冬凌草甲素逆轉(zhuǎn)BEL-7402/5-FU 化療耐藥作用的體內(nèi)研究

史國軍 王永生 何國濃 葉興濤 施 航 陳如兒

化療是肝癌治療的重要手段之一，化療耐藥是目前治療最大障礙[1]。如何增加惡性腫瘤對化療藥物的敏感性，提高療效是臨床上的主要難題。體外實驗發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能影響細胞增殖、凋亡和細胞周期，干預(yù)Hippo 信號通路，而實現(xiàn)部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞化療耐藥的功能。然而冬凌草甲素作為細胞毒藥物的協(xié)同劑所發(fā)揮的抗腫瘤作用，在體內(nèi)是否同樣有逆轉(zhuǎn)化療耐藥的功能，筆者就此進行了進一步的研究?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養(yǎng) 人肝癌細胞株BEL-7402，來源于中科院上海細胞庫。

1.2 實驗動物 4～6 周齡BALB/c 雌性裸小鼠40只，體質(zhì)量14～16 g，由上海靈暢生物科技有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003，質(zhì)量合格證號：20180003022587，使用許可證號：SYXK（浙）2019-0010。在無特定病原體（SPF）條件下飼養(yǎng)。溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，12 h 晝夜節(jié)律飼養(yǎng)。本實驗研究經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院實驗動物福利倫理委員會審查通過，倫理審查批號：浙中研動物倫理審字第[2022]053 號。

1.3 試劑與藥物 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，批號AK22355A）；Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associatedprotein，YAP）、具有PDZ 結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共刺激因子（transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，批號AK31128A）；全自動蛋白定量分析試劑盒（Protein Simple 公司，批號64505）；抗體均為兔來源，包括細胞周期蛋白D1抗體（CyclinDl），結(jié)締組織生長因子抗體（connective tissue growth factor，CTGF）、生存素抗體（Survivin）、B 淋巴細胞瘤-2 抗體（Bcl-2）（杭州戴格生物技術(shù)有限公司，批號分別為Q0316、R1106、S0910、T0729）。冬凌草甲素（Oridonin，CAS：28957-04-2，批號A15A0287）（純度≥99%），購于成都普思生物科技股份有限公司。氟尿嘧啶注射液（10 mL:0.25 g，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號FA201005）。

1.4 主要儀器 3111 型CO2培養(yǎng)箱（Thermo 公司）；Centrifuge 5810R 型離心機（Eppendorf 公司）；HR40-Ⅱ-A2 型醫(yī)用凈化工作臺（青島海爾特種電器有限公司）；DFC 7000T 型倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；Step One Plus 熒光定量PCR 儀（ABI 公司）；WES 全自動蛋白定量分析儀（美國Protein Simple 公司）。

1.5 人肝癌BEL-7402/5-FU 耐藥細胞株的建立人肝癌BEL-7402 細胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊的誘導(dǎo)方法，用含0.1 μmol/L 5-FU 的培養(yǎng)液，低濃度持續(xù)誘導(dǎo)3～5 d，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，當細胞恢復(fù)生長后，加入含10 μmol/L 5-FU 的培養(yǎng)液進行大劑量沖擊誘導(dǎo)，待存活細胞恢復(fù)增殖后，加入含1 μmol/L 5-FU 的培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)，直至細胞能在該濃度下增殖。根據(jù)以上方法反復(fù)誘導(dǎo)，當細胞能在含50 μmol/L 5-FU 的培養(yǎng)液中存活時，即為人肝癌BEL-7402/5-FU 耐藥細胞株。

1.6 裸鼠肝癌移植瘤模型的建立 取對數(shù)生長期的BEL-7402/5-FU 細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107個/mL，接種至裸鼠右腋皮下，0.2 mL/只，共40 只。接種后5 d 開始觀察成瘤情況，當腫瘤長至100 mm3時，按照隨機數(shù)字表法分成八組，即模型組，冬凌草甲素高、中、低劑量組[分別為75、50、25 mg/（kg·d）]，5-FU 組，5-FU+冬凌草甲素高、中、低劑量組，每組5 只。分組當天開始灌胃給藥，冬凌草甲素高、中、低劑量組及合用組給予相應(yīng)濃度冬凌草甲素溶液灌胃，模型組給予生理鹽水灌胃，灌胃容積均為0.2 mL/10 g。5-FU 組及5-FU+冬凌草甲素高、中、低劑量組給予5-FU 腹腔注射20 mg/（kg·d），每日1 次，連續(xù)5 d。每周測量1 次體質(zhì)量，每隔3 d 分別用游標卡尺測量移植瘤最大長徑（a）及橫徑（b），計算瘤體積，腫瘤體積V（mm3）=1/2ab2，并繪制腫瘤生長曲線。實驗結(jié)束時完整剝?nèi)×鲶w，稱瘤重，計算抑瘤率（%），抑瘤率=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

