山藥硒多糖對鎘暴露小鼠鎘蓄積和氧化應(yīng)激的緩解作用

劉敏，張嵐，王丹，王長文，2*

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132000；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院 慢病防治科研實驗中心，吉林 吉林 132000）

鎘（Cd）是一種有毒重金屬，主要通過受污染的食物、水和職業(yè)暴露等途徑進(jìn)入人體，并對肝臟、腎臟、腦、骨骼和肺等多種器官造成損害。許多研究已表明，Cd 暴露會導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、肝纖維化和肝功能損害[1-2]。此外，Cd 被國際癌癥研究機構(gòu)認(rèn)定為人類致癌物，許多證據(jù)充分證明其對人類具有致癌性，包括促進(jìn)肺癌和腎癌[3]。Cd 暴露還會增加骨折和骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險[4]。研究表明，慢性Cd 暴露與心力衰竭和動脈粥樣硬化疾病的風(fēng)險增加有關(guān)，包括冠狀動脈疾病、外周動脈疾病[5]。因此，降低Cd 對機體健康帶來的毒副作用至關(guān)重要。

山藥學(xué)名薯蕷（Dioscorea opposita），為薯科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）植物山藥的塊莖，主要分布于非洲、亞洲、南美洲部分地區(qū)、加勒比海地區(qū)和南太平洋島嶼[6]。山藥是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，所含生物活性成分復(fù)雜，其中非淀粉多糖是山藥水提物中的主要成分，具有降血糖、抗腫瘤、保護心肌細(xì)胞和抗氧化等生物活性[7-8]，因此越來越受到關(guān)注。硒是人體內(nèi)重要的微量元素之一，由于其具有提高機體免疫能力、抗腫瘤、緩解體內(nèi)重金屬蓄積、抗衰老和防止心腦血管疾病等重要的生理功能，也已成為近年來的研究熱點。近年來研究發(fā)現(xiàn)，通過硒化修飾多糖獲得硒多糖，不僅未改變多糖的生物活性，還提高機體對硒的利用率以及硒多糖的抗氧化活性和抗腫瘤活性的生物活性[6，9]。此外，研究表明，硒多糖可以提高機體抗氧化酶活性，清除體內(nèi)的氧自由基[10-11]。然而，當(dāng)前關(guān)于硒多糖緩解Cd 毒性的研究鮮見。因此，本試驗以染鎘小鼠為模型，探討山藥硒多糖（Chinese yam selenium polysaccharide，SeY）緩解Cd 誘導(dǎo)小鼠Cd 蓄積以及氧化應(yīng)激的作用，以期為山藥硒多糖在緩解重金屬中毒的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氯化鎘（CdCl2）（純度＞99.7%）：長春夢怡美有限公司；山藥多糖（純度≥97%）：吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心實驗室制備并純化；鹽酸、硝酸、醋酸、亞硒酸鈉、硫酸、抗壞血酸（均為分析純）：昊迪化學(xué)試劑經(jīng)銷有限責(zé)任公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase medicine，ALP）檢測試劑盒：南京建成生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）檢測試劑盒、過氧化物酶（catalase，CAT） 檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒：上海生工生物有限公司。

1.2 主要儀器

原子吸收分光光度計（AA-6880）：日本島津公司；全波長酶標(biāo)儀（Spectramax 384 plus）：美國Molecular Devices 公司；低速冷凍離心機（KDC-2046 型）：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；紫外分光光度計（UV756 型）：上海第三分析儀器廠。

1.3 實驗動物

100 只8 周齡成年C57BL/6 雄性小鼠（25～30 g）：長春長生生物科技有限責(zé)任公司，許可證號為SYXK（吉）2017-0009。實驗小鼠在實驗動物飼養(yǎng)室進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境為（22±2）℃，濕度為（55±5）%。飼喂1 周后用于進(jìn)一步實驗。

1.4 試驗方法

1.4.1 山藥硒多糖的制備

山藥硒多糖制備方法為HNO3-Na2SeO3法，具體操作：將山藥多糖用50 mL 5% HNO3溶液溶解并加入三口燒瓶中，隨后加入等質(zhì)量的亞硒酸鈉，水浴加熱至70 ℃，并加入0.5 g BaCl2催化劑，反應(yīng)8 h。待反應(yīng)完成時冷卻降至室溫，并滴加1 mol/L 硫酸溶液至Ba2+完全沉淀，8 000 r/min 離心10 min。反應(yīng)液用無水Na2CO3調(diào)節(jié)pH 值至5～6，8 000 r/min 離心10 min，透析袋中用流水透析48 h 以上，直至用抗壞血酸檢測透析液不再變紅為止，醇沉、離心、干燥、稱重。并使用原子吸收分光光度計測定山藥硒多糖中硒含量和苯酚-硫酸法測定其多糖含量。

