明太魚膠原蛋白提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性

辛炫英，李美瑤，張雨嫣，胡竹子，陳子，王妍

（延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000）

明太魚，學(xué)名黃線狹鱈（Theragra chalcogramma），是鱈形目鱈科鱈屬。主要分布于朝鮮半島東岸、日本北部、韃靼海峽、白令海周緣、鄂霍次克海中部和阿拉斯加等[1]。隨著食品產(chǎn)業(yè)日益壯大，尤其是海洋產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展，人們開始重視海洋資源的綜合利用，對海洋魚類副產(chǎn)物加工提出了更高的要求，因此，魚類廢棄物的開發(fā)利用顯得越來越重要。明太魚是我國延邊朝鮮族自治州最受歡迎的食物之一，魚干產(chǎn)量大。但在明太魚加工過程中副產(chǎn)物資源浪費(fèi)嚴(yán)重，其中魚皮占比最高，總計(jì)每年約5 萬t 的魚皮被浪費(fèi)[2]。

相關(guān)研究表明，魚類副產(chǎn)品可被用作獲取膠原蛋白或膠原蛋白水解物的來源材料，以提高海洋生產(chǎn)鏈的價(jià)值。由于人們對膠原蛋白的潛在健康益處越來越感興趣，近年來，全球食品行業(yè)對膠原蛋白產(chǎn)品的需求正在增加，膠原蛋白帶來的健康益處，包括抗氧化作用、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制作用、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制作用和抗衰老活性等。這些促進(jìn)健康的特性與膠原蛋白密切相關(guān)[3-5]。目前研究表明，制備膠原蛋白主要有熱水浸提法、酸浸提取法、堿浸提取法、酶溶解提取法和鹽析溶解提取法等。其中酶溶解提取法目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于魚皮膠原蛋白的提取，常用的酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等[6-8]。在選擇酶法處理過程中，對溫度和pH 值等條件要求較高，因此本研究利用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定明太魚膠原蛋白提取最佳工藝，同時(shí)鑒定其基本性質(zhì)，最后初步研究其體外抗氧化作用，以期為解決明太魚副產(chǎn)物浪費(fèi)問題以及生產(chǎn)加工膠原蛋白系列產(chǎn)品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明太魚干皮：市售；胃蛋白酶（1 500 U/g）、番紅花紅、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS -PAGE）試劑盒、乙二胺四乙酸鐵鈉、冰乙酸、氫氧化鈉、正丁醇、氯化鈉、濃鹽酸、異硫氰酸苯酯、三乙胺、乙醇、醋酸鈉、正己烷、抗壞血酸、丁基羥基茴香醚：北京索萊寶科技有限公司。18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥97 %）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。除特殊標(biāo)記外，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RT 臺式高速冷凍離心機(jī)：中國天美科學(xué)儀器有限公司；ZTJZ-200S 均質(zhì)機(jī)：上海眾托實(shí)業(yè)有限公司；YK759CRT900 紫外分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技公司；IR Prestige-21 傅里葉變換紅外光譜儀：日本島津公司；ZTJZ-200S 均質(zhì)機(jī)：上海眾托實(shí)業(yè)有限公司；LC-20 Agilent1260 液相色譜儀：上海怡賽科學(xué)儀器有限公司；ZF-288 凝膠成像儀：上海金鵬分析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 膠原蛋白制備

參照王艷[9]的方法并加以改進(jìn)，取一定量的明太魚魚皮，去離子水除去皮上雜質(zhì)。將魚皮浸泡在含有0.02 mol/L NaOH 的7.5% NaCl 溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌，持續(xù)18 h，再使用10%正丁醇溶液對除去雜質(zhì)蛋白后的明太魚魚皮漂洗5 次，每次1 h。水沖至中性，烘干備用。隨后采用胃蛋白酶法提取膠原蛋白，將預(yù)處理好的魚皮剪碎，加入純水，料液比為1 ∶20（g/mL），加入1 500 U/g 胃蛋白酶，在45 ℃恒溫水浴鍋中水浴4 h 提取明太魚皮膠原蛋白。雜質(zhì)去除干凈后加入5%干皮質(zhì)量的活性炭和氯化鈣，以此來達(dá)到脫色除味的目的。在60 ℃恒溫水浴鍋中將混合液靜止沉淀20 min，收集上清液后，再用800 目濾布進(jìn)行過濾，將活性炭及雜質(zhì)去除。濾液與上清液合并，6 000 r/min 離心20 min，棄去沉淀。將純化的膠原蛋白溶液放在培養(yǎng)皿中。