1.7 實時熒光定量PCR 法檢測各組腫瘤組織中YAP、TAZ 的mRNA 表達水平 取上述裸鼠部分腫瘤組織，液氮研磨，Trizol 法提取總RNA，按照試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和Real-time PCR 檢測。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，30 s，95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40 個循環(huán)；熔解曲線95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s。YAP上游引物5'-CAGAACCGTTTCCCAGACTACCTTG-3'，下游引物5'-GCAGACTTGGCATCAGCTCCTC-3'；TAZ 上游引物5'-ATCACCAACACCAGCAGCAGATG-3'，下游引物5'-TGGATTCTCTGAAGCCGCAGTTTC-3'；內(nèi)參EF-1α 上游引物5'-CGAGCCACCATACAGTCAGA-3'，下游引物5'-CCATTCCAACCAGAAATTGG-3'；采用相對定量分析方法（2-ΔΔCt法）進行分析。

1.8 Western blot 法檢測各組腫瘤組織中CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 的蛋白表達水平 取上述裸鼠部分腫瘤組織，液氮研磨，用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，按照WES 全自動蛋白定量分析試劑盒的操作說明，在反應(yīng)板內(nèi)依次加入蛋白樣品3 μL/孔，抗體稀釋液10 μL/孔，兔抗人CyclinDl 抗體、CTGF 抗體、Survivin 抗體、Bcl-2抗體（一抗，1∶20 稀釋）10 μL/孔，兔抗人GAPDH 抗體（內(nèi)參，1∶200 稀釋）10 μL/孔，HRP 標記山羊抗兔IgG 抗體（二抗）10 μL/孔，發(fā)光液15 μL/孔，清洗緩沖液500 μL/孔，用WES 全自動蛋白定量分析儀進行檢測，并用Compass 軟件進行峰面積（Peak area，PA）的分析，蛋白相對表達水平用PA目標蛋白/PA內(nèi)參蛋白比值表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s） 表示。多組間比較采用單因素方差分析法，兩組間比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 冬凌草甲素對裸鼠移植瘤生長的影響 所有裸鼠均于接種后7 d 左右出現(xiàn)肉眼可見的瘤體，表現(xiàn)為接種部位出現(xiàn)皮下小結(jié)節(jié)，起初橢圓形，逐漸變不規(guī)則，成瘤率100%。腫瘤長至100 mm3左右時，即第2周開始分組給藥。給藥1 周后，與模型組比較，5-FU組的裸鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；冬凌草甲素高、低劑量組和5-FU+冬凌草甲素中劑量組體質(zhì)量顯著高于5-FU 組（P＜0.05）。給藥結(jié)束后，5-FU 組和5-FU+冬凌草甲素高劑量組的體質(zhì)量顯著低于模型組（P＜0.01）；而冬凌草甲素高、中、低劑量組和5-FU+冬凌草甲素高、中劑量組的體質(zhì)量均高于5-FU 組（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，給藥各組的瘤重顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與5-FU 組相比，5-FU+冬凌草甲素高、中劑量組的瘤重顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。各組的抑瘤率為25.18%～79.38%。見表1、2。

表1 各組裸鼠體質(zhì)量變化（g，±s）

表1 各組裸鼠體質(zhì)量變化（g，±s）

注：模型組予生理鹽水灌胃；冬凌草甲素高、中、低劑量組予75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素溶液灌胃；5-Fu 組予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射；5-Fu+冬凌草甲素高、中、低劑量組予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射+75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素灌胃；與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與5-FU 組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別模型組冬凌草甲素高劑量組冬凌草甲素中劑量組冬凌草甲素低劑量組5-FU 組5-FU+冬凌草甲素高劑量組5-FU+冬凌草甲素中劑量組5-FU+冬凌草甲素低劑量組鼠數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5第1 周15.68±1.46 15.28±1.07 15.24±0.63 15.76±0.70 15.80±0.80 15.22±0.79 15.90±1.16 16.02±1.10第2 周17.46±0.82 17.86±0.44 17.32±0.63 17.44±0.82 18.02±0.91 17.64±0.98 17.84±0.74 17.54±0.42第3 周18.46±1.16 17.74±0.89c 17.38±0.86 18.38±1.15c 16.64±1.57a 17.14±0.86 18.02±1.34c 17.16±0.78第4 周20.76±0.79 18.84±0.81d 19.28±0.57d 19.60±1.95c 15.32±1.36b 16.44±0.39bc 17.62±1.69d 16.72±2.08

