低溫風(fēng)干發(fā)酵羊腿中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的分離、篩選及鑒定

馬依努爾·米吉提，茹克葉木·阿不力米提，力俊琛，巴吐?tīng)枴ぐ⒉涣四?/p>

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

羊火腿是我國(guó)傳統(tǒng)的腌臘肉制品，羊后腿肉經(jīng)腌制、風(fēng)干、成熟而成，具有低脂肪、高蛋白的特點(diǎn)[1]。由于風(fēng)干成熟期較長(zhǎng)，羊火腿中的肌肉內(nèi)源酶會(huì)影響肌肉蛋白和脂肪產(chǎn)生大量的小分子多肽、游離氨基酸、游離脂肪酸等易被人體消化吸收的物質(zhì)，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。自然發(fā)酵肉制品中的優(yōu)良菌株被寶貴自然菌種資源利用[2]。傳統(tǒng)發(fā)酵香腸主要用原料肉本身帶有的微生物經(jīng)自然發(fā)酵而成，不僅不能保證發(fā)酵肉制品的穩(wěn)定性和安全性，而且發(fā)酵時(shí)間也較長(zhǎng)[3]。優(yōu)良發(fā)酵劑在發(fā)酵肉制品加工中起重要作用，發(fā)酵菌種能縮短發(fā)酵肉制品的發(fā)酵時(shí)間及生產(chǎn)周期[4]。研究顯示，分離和篩選優(yōu)良菌株作為發(fā)酵劑能保證產(chǎn)品品質(zhì)，并能減少有害物質(zhì)的形成[5]，已成為發(fā)酵劑的主要研究熱點(diǎn)。

近年來(lái)，對(duì)乳酸菌的研究集中于發(fā)酵泡菜、乳制品和發(fā)酵肉制品等食品領(lǐng)域[6]，其中發(fā)酵香腸在微生物的作用下，會(huì)發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，將食品原料轉(zhuǎn)化為具有獨(dú)特風(fēng)味，并且保質(zhì)期長(zhǎng)的發(fā)酵肉制品[7]。另外，乳酸菌可以有效減少食品中亞硝酸鹽殘留量[8]，改善感官品質(zhì)。李建等[9]從自然發(fā)酵香腸及泡菜水中分離出4 株優(yōu)良乳酸菌。Papamanoli 等[10]對(duì)發(fā)酵香腸中的乳桿菌的抑菌效果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)80 株乳酸菌均表現(xiàn)出對(duì)食品致病菌的有效抑制作用。沈清武[11]的研究結(jié)果表明，發(fā)酵劑與香腸質(zhì)構(gòu)特性有關(guān)聯(lián)，如戊糖乳桿菌能改善香腸的咀嚼性、硬度和黏聚性，還能提升發(fā)酵香腸的感官品質(zhì)。

本研究旨在從低溫風(fēng)干發(fā)酵羊腿中分離出適用于發(fā)酵香腸的優(yōu)良乳酸菌菌株，并檢測(cè)其產(chǎn)接觸酶、產(chǎn)氨、產(chǎn)黏液等發(fā)酵特性，以及48 h 產(chǎn)酸能力和不同條件（溫度、NaCl、NaNO2）下的生長(zhǎng)情況等加工特性，篩選出產(chǎn)酸快、發(fā)酵特性良好，保障香腸安全性的同時(shí)改善發(fā)酵香腸品質(zhì)的優(yōu)良乳酸菌菌株，以期為發(fā)酵香腸接種發(fā)酵提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)樣品

低溫風(fēng)干發(fā)酵羊腿：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室制作保存；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院提供，菌種保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院畜產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS 瓊脂培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；耐亞硝酸鹽培養(yǎng)基、耐鹽性培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基、產(chǎn)黏液培養(yǎng)基、產(chǎn)H2S 培養(yǎng)基、精氨酸產(chǎn)氨培養(yǎng)基、葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基、檢測(cè)過(guò)氧化氫酶培養(yǎng)基：參考凌代文等[12]的配制方法。