1.3.2 膠原蛋白得率測定

膠原蛋白中存在一種特有氨基酸，為羥脯氨酸，通過測定羥脯氨酸含量可以得出膠原蛋白含量，方法參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》[10]。按公式（1）計(jì)算膠原蛋白得率。

式中：X1為膠原蛋白得率，%；M1為上清液羥脯氨酸含量，%；M2為魚皮羥脯氨酸含量，%。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以膠原蛋白得率為指標(biāo)，分別考察反應(yīng)時(shí)間、料液比、酶用量、反應(yīng)溫度4 個單因素對明太魚膠原蛋白得率的影響。各因素水平設(shè)置為反應(yīng)時(shí)間選擇2、3、4、5、6 h；料液比選擇1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）；酶用量選擇300、600、900、1 200、1 500、1 800 U/g；反應(yīng)溫度選擇25、30、35、40、45 ℃。各因素進(jìn)行5 次平行試驗(yàn)，取平均值。

1.3.4 膠原蛋白提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對膠原蛋白得率影響較大的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、酶用量作為試驗(yàn)因素，以膠原蛋白得率作為考察指標(biāo)，通過Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)，確定胃蛋白酶提取明太魚皮膠原蛋白的最佳工藝條件，響應(yīng)面優(yōu)化因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

1.3.5 膠原蛋白SDS-PAGE

將制備好的膠原蛋白溶解，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的膠原蛋白溶解液，以體積比3 ∶1 與緩沖液混合，沸水浴3 min，在120 V 的恒流下進(jìn)行電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)移電泳膠到快速染色液中處理染色，隨后脫色，凝膠成像儀觀察成像。

1.3.6 傅里葉紅外光譜法分析明太魚膠原蛋白

稱取一定質(zhì)量制備好的明太魚膠原蛋白，在傅里葉變換紅外光譜儀上掃描，波長范圍5 000～4 000 cm-1。

1.3.7 紫外光譜法分析明太魚膠原蛋白

稱取一定質(zhì)量制備好的膠原蛋白，用0.5 mol/L 乙酸溶液作溶劑，配成濃度為0.5 mg/mL 的膠原蛋白溶液，另一個空白組只加入0.5 mol/L 乙酸溶液。檢測波長為190～400 nm，采集速率為0.5 nm/s。

1.3.8 明太魚膠原蛋白中氨基酸的組分與含量測定

采用柱前衍生反相高效液相色譜法測定氨基酸的組分與含量。

1.3.8.1 色譜條件的確定

色譜柱：UG120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：0.1 mol/L 無水乙酸鈉∶乙腈=97 ∶3（體積比），混勻后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH 值至6.5；流動相B：乙腈∶水=80 ∶20（體積比）；運(yùn)行時(shí)間：0～45 min；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；樣品進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：254 nm。流動相洗脫程序見表2。

表2 流動相洗脫程序Table 2 Mobile phase elution procedure

1.3.8.2 明太魚膠原蛋白樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取明太魚膠原蛋白樣品1.0 g，用25 mL超純水溶解定容，超聲30 min 后在3 000 r/min 下離心10 min，取上清液備用。

1.3.8.3 衍生化試劑的制備

向0.834 mL 三乙胺中加入5.166 mL 乙腈，混勻，制備1.0 mol/L 三乙胺-乙腈溶液，備用。吸取0.072 mL的異硫氰酸苯酯，加入4.328 mL 乙腈，混勻，制備0.1 mol/L 異硫氰酸苯酯-乙腈溶液，備用。