1.4.2 試驗設(shè)計及樣品采集

將100 只成年C57BL/6 雄性小鼠隨機分成5 組，每組20 只。分別為對照組（CK 組），氯化鎘處理組（Cd組），山藥硒多糖低（L-SeY）、中（M-SeY）、高劑量組（H-SeY）。CK 組小鼠飲用普通蒸餾水，Cd 組和山藥硒多糖組小鼠飲用含CdCl2的蒸餾水（20 mg/L）。山藥硒多糖給藥方式為灌胃給藥，其中CK 組和Cd 組小鼠灌胃生理鹽水，L-SeY 組、M-SeY 組和H-SeY 組分別灌胃200、500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的山藥硒多糖。實驗持續(xù)6 周，每天記錄小鼠采食量和飲水量，每周對小鼠進(jìn)行稱重。實驗期間各組小鼠自由采食飲水。實驗結(jié)束前24 h，對各組小鼠禁食不禁水，使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，并收集小鼠血液、肝臟、腎臟、小腸、大腦和心臟樣品用于后續(xù)實驗。并對肝臟、腎臟、大腦和心臟樣品進(jìn)行稱重，用于計算各臟器指數(shù)。本研究中的所有實驗方案均經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院動物委員會批準(zhǔn)。

1.4.3 小鼠血液及組織中鎘濃度的測定

使用原子吸收分光光度測定小鼠血液和肝臟、腎臟、小腸、大腦和心臟中Cd 濃度，具體參考Wan 等[12]的方法。

1.4.4 小鼠肝功能指標(biāo)的測定

將收集的小鼠血液使用離心機3 000 r/min 離心10 min，取血清。并使用試劑盒對小鼠ALT、AST、LDH 及ALP 活性進(jìn)行測定，具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.4.5 小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

處死小鼠后，立即切除肝組織，并在冰冷的磷酸鈉鹽緩沖液（0.1 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH7.4）中使用超聲波處理器進(jìn)行組織勻漿。將組織勻漿在4 ℃下，3 500 r/min 離心10 min，收集上清液。使用試劑盒對小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、GR、CAT 活性和MDA 含量進(jìn)行測定，參考試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗數(shù)據(jù)使用Excel2010 和SPSS 22.0 進(jìn)行方差分析，使用Duncan 法進(jìn)行多重比較，并使用GraphPad Prism 7.0 制圖，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥硒多糖的得率、糖含量和硒含量

按照1.4.1 制備方法共制備合成20 批山藥硒多糖，其中山藥硒多糖平均得率為（48.24±1.16）%，硒平均含量為3.97 mg/g，多糖平均含量為52.37%。

2.2 山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠體質(zhì)量的影響

山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠體質(zhì)量的影響見圖1。

圖1 山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 The effect of Chinese yam selenium polysaccharide on the body weight of Cd-exposed mice

實驗期間，各組小鼠活動無異常，且無小鼠死亡，各組小鼠采食量和飲水量之間無明顯差異。由圖1 可知，隨著Cd 暴露時間的延長，Cd 組小鼠體質(zhì)量逐漸降低，并低于其他處理組，且H-SeY 組和M-SeY 組小鼠體質(zhì)量在第6 周時高于L-SeY 組小鼠。

2.3 山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠不同組織中Cd 蓄積的影響

山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠不同組織中Cd 蓄積的影響見圖2。

圖2 山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠不同組織中Cd 蓄積的影響Fig.2 Effects of Chinese yam selenium polysaccharide on Cd accumulation in different tissues of Cd-exposed mice

由圖2 可知，在Cd 組中，Cd 在小鼠各組織的蓄積情況排序為腎臟（47.55 μg/g）＞肝臟（23.15 μg/g）＞心臟（13.26 μg/g）＞小腸（9.31 μg/g）＞大腦（0.07 μg/g），血液中Cd 含量為5.17 μg/L。與Cd 組相比，M-SeY 組和H-SeY 組小鼠血液、腎臟、肝臟、小腸和心臟中的Cd含量顯著降低（P<0.05）；而L-SeY 組和Cd 組差異不顯著（P＞0.05）。此外，除CK 組外，各組小鼠大腦中Cd含量無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠臟器指數(shù)的影響

山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠臟器指數(shù)的影響見表1。

由表1 可知，與CK 組相比，Cd 組小鼠肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與Cd 組相比，M-SeY 組和H-SeY 組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。此外，各組小鼠在腎臟指數(shù)、心臟指數(shù)和大腦指數(shù)間無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠氧化應(yīng)激的影響

山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠氧化應(yīng)激的影響見圖3和圖4。

圖3 山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠血清中AST、ALT、LDH 和ALP水平的影響Fig.3 Effects of Chinese yam selenium polysaccharide on serum levels of AST，ALT，LDH and ALP in Cd-exposed mice

圖4 山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT、GR 和MDA 水平的影響Fig.4 Effects of Chinese yam selenium polysaccharide on the levels of SOD，GSH-Px，CAT，GR and MDA in the liver of Cdexposed mice

由圖3 可知，Cd 暴露顯著提高了小鼠血清中AST、ALT、LDH 和ALP 水平（P<0.05）。山藥硒多糖（M-SeY組和H-SeY 組）顯著降低了小鼠血清中AST、ALT、LDH 和ALP 水平（P<0.05）。然而，L-SeY 組小鼠血清中AST 和ALT 含量與Cd 組間無差異顯著性（P>0.05）。由圖4 可知，與CK 組相比，Cd 暴露小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT 和GR 水平顯著降低，而MDA 水平顯著升高（P<0.05）。與Cd 組相比，山藥硒多糖組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT 和GR 水平顯著升高，而MDA水平顯著降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。