革蘭氏染色試劑盒、細(xì)菌基因組提取DNA 試劑盒、微量生化鑒定管、3%過(guò)氧化氫溶液、ddH2O，2×Taq PCR Green Mix、核酸染料、DNA Buffer：北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶K（≥500 U/mg）、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（100～2 000 bp）、溶菌酶（≥700 U/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；脫脂奶粉：紐瑞滋（上海）食品有限公司；氯化鈉、亞硝酸鈉、丙三醇（均為分析純）：天津市鑫鉑特化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DSX-30L-l 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；2720 thermal cycler 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；DYY-12 電泳儀：北京六一生物科技有限公司；LC-LX-HL210D 臺(tái)式離心機(jī)：湖南力辰儀器科技有限公司；DHP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH-4 水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MSD106 顯微鏡：邁時(shí)迪（東莞）科技有限公司；UV1800 分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C pH 測(cè)定儀：上海大譜儀器有限公司；DW-40L92 超低溫冰箱：青島海爾特種電器有限公司；Fine-doX2 凝膠成像系統(tǒng)：上海天呈科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

在無(wú)菌條件下，將低溫風(fēng)干發(fā)酵羊腿剪碎，稱取10 g 肉樣，轉(zhuǎn)移至90 mL 無(wú)菌生理鹽水中，振蕩均勻，并將稀釋度調(diào)為10-5g/mL，在MRS 瓊脂培養(yǎng)基中涂布均勻，于35 ℃厭氧環(huán)境中，培養(yǎng)24～48 h。挑選單菌落反復(fù)劃線分離[13]，直到獲得純菌株（鏡檢時(shí)全部菌落、菌體大小形狀均一致時(shí)判斷為已純化）。已純化的菌株采取革蘭氏染色、鏡檢后得到的陽(yáng)性菌株進(jìn)行斜面保藏并在最終濃度為50%的甘油中保存[14]。

1.3.2 菌株的初步篩選

將已純化的菌株接種于MRS 瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)48 h，選擇明顯溶鈣圈并革蘭氏染色為陽(yáng)性、生長(zhǎng)快的菌株[15]。

產(chǎn)黏性試驗(yàn)：直接挑取平板上的單菌落進(jìn)行觀察，篩選不產(chǎn)黏液的菌株[16]。

耐鹽、耐亞硝酸鹽試驗(yàn)：將發(fā)酵特性優(yōu)良的菌株接種于已添加6%、9%NaCl 及濃度150 mg/kg 亞硝酸鹽的液體培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)24 h 后用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm 處的吸光值[17]。

過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)：將培養(yǎng)24 h 后的菌液添加到含有5%過(guò)氧化氫的玻片上，記錄結(jié)果并篩選陰性（不產(chǎn)氣泡）菌株[18]。

葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)：葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基的接種物于35 ℃培養(yǎng)24 h，篩選陰性菌株。如倒放小試管內(nèi)有氣泡則為陽(yáng)性，未出現(xiàn)氣泡則為陰性[19]。

氨基酸脫羧酶試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種于添加賴氨酸、蘇氨酸等的培養(yǎng)基試管后，于35 ℃培養(yǎng)14～24 h，通過(guò)顏色特征判斷陰性、陽(yáng)性[20]。

產(chǎn)H2S、精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)：參照東秀珠等[21]的方法進(jìn)行。

1.3.3 菌株復(fù)篩試驗(yàn)

1.3.3.1 生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力的測(cè)定

將待測(cè)菌株接種于肉湯培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，每4 h 測(cè)定OD600值及pH 值。

1.3.3.2 不同溫度下菌株生長(zhǎng)能力將待測(cè)菌株接種于肉湯培養(yǎng)基，分別在10、20、30、35、45 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600值。

1.3.3.3 耐鹽、耐亞硝酸鹽試驗(yàn)