1.3.8.4 溶液的衍生化

吸取明太魚膠原蛋白溶液及氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液200 μL。先加入100 μL 的0.1 mol/L 異硫氰酸苯酯-乙腈溶液，再加入100 μL 的1.0 mol/L 三乙胺-乙腈溶液，混合均勻后靜置1 h。加入正已烷400 μL，混勻后靜置10 min。取下層溶液，用微孔濾膜過濾，待進(jìn)樣。

1.3.8.5 氨基酸含量計(jì)算

將處理過的明太魚膠原蛋白樣品溶液進(jìn)行衍生化，微孔濾膜過濾，過濾后進(jìn)樣20 μL，得到樣品中各氨基酸峰面積圖譜，將峰面積積分值代入回歸方程，求得各氨基酸平均含量。

1.3.9 膠原蛋白抗氧化性測定

以維生素C（vitamin C，VC）、丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）為對照組，通過測定1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力及總還原能力探究其體外抗氧化作用。

1.3.9.1 膠原蛋白DPPH 自由基清除能力測定

取5 支比色管，加入3 mL 0.05 mmol/L 的DPPH溶液，再分別加入質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 mg/mL 的膠原蛋白溶液3 mL，搖勻，靜置30 min，517 nm 測定吸光度，將3 mL 無水乙醇和3 mL 梯度質(zhì)量濃度溶液混合均勻，于517 nm 測定吸光度，再將3 mL 無水乙醇和3 mL DPPH 溶液混合均勻，于517 nm 測定吸光度[11]。按公式（2）計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：X2為DPPH 自由基清除率，%；A1為樣品與DPPH 反應(yīng)后的吸光度；A2為樣品吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.9.2 膠原蛋白超氧陰離子自由基清除能力測定

膠原蛋白超氧陰離子自由基清除能力采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測定[12]。按公式（3）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

式中：X3為超氧陰離子自由基清除率，%；A1為空白組的吸光度；A2為樣品組的吸光度。

1.3.9.3 膠原蛋白羥自由基清除能力測定

取1 mL 磷酸緩沖液（0.025 mol/L、pH7.4），1 mL 40 μg/mL 番紅花紅，0.5 mL 膠原蛋白溶液，1 mL 3%過氧化氫（新鮮配制），1 mL 0.945 mmol/L 乙二胺四乙酸鐵鈉（新鮮配制），混合后反應(yīng)30 min 于37 ℃水浴處理，并測定520 nm 處吸光度?？瞻捉M使用0.5 mL 蒸餾水，對照組使用1.5 mL 蒸餾水，按公式（4）計(jì)算羥自由基清除率[13]。

式中：X4為羥自由基清除率，%；A1為樣品組的吸光度；A0為空白組的吸光度；A2為對照組的吸光度。

1.3.9.4 膠原蛋白還原能力測定

取一定濃度的樣品，加入2.5 mL pH6.6 的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和2.5 mL 體積分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50 ℃保溫20 min 后加入2.5 mL10%的三氯乙酸，混合后以3 000 r/min 離心10 min。取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL 和0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3，在700 nm 波長處測定的吸光度表示樣品還原能力[14-15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Prism 9 和Design-Expert 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