表2 各組裸鼠瘤重與抑瘤率比較（±s）

表2 各組裸鼠瘤重與抑瘤率比較（±s）

注：模型組予生理鹽水灌胃；冬凌草甲素高、中、低劑量組予75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素溶液灌胃；5-Fu 組予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射；5-Fu+冬凌草甲素高、中、低劑量組予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射+75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素灌胃；“-”為無此項數(shù)據(jù)；與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與5-FU 組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別模型組冬凌草甲素高劑量組冬凌草甲素中劑量組冬凌草甲素低劑量組5-FU 組5-FU+冬凌草甲素高劑量組5-FU+冬凌草甲素中劑量組5-FU+冬凌草甲素低劑量組鼠數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5瘤重（g）1.852±0.584 1.079±0.307bc 1.240±0.250bd 1.386±0.329ad 0.783±0.194b 0.382±0.214bd 0.603±0.204bc 0.897±0.317b抑瘤率（%）-41.75 35.41 25.18 57.72 79.38 67.45 51.57

與模型組比較，分組給藥第1 天，各組瘤體積大小無顯著差異。給藥第5 天，與模型組比較，5-FU+冬凌草甲素高、中、低劑量組的瘤體積顯著縮?。≒＜0.05，P＜0.01）；與5-FU 組比較，5-FU+冬凌草甲素高劑量組瘤體積顯著縮?。≒＜0.05）。給藥第9 天，與模型組比較，5-FU+冬凌草甲素高、中、低劑量組，5-FU組，冬凌草甲素高、中劑量組瘤體積明顯縮?。≒＜0.05，P＜0.01）；與5-FU 組比較，5-FU+冬凌草甲素高、中劑量組瘤體積顯著縮?。≒＜0.05，P＜0.01）。給藥14 d 后，除冬凌草甲素低劑量組外，其余各組的瘤體積均明顯小于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；與5-FU 組比較，5-FU+冬凌草甲素高劑量組瘤體積顯著縮?。≒＜0.01）。見圖1。

圖1 裸鼠移植瘤生長曲線

2.2 冬凌草甲素對裸鼠移植瘤組織YAP、TAZ mRNA表達的影響 與模型組比較，5-FU 組和5-FU+冬凌草甲素高、中、低劑量組的YAP mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，冬凌草甲素高劑量組，5-FU 組，5-FU+冬凌草甲素高、中、低劑量組的TAZ mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與5-FU 組比較，5-FU+冬凌草甲素高劑量組的TAZ mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組瘤組織中YAP、TAZ 的mRNA 相對表達量（±s）

表3 各組瘤組織中YAP、TAZ 的mRNA 相對表達量（±s）

注：模型組予生理鹽水灌胃；冬凌草甲素高、中、低劑量組予75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素溶液灌胃；5-Fu 組予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射；5-Fu+冬凌草甲素高、中、低劑量組予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射+75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素灌胃；YAP 為Yes 相關(guān)蛋白；TAZ 為具有PDZ 結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共刺激因子；與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與5-FU 組比較，cP＜0.05

組別模型組冬凌草甲素高劑量組冬凌草甲素中劑量組冬凌草甲素低劑量組5-FU 組5-FU+冬凌草甲素高劑量組5-FU+冬凌草甲素中劑量組5-FU+冬凌草甲素低劑量組鼠數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5 YAP 1.003±0.093 0.914±0.269 0.889±0.266 0.873±0.287 0.319±0.142a 0.242±0.120a 0.231±0.114a 0.267±0.053b TAZ 1.003±0.096 0.649±0.253a 0.847±0.109 0.912±0.229 0.542±0.222b 0.225±0.114bc 0.416±0.185b 0.446±0.147b