將待測(cè)菌株接種到含不同濃度（3%、6%、9%、12%、15%）的NaCl 及含有不同濃度（30、60、90、120、150 mg/kg）NaNO2的MRS 肉湯培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)其OD600值。

1.4 乳酸菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)特征

觀察菌落形狀，包括顏色、大小、透明度等，菌體形態(tài)采用革蘭氏染色鏡檢觀察[22]。

1.4.2 生理生化特征鑒定

將分離的菌株進(jìn)行糖醇發(fā)酵試驗(yàn)，檢驗(yàn)菌株對(duì)各種糖醇類碳源的利用情況，并記錄結(jié)果。

1.4.3 16S rDNA 遺傳學(xué)鑒定

1.4.3.1 擴(kuò)增引物

按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)細(xì)菌DNA 進(jìn)行提取，以提取DNA 基因組為PCR 擴(kuò)增模板，采用通用型引物[23][正向引物：（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 反向引物：（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）] 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Centerfor Biotechnology Information，NCBI） 基因庫(kù)中進(jìn)行同源性分析。

1.4.3.2 擴(kuò)增體系

上述制備的基因組DNA 作為PCR 擴(kuò)增模板，采用25 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增體系組成及用量如表1 所示。

表1 PCR 擴(kuò)增體系組成及用量Table 1 Composition of PCR system

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)做3 次平行，用Origin 8.0 軟件繪制數(shù)據(jù)圖，MEGA-X 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

通過(guò)稀釋分離平板法和劃線平板法，從低溫發(fā)酵風(fēng)干羊腿中分離出43 株形態(tài)不同的疑似菌株，其中篩選出革蘭氏染色陽(yáng)性桿菌、有明顯融鈣圈并接觸酶陰性菌31 株，初步判定為乳酸菌。乳酸菌主要發(fā)酵特性篩選結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 乳酸菌主要發(fā)酵特性篩選結(jié)果Table 2 Screening results of lactic acid bacteria based on main fermentation characteristics

如表2 所示，所得的31 株菌均能耐受6%NaCl，其中25 株菌能夠在含9% NaCl 的MRS 肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；培養(yǎng)24 h 后31 株菌pH 值均從6.25 下降至5.1以下；23 株菌不產(chǎn)生H2S；29 株菌在MRS 瓊脂培養(yǎng)基中無(wú)黏液；所有菌株均能在濃度為150 mg/kg 的亞硝酸鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；在葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)中，有16 株菌不產(chǎn)氣；精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)中19 株菌不產(chǎn)氨；26 株菌在氨基酸脫羧酶試驗(yàn)中結(jié)果呈陰性。篩選結(jié)果顯示，分離的31 株菌中6 株菌不能耐受9%NaCl，2 株菌產(chǎn)黏液，8 株菌產(chǎn)H2S，15 株菌葡萄糖產(chǎn)氣，19 株菌均無(wú)抑菌能力，12 株菌分解精氨酸產(chǎn)氨，5 株氨基酸脫羧酶陽(yáng)性，均被淘汰。經(jīng)過(guò)初篩，篩出5 株（GM09、GM23、GM28、PA15、KN02）發(fā)酵特性良好的優(yōu)良乳酸菌，進(jìn)一步篩選。

2.2 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線

乳酸菌的生長(zhǎng)曲線如圖1 所示。

圖1 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of lactic acid bacterial strains

由圖1 可知，篩選出的5 株菌均具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。乳酸菌KN02、GM09 和GM28 在MRS 肉湯培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速度快于其余菌株，5 株菌在生長(zhǎng)初期的0～8 h 內(nèi)菌株的OD 值變化不明顯，因乳酸菌接種于新環(huán)境，需要適應(yīng)培養(yǎng)的環(huán)境進(jìn)而導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢狀態(tài)，培養(yǎng)8 h 后細(xì)菌數(shù)上升趨勢(shì)明顯，菌體數(shù)量增加速度明顯加快，此時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期。其中GM23、PA15 在24 h 后開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，GM09、GM28、KN02 在培養(yǎng)32 h 左右進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.3 乳酸菌的產(chǎn)酸能力