酶用量、反應(yīng)溫度、料液比、反應(yīng)時(shí)間對膠原蛋白得率的影響見圖1。

圖1 各因素對膠原蛋白得率的影響Fig.1 Effect of each factor on collagen extraction rate

由圖1 可知，明太魚膠原蛋白得率隨酶用量增加呈先升高后降低的趨勢，在酶用量為1 500 U/g 時(shí)，膠原蛋白得率最佳，但隨著酶用量進(jìn)一步增加，膠原蛋白得率下降，結(jié)果與甘文梅等[16]的研究結(jié)果一致，原因可能是過量的酶會抑制酶解作用，從而導(dǎo)致酶用量過高，得率下降。明太魚膠原蛋白得率隨反應(yīng)溫度升高出現(xiàn)了先升高后下降的趨勢，在反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，膠原蛋白得率最佳。王錫念等[17]的研究表明酶法提取膠原蛋白最適溫度為35～45 ℃，與該試驗(yàn)結(jié)果相同，原因可能是溫度過高，酶處于非最適溫度，酶活性受到抑制，導(dǎo)致得率下降。明太魚膠原蛋白得率隨溶劑體積增加出現(xiàn)了先增長后下降的趨勢，在料液比為1 ∶20（mg/L）時(shí)，膠原蛋白得率最佳，但隨著溶劑體積進(jìn)一步增加，膠原蛋白得率逐漸下降，原因可能是溶劑體積過大會導(dǎo)致膠原蛋白分離困難。孫培利等[18]在提取牦牛蹄筋膠原蛋白中同樣發(fā)現(xiàn)溶劑體積過高會導(dǎo)致得率下降。明太魚膠原蛋白得率隨反應(yīng)時(shí)間延長呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，反應(yīng)時(shí)間為4 h 時(shí)，膠原蛋白得率最佳，但隨著反應(yīng)時(shí)間延長膠原蛋白得率逐漸下降，可能原因是反應(yīng)時(shí)間過長胃蛋白酶會部分水解，從而影響膠原蛋白提取，該結(jié)果與鄭平安等[19]的研究結(jié)果一致。因此，反應(yīng)時(shí)間、酶用量、反應(yīng)溫度分別選擇3～5 h、1 200～1 800 U/g、35～45 ℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶用量（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）3 個影響較顯著的因素為自變量，以膠原蛋白得率（Y）為響應(yīng)因子，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，回歸模型的方差分析結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and values of Box-Behnken experiments

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model

對表3 中17 組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合回歸分析，得到酶用量（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）對膠原蛋白得率（Y）影響的多元二次回歸方程：Y=0.43+0.015A+5.754×10-3B-0.012C-0.032AB+0.040AC-4.71×10-3BC-0.066A2-0.012B2-0.052C2?；貧w模型P＜0.01，差異極顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，表示模型對試驗(yàn)的擬合度較高。分析得到?jīng)Q定系數(shù)R2=0.952 1，說明響應(yīng)值的變化有95.21%（＞90%） 來源于所選的3 個變量。說明該模型可很好地解釋95.21%的膠原蛋白得率的變化，各因素間線性相關(guān)好，試驗(yàn)誤差小，可以采用該模型對不同條件下明太魚皮膠原蛋白的提取進(jìn)行預(yù)測和分析。由表4 可知，各因素對膠原蛋白得率影響程度順序?yàn)锳（酶用量）＞C（反應(yīng)溫度）＞B（反應(yīng)時(shí)間）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對響應(yīng)值的影響見圖2。

圖2 各因素對膠原蛋白得率的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface and contour plot of each factor on collagen extraction rate

由圖2 可知，AC 的響應(yīng)面坡面較陡，說明酶用量和反應(yīng)溫度的交互作用對膠原蛋白得率影響較大。經(jīng)過軟件分析得到明太魚皮膠原蛋白的最優(yōu)提取工藝條件為酶用量1 508.65 U/g、反應(yīng)溫度41.11 ℃、反應(yīng)時(shí)間3.89 h 時(shí)，理論膠原蛋白得率為49.98%。同時(shí)結(jié)合實(shí)際工藝操作，將參數(shù)優(yōu)化為酶用量1 500 U/g、反應(yīng)溫度為41 ℃、反應(yīng)時(shí)間3.9 h，上述工藝參數(shù)做3 次平行試驗(yàn)，此時(shí)實(shí)際膠原蛋白得率為48.90%，與理論值接近，驗(yàn)證了該模型具有可行性與準(zhǔn)確性，可以通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出工藝參數(shù)。

2.3 SDS-PAGE 凝膠電泳

膠原蛋白SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果見圖3。

圖3 明太魚膠原蛋白SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE profile of Theragra chalcogramma collagen