3 討論

Cd 進(jìn)入機體后，首先在血液中分布，隨后隨血液循環(huán)不斷進(jìn)入肝臟和腎臟等器官。Cd 進(jìn)入肝臟后會不斷誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成分泌金屬硫蛋白（metallothionein，MT），并與MT 結(jié)合形成Cd-MT 復(fù)合物運輸至腎臟，在腎小管溶酶體的作用下Cd-MT 復(fù)合物中游離出Cd2+，從而在腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)揮毒性[13]。Cd 進(jìn)入機體后會在機體內(nèi)器官內(nèi)蓄積，引起器官氧化損傷。Cd在機體內(nèi)不同器官的蓄積情況不同，并且Cd 在機體器官內(nèi)的蓄積與Cd 暴露的濃度和方式等有關(guān)。當(dāng)前的結(jié)果表明，Cd 進(jìn)入體內(nèi)后主要在腎臟和肝臟蓄積。此外，心臟中較高的Cd 含量可能與Cd 進(jìn)入體內(nèi)后通過血液循環(huán)進(jìn)入肝臟的過程有關(guān)。本文結(jié)果還顯示，對小鼠灌胃山藥硒多糖可降低Cd 在小鼠器官中的蓄積。與Cd 組小鼠相比，山藥硒多糖組小鼠腎臟、肝臟、心臟、小腸和血液中Cd 含量顯著降低，并且還呈現(xiàn)出劑量依賴性。

當(dāng)動物受到重金屬的危害時，重金屬會引起機體器官的損傷，相應(yīng)的臟器指數(shù)也隨著變化[14]。李光先[13]研究表明，對小鼠Cd 暴露后，小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)升高。藍(lán)田豐等[15]的研究也表明，小鼠Cd 暴露后，其肝臟指數(shù)和睪丸指數(shù)顯著升高。本研究結(jié)果顯示，Cd暴露后，小鼠的肝臟指數(shù)顯著升高。Cd 暴露還會導(dǎo)致脂肪肝和急性肝炎的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致肝臟指數(shù)升高。當(dāng)對Cd 暴露小鼠進(jìn)行山藥硒多糖灌胃后，小鼠的肝臟指數(shù)逐漸降低。推測這與山藥硒多糖的抗氧化活性有關(guān)，其提高了肝臟的抗氧化能力，緩解了因Cd 暴露導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

ALT 和AST 是評價機體肝損傷的重要指標(biāo)，其中，血清中ALT 和AST 活性增高表明肝臟線粒體被破壞，細(xì)胞膜通透性增加，ALT 和AST 被釋放到肝臟中[16]。此外，LDH 和ALP 也是反映肝功能正常與否的重要指標(biāo)。在本文中，Cd 暴露后，小鼠血清中AST、ALT、LDH和ALP 水平顯著升高，表明小鼠出現(xiàn)肝損傷。而對小鼠進(jìn)行山藥硒多糖灌胃后，小鼠血清中AST、ALT、LDH和ALP 水平顯著降低，表明山藥硒多糖緩解了Cd 暴露導(dǎo)致的小鼠肝功能異常。此外，Cd 暴露還會導(dǎo)致機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激的特征是產(chǎn)生自由基，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞膜的破壞[17]。研究表明，鎘暴露會降低細(xì)胞內(nèi)GSH 的含量以及細(xì)胞內(nèi)SOD、過氧化物酶和CAT 活性，從而導(dǎo)致氧自由基積累和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的增加[18]。自由基的產(chǎn)生及其相關(guān)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是鎘誘導(dǎo)毒性的主要機制之一[19-20]。Yang 等[21]研究指出，Cd 暴露后小鼠肝臟中SOD、GST、GSH、CAT 和GR 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高。本研究結(jié)果也表明，Cd 暴露顯著降低了小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT 和GR 水平，顯著提高了MDA 含量。然而，山藥硒多糖的治療緩解了Cd 暴露導(dǎo)致的小鼠肝臟氧化應(yīng)激（SOD、GSH -Px、CAT 和GR 水平升高，MDA 水平降低），且呈現(xiàn)劑量依賴性。這表明山藥硒多糖可通過提高Cd 暴露小鼠抗氧化酶活性來緩解Cd 暴露導(dǎo)致的小鼠氧化應(yīng)激和肝損傷。

4 結(jié)論

本研究旨在探究山藥硒多糖對Cd 暴露小鼠鎘蓄積和氧化應(yīng)激的緩解作用。本實驗結(jié)果表明，山藥硒多糖能夠降低Cd 在小鼠各組織中的蓄積，并通過提高肝臟抗氧化酶活性來改善Cd 毒性引起的小鼠氧化應(yīng)激和肝損傷。但關(guān)于山藥硒多糖降低Cd 在小鼠體內(nèi)的蓄積以及緩解氧化應(yīng)激的具體機制還需進(jìn)一步探究。