乳酸菌在48 h 內(nèi)pH 值的變化見(jiàn)圖2。

圖2 乳酸菌在48 h 內(nèi)pH 值變化Fig.2 Changes in medium pH value of lactic acid bacteria within 48 h

由圖2 可知，5 株菌所處的培養(yǎng)基pH 值隨時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，培養(yǎng)48 h 時(shí)，GM09、GM23、GM28、PA15、KN02 所處培養(yǎng)基的pH 值分別為4.41、4.11、4.02、4.07、4.24。雖產(chǎn)酸速率存在差異，但5 株菌產(chǎn)酸能力均較強(qiáng)。結(jié)合生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力結(jié)果表明，5 株菌培養(yǎng)期迅速繁殖產(chǎn)生乳酸，進(jìn)而降低pH 值，為發(fā)酵和菌株生長(zhǎng)創(chuàng)造良好的條件。

2.4 不同溫度下乳酸菌的生長(zhǎng)情況

不同溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different temperatures on the growth of lactic acid bacteria

由圖3 可知，溫度為10～35 ℃時(shí)，菌株的生長(zhǎng)能力隨溫度的升高而增強(qiáng)。雖45 ℃時(shí)生長(zhǎng)趨勢(shì)逆向發(fā)展，但在45 ℃條件下的生長(zhǎng)情況基本良好；菌株在30 ℃和35 ℃條件下的生長(zhǎng)能力明顯強(qiáng)于其他溫度條件，且相比于其他3 株菌，30 ℃和35 ℃時(shí)GM09 和KN02 的生長(zhǎng)能力較強(qiáng)。

2.5 耐鹽性

不同NaCl 濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同NaCl 濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different NaCl concentrations on the growth of lactic acid bacteria

由圖4 可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl 濃度的增加，菌株的繁殖能力呈下降趨勢(shì)，且5 株菌的生長(zhǎng)抑制程度不同。在NaCl 濃度為3%、6%時(shí)，5 株乳酸菌生長(zhǎng)良好；當(dāng)NaCl 添加量達(dá)到15%時(shí)，菌株生長(zhǎng)能力最弱，NaCl 濃度為9%時(shí)，KN02、GM09 的生長(zhǎng)性能較佳。此外，NaCl 濃度為15%時(shí)，KN02 的生長(zhǎng)能力高于其他菌株，生長(zhǎng)性能最佳。

2.6 耐亞硝酸鹽性

不同NaNO2濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同NaNO2 濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different NaNO2 concentrations on the growth of lactic acid bacteria

由圖5 可知，隨著NaNO2濃度的增加，總體上菌株的繁殖能力呈下降趨勢(shì)，并且5 株菌的生長(zhǎng)能力受到不同程度的影響。當(dāng)NaNO2濃度為30、60 mg/kg 時(shí)，GM23生長(zhǎng)能力比其余菌株強(qiáng)；當(dāng)NaNO2濃度為150 mg/kg時(shí)，GM28 生長(zhǎng)能力比其余菌株弱。此外，GM09 在不同亞硝酸鹽濃度下的生長(zhǎng)能力相對(duì)較強(qiáng)。根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，亞硝酸鹽最大使用量為150 mg/kg。因此，在亞硝酸鹽鹽濃度150 mg/kg 的條件下，5 株菌均能生長(zhǎng)，表明5 株菌可作發(fā)酵香腸的發(fā)酵劑。

2.7 菌株的分類學(xué)鑒定結(jié)果

2.7.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

乳酸菌菌落形態(tài)特征見(jiàn)圖6。

圖6 乳酸菌菌落形態(tài)特征Fig.6 Colonies of lactic acid bacteria

由圖6 可知，乳酸菌在MRS 瓊脂培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24～48 h，菌落直徑大小有差異，KN02 和GM09 的菌落形態(tài)均呈白色圓形、不透明、形狀規(guī)則；PA15、GM23 及GM28 的菌落形態(tài)均呈乳白色，菌落表面光滑濕潤(rùn)、不透明、邊緣整齊。

