草現(xiàn)代藥理在抗炎、心腦血管保護、神經(jīng)保護、抗病毒、抗腫瘤方面的應(yīng)用十分廣泛。甘草提取物甘草查爾酮（LCB）能抑制人NSCLC 細胞HCC827 的生長并誘導其細胞凋亡[12]。

浙貝-甘草藥對的有效成分中，槲皮素作為一種廣泛存在于植物界、具有多種生物學活性的黃酮類化合物，已被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用[13-14]。山奈酚屬于黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚可以調(diào)控和B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）及Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）表達，誘導NSCLC 細胞凋亡，還可以抑制NSCLC 細胞上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[15-16]。柚皮素是一種天然的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理作用[17]。

在浙貝-甘草藥對治療NSCLC 的關(guān)鍵靶點中，編碼p53 的基因（TP53）是公認的抑癌基因，TP53 蛋白有調(diào)節(jié)多種細胞功能，如DNA 合成和修復、細胞周期阻滯、衰老和凋亡[18]。酪氨酸激酶（SRC）是人類歷史上第一個被發(fā)現(xiàn)的原癌基因，它能激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活（STAT），磷酸肌醇三磷酸激酶-絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）和表皮生長因子受體（EGFR）等多條信號通路，其中STAT3 可通過介導炎癥介質(zhì)的細胞外信號調(diào)控腫瘤細胞、免疫細胞等生物學行為，促進腫瘤發(fā)生及相關(guān)炎癥的形成。結(jié)合GO 富集分析和KEGG 富集分析結(jié)果，浙貝-甘草藥對可能通過調(diào)控NF-κB 信號通路，影響細胞增殖、凋亡，最終達到干預NSCLC 的作用。而NF-κB 信號通路上富集到的關(guān)鍵靶點有TLR-4、NF-κB1、RelA 等，細胞及動物實驗的結(jié)果提示，浙貝-甘草藥對可能通過干預上述靶蛋白的表達起到抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用。NF-κB 信號通路是指哺乳動物核轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）NF-κB 家族，其與多種惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系[19]。NF-κB 信號通路在多種NSCLC 組織中通常呈組成性活化，這種異?；罨ㄟ^干擾細胞凋亡與細胞正常周期，在NSCLC 的惡化增殖中發(fā)揮重要作用[20]。NF-κB 因子自身和相關(guān)調(diào)控蛋白酶與NSCLC 抗凋亡及細胞周期調(diào)控高度關(guān)聯(lián)，其促進NSCLC 發(fā)展的主要機制是通過調(diào)控細胞抗凋亡和細胞周期相關(guān)基因的表達促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[21]。NF-κB1（NF-κB p50）及RelA（NF-κB p65）是NF-κB 家族的兩個亞單位，研究表明，通過影響RelA 的表達可以抑制NF-κB 信號通路介導的細胞存活、增殖、腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移和炎癥反應(yīng)[22]。Toll 樣受體（TLRs）是存在于細胞表面?zhèn)鬟f信號通路表達的受體蛋白，其對病原體衍生的分子具有識別作用，繼而產(chǎn)生復雜免疫效應(yīng)，調(diào)節(jié)組織細胞免疫和炎癥創(chuàng)傷的全過程[23]。在TLRs 家族中，介導炎癥的TLR-4 不僅廣泛表達于NK 細胞、巨噬細胞等免疫原性細胞，發(fā)揮啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)、激活大量炎癥介質(zhì)等作用，也表達于肝細胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤，起到激活多種腫瘤的生物學行為的效應(yīng)[24]。TLR-4 通過與其配體結(jié)合，可激活NF-κB 途徑。研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4 與NF-κB 在NSCLC 中的表達明顯增加，表達程度與NSCLC 的分化程度密切相關(guān)[25]。

體內(nèi)實驗顯示，浙貝-甘草藥對可以降低腫瘤組織的增長速率、造成腫瘤組織的細胞損傷壞死。Western blot 檢測及免疫組化檢測結(jié)果顯示，浙貝-甘草組可以明顯下調(diào)TLR-4、NF-κB1、RelA 蛋白表達。

綜上所述，本研究提示浙貝-甘草藥對作為一組具有抗癌作用的中藥藥對，可通過抑制NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白TLR-4、NF-κB1、RelA，抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，為探索浙貝-甘草藥對抗腫瘤的機制提供一定的研究基礎(chǔ)。