由圖3 可知，本試驗(yàn)提取的膠原蛋白分子量在110～130 kDa 之間，經(jīng)對比為α 鏈，與Ⅰ型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品表現(xiàn)一致。大多數(shù)的真骨魚類真皮的膠原蛋白含有其他脊椎動物所沒有的第3 條α 鏈，它是由3 條不同α鏈形成的單個α1（I）、α2（I）、α3（I）雜鏈。在同一條件下，α3 鏈和α1 鏈的化學(xué)性質(zhì)相似，電泳遷移位置相同，因此從圖譜上不能推斷出是否含α3 鏈。亞基α1、α2 的分子量均在100 kDa 以上。

2.4 明太魚膠原蛋白傅里葉紅外光譜

明太魚膠原蛋白傅里葉紅外光譜圖見圖4。

圖4 明太魚膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy of Theragra chalcogramma collagen

由圖4 可知，本試驗(yàn)提取得到的膠原蛋白含有酰胺的5 個主要膠原蛋白特征吸收峰A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。本試驗(yàn)提取的膠原蛋白特征吸收峰波數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)品對比差異甚小。在3 300 cm-1附近有吸收峰，說明兩種膠原蛋白中均存在氫鍵；分子中CH2基團(tuán)的不對稱伸縮振動產(chǎn)生了酰胺B，說明本試驗(yàn)提取的膠原蛋白的三級結(jié)構(gòu)保留完整。C═O 伸縮振動造成酰胺I 譜帶的存在，其特征吸收頻率波數(shù)一般在1 690～1 625 cm-1，酰胺Ⅱ是由具有雙鍵性質(zhì)的異相N—H 面內(nèi)彎曲振動和C—N 伸縮振動共同產(chǎn)生的。酰胺Ⅲ是由C—N 伸縮和N—H 彎曲引起的，其頻率波數(shù)范圍為1 400～1 200 cm-1，與其他蛋白質(zhì)的膠原紅外光譜不同，是Ⅰ型膠原蛋白特有的吸收。綜上，本試驗(yàn)提取的膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)保留完整。

2.5 明太魚膠原蛋白紫外吸收光譜分析

提取的明太魚膠原蛋白紫外吸收光譜圖見圖5。

圖5 膠原蛋白紫外吸收光譜圖Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of collagen

紫外吸收光譜是蛋白質(zhì)分子各種紫外生色基團(tuán)加入的結(jié)果，是判斷膠原蛋白類型的一個重要標(biāo)志。其中I 型膠原蛋白在235 nm 附近會出現(xiàn)最大吸收峰，是膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰。另外值得注意的是色氨酸含有苯環(huán)共輒雙鍵，在280 nm 的紫外吸收最強(qiáng)。由圖5 所示，本試驗(yàn)制得的膠原蛋白在280 nm處沒有強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)說明制備的膠原蛋白幾乎不含色氨酸或含量很低，同時(shí)本試驗(yàn)制得的膠原蛋白在235 nm 附近有明顯的吸收峰，符合I 型膠原蛋白的紫外吸收。

2.6 明太魚膠原蛋白中氨基酸的組分與含量

明太魚膠原蛋白氨基酸的組分與含量見表5。

表5 明太魚膠原蛋白中各氨基酸的含量Table 5 Contents of amino acids in Theragra chalcogramma collagen

從表5 中可以看出，明太魚膠原蛋白中含有人體必需氨基酸在內(nèi)的17 種氨基酸，但未檢測出色氨酸，其中含量較高的有甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和組氨酸。綜上，經(jīng)本試驗(yàn)優(yōu)化工藝提取的膠原蛋白氨基酸組分與含量豐富，可滿足人體健康需要。

2.7 體外抗氧化作用

2.7.1 DPPH 自由基清除能力

不同抗氧化劑對DPPH 自由基的清除能力見圖6。

圖6 膠原蛋白對DPPH 自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of collagen to DPPH free radicals

由圖6 可知，DPPH 自由基清除率均隨抗氧化劑濃度的增加而增大。膠原蛋白與BHA 的IC50值分別為2.69 mg/mL 和6.82 mg/mL。因此可知膠原蛋白具有一定的DPPH 自由基清除能力。