乳酸菌菌體形態(tài)學(xué)特征見(jiàn)圖7。

圖7 乳酸菌菌體形態(tài)學(xué)特征（×1 000）Fig.7 Cell morphology of lactic acid bacteria（×1 000）

由圖7 可知，GM09 和GM28 菌株在顯微鏡下觀察時(shí)，細(xì)胞呈短桿狀，KN02、PA15 及GM23 的菌株細(xì)胞均為桿狀，5 株菌均為革蘭氏陽(yáng)性，其中GM09 和GM28 單個(gè)生長(zhǎng)，KN02、PA15 及GM23 菌株呈不規(guī)則堆狀排列。

2.7.2 菌株生理生化鑒定結(jié)果

參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》中乳桿菌屬鑒定所用的糖類，依據(jù)糖發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)酸時(shí)的變色情況以及菌株的表型特征，菌株鑒定結(jié)果如表3 所示。

表3 菌株鑒定結(jié)果Table 3 Results of strain identification

由表3 可知，初步鑒定菌株GM09 和PA15 為戊糖乳桿菌（Lactobacillus Pentosus），GM23、GM28、KN02為植物乳桿菌（Lactobacillus Plantarum）。

2.7.3 16S rDNA 序列同源性分析結(jié)果

2.7.3.1 PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)與序列測(cè)定結(jié)果

菌株16S rDNA 擴(kuò)增電泳圖見(jiàn)圖8。

圖8 菌株16S rDNA 擴(kuò)增電泳圖Fig.8 Electrophoresis of 16S rDNA amplification of strains

如圖8 所示，菌株GM09、GM23、GM28、PA15 及KN02 擴(kuò)增出的16S rDNA 片段大小均約為1 500 bp，條帶清晰且符合細(xì)菌16S rDNA 條帶長(zhǎng)度，經(jīng)測(cè)序得到長(zhǎng)度分別為1 478、1 476、1 476、1 483、1 482 bp。

2.7.3.2 16S rDNA 同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹

將菌株GM09、GM23、GM28、PA15、KN02 的16SrDNA序列與GenBank 中已知核酸序列進(jìn)行Blast 分析，用MEGA-X 軟件分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖9、圖10 所示。

圖9 乳酸菌菌株GM09、PA15 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Neighbour-joining tree of GM09 and PA15

圖10 乳酸菌菌株GM23、GM28、KN02 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Neighbour-joining tree of GM23，GM28，and KN02

由圖9、圖10 可知，菌株GM09 與L.pentosus OK-325938.1 相似性高達(dá)100%，PA15 與L.pentosus ON-329060.1 相似性達(dá)96%，因此將菌株GM09、PA15 鑒定為戊糖乳桿菌；KN02 與Lactobacillus plantarum MT463669.1 相似性高達(dá)100%，GM23 與L.plantarum MH885507.1 相似性達(dá)99% ，GM28 與L.plantarum KM485577.1 相似性達(dá)94%，因此將菌株GM23、GM28及KN02 鑒定為植物乳桿菌。

3 討論

發(fā)酵肉制品中分離得到的菌種，由于原料、配方及生產(chǎn)條件的不同，也存在很大的差異。篩選菌種不僅能提高和保證產(chǎn)品質(zhì)量，還能夠在性能及加工特性等方面超越自然發(fā)酵。