2.3 冬凌草甲素對裸鼠移植瘤組織CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 蛋白表達的影響 與模型組比較，冬凌草甲素中劑量組，5-FU 組，5-FU+冬凌草甲素高、中劑量組的CyclinDl 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組的CTGF 蛋白相對表達量均顯著降低（P＜0.01）；與5-FU 組相比，冬凌草甲素高劑量組，5-FU+冬凌草甲素高、中劑量組的CTGF 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，冬凌草甲素高、中劑量組，5-FU+冬凌草甲素高、中劑量組的Survivin 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與5-FU 組比較，5-FU+冬凌草甲素高劑量組的Survivin 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，冬凌草甲素高、中劑量組，5-FU 組，5-FU+冬凌草甲素高、中劑量組的Bcl-2 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與5-FU 組比較，5-FU+冬凌草甲素高劑量組的Bcl-2 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01）。見圖2 和表4。

圖2 各組瘤組織中CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 的蛋白相對表達量

表4 各組瘤組織中CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 的蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組瘤組織中CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 的蛋白相對表達量比較（±s）

注：模型組予生理鹽水灌胃；冬凌草甲素高、中、低劑量組予75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素溶液灌胃；5-Fu 組予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射；5-Fu+冬凌草甲素高、中、低劑量組予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射+75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素灌胃；CyclinDl 為細胞周期蛋白D1；CTGF為結(jié)締組織生長因子；Survivin 為生存素；Bcl-2 為B 淋巴細胞瘤-2；與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與5-FU 組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別模型組冬凌草甲素高劑量組冬凌草甲素中劑量組冬凌草甲素低劑量組5-FU 組5-FU+冬凌草甲素高劑量組5-FU+冬凌草甲素中劑量組5-FU+冬凌草甲素低劑量組鼠數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5 CyclinDl 0.445±0.087 0.360±0.071 0.333±0.050a 0.357±0.056 0.327±0.069a 0.284±0.033b 0.336±0.053a 0.356±0.034 CTGF 0.171±0.025 0.045±0.010bd 0.089±0.007b 0.103±0.023b 0.095±0.008b 0.041±0.013bd 0.049±0.007bd 0.100±0.019b Survivin 0.386±0.060 0.297±0.065a 0.293±0.062a 0.352±0.062 0.309±0.031 0.185±0.056bd 0.289±0.026a 0.298±0.025 Bcl-2 0.472±0.049 0.281±0.036b 0.356±0.053a 0.412±0.088 0.375±0.033a 0.175±0.034bd 0.374±0.057a 0.394±0.071

3 討 論

肝癌的治療耐藥和Hippo 信號通路失調(diào)密切相關(guān)。Hippo 信號通路中主要效應(yīng)分子YAP/TAZ 屬于癌基因[2]。Hippo 信號通路的核心作用是失活主要效應(yīng)分子YAP/TAZ，阻斷增殖相關(guān)基因CylinDl、CTGF以及凋亡抑制基因Survivin、Bcl-2 的表達[3]。中藥作為防治腫瘤的重要組成部分，在輔助化療藥物增強功效、減輕副作用、降低耐藥性方面具有其獨特的優(yōu)勢[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能抑制人肝癌SMMC-7721 細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制其遷移能力，這與其抑制Wnt/β-catenin 信號通路，上調(diào)E-cad 蛋白、降低Vimentin 蛋白表達有關(guān)[5-6]。本項目前期體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞化療耐藥，影響細胞增殖、凋亡和細胞周期，其機制可能與干預(yù)Hippo 信號通路有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能抑制耐藥細胞株BEL-7402/5-FU 裸鼠移植瘤的生長，與5-Fu 合用高劑量組的抑瘤率最為明顯。與模型組比較，5-FU 組及其合用高、中、低劑量組的YAP 和TAZ mRNA 相對表達量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），而合用高劑量組的TAZ mRNA 相對表達量降低最為明顯（P＜0.01）。Western blot 結(jié)果顯示，各組腫瘤組織的CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 蛋白相對表達量均降低（P＜0.05，P＜0.01），而合用高劑量組的蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01）。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素可抑制各組耐藥細胞株BEL-7402/5-FU 裸鼠移植瘤的生長，降低YAP 和TAZ mRNA 的表達，降低腫瘤組織的CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 蛋白的表達，其機制可能與干預(yù)Hippo 信號通路有關(guān)。冬凌草甲素可能作為一種新的肝癌耐藥逆轉(zhuǎn)劑，具有一定的臨床應(yīng)用價值。