2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力

不同抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除能力見圖7。

圖7 膠原蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of collagen to superoxide anion free radicals

在生物有機(jī)體代謝過程中，超氧陰離子是一種具有很強(qiáng)氧化能力的自由基，所以通過測定它們的清除效能來表示抗氧化劑的作用[20-21]。由圖7 可知，對超氧陰離子自由基的清除率隨抗氧化劑濃度的增加而增大。膠原蛋白和BHA 對于清除超氧陰離子自由基的IC50值分別為4.42 mg/mL 和8.13 mg/mL。濃度相同時(shí)，對超氧陰離子自由基清除能力順序?yàn)閂C＞膠原蛋白＞BHA。因此可知膠原蛋白具有較好的超氧陰離子自由基清除能力。

2.7.3 羥自由基清除能力

圖8 為不同濃度VC、膠原蛋白和BHA 對羥自由基的清除能力。

圖8 膠原蛋白對羥自由基清除能力測定Fig.8 Scavenging ability of collagen to hydroxyl free radicals

羥自由基是在生物需氧代謝過程中產(chǎn)生的較強(qiáng)的氧自由基，所以通過測定羥自由基的清除能力，對抗氧化性的強(qiáng)弱進(jìn)行分析[22-23]。由圖8 可知，隨抗氧化劑濃度的增加，羥自由基清除能力增大，濃度相同時(shí)，羥自由基清除能力順序?yàn)閂C＞膠原蛋白＞BHA。其中膠原蛋白和BHA 對于清除羥自由基的IC50值分別為3.89 mg/mL 和5.32 mg/mL。而且當(dāng)濃度相同時(shí)，明太魚膠原蛋白羥自由基的清除效果好于BHA，所以明太魚膠原蛋白是一種良好的羥自由基清除劑。

2.7.4 總還原能力

不同抗氧化劑對鐵離子的還原能力見圖9。

圖9 膠原蛋白的還原能力測定Fig.9 Reducing ability of collagen

在酸性條件下，抗氧化劑將Fe3+還原成Fe2+，以Fe2+的量或者相對于標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑的能力來表示抗氧化活性[24]。由圖9 可知，濃度相同時(shí)，樣品還原能力順序?yàn)閂C＞膠原蛋白＞BHA。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際工藝最終得出明太魚皮膠原蛋白的最優(yōu)提取工藝為酶用量1 500 U/g、反應(yīng)溫度為41 ℃、反應(yīng)時(shí)間3.9 h，優(yōu)化后的工藝實(shí)際膠原蛋白得率為48.90%，接近理論值，驗(yàn)證了該模型具有可行性與準(zhǔn)確性。經(jīng)SDS-PAGE鑒定本試驗(yàn)提取的膠原蛋白分子量為110～130 kDa，傅里葉紅外光譜掃描結(jié)果可知本試驗(yàn)制備出的膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)保留完整，同時(shí)在紅外光譜中還含有酰胺的5 個主要膠原蛋白特征吸收峰A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ；利用紫外光譜技術(shù)分析可知本試驗(yàn)所制備的膠原蛋白具有明顯符合Ⅰ型膠原蛋白的紫外吸收峰（235 nm附近），同時(shí)采用了RP-HPLC 法測定明太魚膠原蛋白中氨基酸的組成與含量，結(jié)果表明明太魚膠原蛋白中含有除色氨酸在外的17 種氨基酸，其中甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和組氨酸含量豐富，表明經(jīng)工藝優(yōu)化后提取的膠原蛋白營養(yǎng)豐富，滿足人體健康需要。最后通過體外抗氧化試驗(yàn)得出，明太魚膠原蛋白對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為2.69、3.89、4.42 mg/mL，相比于BHA 具有較強(qiáng)抗氧化作用。綜上，本研究高效提取了明太魚膠原蛋白，確定了最佳提取工藝，明確了其體外抗氧化作用，提高了明太魚副產(chǎn)品的附加價(jià)值，為副產(chǎn)物的綜合利用提供了思路。