pH 值的下降使肉中蛋白質(zhì)凝結(jié)，對(duì)產(chǎn)品色澤的形成有加快作用，使發(fā)酵肉制品在常溫下的保質(zhì)期有所延長(zhǎng)，還能保證發(fā)酵肉制品的穩(wěn)定性[24]。Ammor 等[25]的研究表明，作為發(fā)酵劑的基本要求是乳酸菌在培養(yǎng)24 h 后，pH 值能降至5.2 以下。如果將有黏性的菌株添加到發(fā)酵肉制品中，會(huì)直接作用于產(chǎn)品形成濕潤(rùn)、光澤感較好的外觀形態(tài)和緊致的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)[26]；為了防止肉質(zhì)改變，選用過(guò)氧化氫陰性菌可以減少因氧化而導(dǎo)致的肉品質(zhì)量改變，從而改善產(chǎn)品的色澤和風(fēng)味。李珊珊等[27]的研究表明，發(fā)酵劑菌種產(chǎn)生H2S 和NH3等具有不良風(fēng)味氣體是影響產(chǎn)品品質(zhì)的另一重要因素。本試驗(yàn)結(jié)果表明，31 株菌株在培養(yǎng)24 h 后，pH 值均從6.25 下降至5.1 以下，而在代謝過(guò)程中產(chǎn)生H2S的8 株菌、分解精氨酸產(chǎn)氨的12 株菌、氨基酸脫羧酶陽(yáng)性的5 株菌、產(chǎn)黏液的2 株菌均不能作為肉品發(fā)酵劑。戴瑩等[28]的研究表明，氨基酸脫羧酶陰性乳酸菌作為肉類發(fā)酵劑培養(yǎng)物時(shí)，能有效減少香腸中生物胺的積累。如菌株具有氨基酸脫羧酶活性，會(huì)產(chǎn)生一些有害胺類物質(zhì)，如組胺、腐胺和酪胺等。因此，本試驗(yàn)中顯示氨基酸脫羧酶活性的5 株菌被淘汰。

選擇發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的重要因素是其具有耐鹽、耐亞硝酸鹽能力，且在較低鹽濃度情況下菌能夠生長(zhǎng)。但隨著加工過(guò)程中水分的減少，鹽的濃度逐漸增加，但較高的鹽濃度導(dǎo)致菌株不能正常生長(zhǎng)[29]。而對(duì)NaCl 耐受性較高的菌株則能夠在整個(gè)發(fā)酵和加工過(guò)程中具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。一般選擇能耐受2%～10%鹽濃度的菌株作為發(fā)酵劑。而亞硝酸鹽添加量在國(guó)標(biāo)中規(guī)定的最大添加量為150 mg/kg。結(jié)果表明，本試驗(yàn)選取的5 株乳酸菌對(duì)鹽和亞硝酸鹽的耐受性都很好。

目前常應(yīng)用的形態(tài)學(xué)和生理生化特征等分類鑒定方法仍存在耗時(shí)長(zhǎng)、周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、具有不確定性的缺點(diǎn)。為了保證鑒定結(jié)果的可靠性，將表型特征鑒定方法和16S rDNA 序列分析鑒定技術(shù)結(jié)合使用，使乳酸菌的分類鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確。本研究中GM09、GM23、GM28、PA15 和KN02 的16S rDNA 同源性分析與表型特征鑒定結(jié)果一致。

4 結(jié)論

從低溫發(fā)酵風(fēng)干羊腿中共分離出43 株菌，依據(jù)肉制品發(fā)酵劑的發(fā)酵特性，篩選出6 株菌不能耐受9%NaCl，2 株菌產(chǎn)黏液，8 株菌產(chǎn)H2S，15 株菌葡萄糖產(chǎn)氣，12 株菌分解精氨酸產(chǎn)氨，氨基酸脫羧酶陽(yáng)性5 株，均被淘汰。通過(guò)菌株的產(chǎn)酸能力、生長(zhǎng)曲線和耐高溫性等一系列指標(biāo)，最終篩選出GM09、GM23、GM28、PA15 和KN02，5 株菌發(fā)酵特性好，具有較強(qiáng)的抑菌和產(chǎn)酸能力及良好的生長(zhǎng)特性和耐受性。

經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和生理生化特征并結(jié)合16S rDNA 序列分析，鑒定GM09、PA15 為戊糖乳桿菌，GM23、GM28、KN02 為植物乳桿菌，為進(jìn)一步探討乳酸菌在發(fā)酵肉制品中的應(yīng)用提供參考。