山藥硒多糖對(duì)鎘暴露小鼠鎘蓄積和氧化應(yīng)激的緩解作用

劉敏，張嵐，王丹，王長(zhǎng)文，2*

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132000；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院 慢病防治科研實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 132000）

鎘（Cd）是一種有毒重金屬，主要通過(guò)受污染的食物、水和職業(yè)暴露等途徑進(jìn)入人體，并對(duì)肝臟、腎臟、腦、骨骼和肺等多種器官造成損害。許多研究已表明，Cd 暴露會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、肝纖維化和肝功能損害[1-2]。此外，Cd 被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為人類致癌物，許多證據(jù)充分證明其對(duì)人類具有致癌性，包括促進(jìn)肺癌和腎癌[3]。Cd 暴露還會(huì)增加骨折和骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)[4]。研究表明，慢性Cd 暴露與心力衰竭和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，包括冠狀動(dòng)脈疾病、外周動(dòng)脈疾病[5]。因此，降低Cd 對(duì)機(jī)體健康帶來(lái)的毒副作用至關(guān)重要。

山藥學(xué)名薯蕷（Dioscorea opposita），為薯科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）植物山藥的塊莖，主要分布于非洲、亞洲、南美洲部分地區(qū)、加勒比海地區(qū)和南太平洋島嶼[6]。山藥是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物，所含生物活性成分復(fù)雜，其中非淀粉多糖是山藥水提物中的主要成分，具有降血糖、抗腫瘤、保護(hù)心肌細(xì)胞和抗氧化等生物活性[7-8]，因此越來(lái)越受到關(guān)注。硒是人體內(nèi)重要的微量元素之一，由于其具有提高機(jī)體免疫能力、抗腫瘤、緩解體內(nèi)重金屬蓄積、抗衰老和防止心腦血管疾病等重要的生理功能，也已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)硒化修飾多糖獲得硒多糖，不僅未改變多糖的生物活性，還提高機(jī)體對(duì)硒的利用率以及硒多糖的抗氧化活性和抗腫瘤活性的生物活性[6，9]。此外，研究表明，硒多糖可以提高機(jī)體抗氧化酶活性，清除體內(nèi)的氧自由基[10-11]。然而，當(dāng)前關(guān)于硒多糖緩解Cd 毒性的研究鮮見(jiàn)。因此，本試驗(yàn)以染鎘小鼠為模型，探討山藥硒多糖（Chinese yam selenium polysaccharide，SeY）緩解Cd 誘導(dǎo)小鼠Cd 蓄積以及氧化應(yīng)激的作用，以期為山藥硒多糖在緩解重金屬中毒的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氯化鎘（CdCl2）（純度＞99.7%）：長(zhǎng)春夢(mèng)怡美有限公司；山藥多糖（純度≥97%）：吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室制備并純化；鹽酸、硝酸、醋酸、亞硒酸鈉、硫酸、抗壞血酸（均為分析純）：昊迪化學(xué)試劑經(jīng)銷有限責(zé)任公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase medicine，ALP）檢測(cè)試劑盒：南京建成生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化物酶（catalase，CAT） 檢測(cè)試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒：上海生工生物有限公司。

1.2 主要儀器

原子吸收分光光度計(jì)（AA-6880）：日本島津公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Spectramax 384 plus）：美國(guó)Molecular Devices 公司；低速冷凍離心機(jī)（KDC-2046 型）：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；紫外分光光度計(jì)（UV756 型）：上海第三分析儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

100 只8 周齡成年C57BL/6 雄性小鼠（25～30 g）：長(zhǎng)春長(zhǎng)生生物科技有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SYXK（吉）2017-0009。實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境為（22±2）℃，濕度為（55±5）%。飼喂1 周后用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 山藥硒多糖的制備

山藥硒多糖制備方法為HNO3-Na2SeO3法，具體操作：將山藥多糖用50 mL 5% HNO3溶液溶解并加入三口燒瓶中，隨后加入等質(zhì)量的亞硒酸鈉，水浴加熱至70 ℃，并加入0.5 g BaCl2催化劑，反應(yīng)8 h。待反應(yīng)完成時(shí)冷卻降至室溫，并滴加1 mol/L 硫酸溶液至Ba2+完全沉淀，8 000 r/min 離心10 min。反應(yīng)液用無(wú)水Na2CO3調(diào)節(jié)pH 值至5～6，8 000 r/min 離心10 min，透析袋中用流水透析48 h 以上，直至用抗壞血酸檢測(cè)透析液不再變紅為止，醇沉、離心、干燥、稱重。并使用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定山藥硒多糖中硒含量和苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖含量。

1.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

將100 只成年C57BL/6 雄性小鼠隨機(jī)分成5 組，每組20 只。分別為對(duì)照組（CK 組），氯化鎘處理組（Cd組），山藥硒多糖低（L-SeY）、中（M-SeY）、高劑量組（H-SeY）。CK 組小鼠飲用普通蒸餾水，Cd 組和山藥硒多糖組小鼠飲用含CdCl2的蒸餾水（20 mg/L）。山藥硒多糖給藥方式為灌胃給藥，其中CK 組和Cd 組小鼠灌胃生理鹽水，L-SeY 組、M-SeY 組和H-SeY 組分別灌胃200、500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的山藥硒多糖。實(shí)驗(yàn)持續(xù)6 周，每天記錄小鼠采食量和飲水量，每周對(duì)小鼠進(jìn)行稱重。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠自由采食飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前24 h，對(duì)各組小鼠禁食不禁水，使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，并收集小鼠血液、肝臟、腎臟、小腸、大腦和心臟樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。并對(duì)肝臟、腎臟、大腦和心臟樣品進(jìn)行稱重，用于計(jì)算各臟器指數(shù)。本研究中的所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4.3 小鼠血液及組織中鎘濃度的測(cè)定

使用原子吸收分光光度測(cè)定小鼠血液和肝臟、腎臟、小腸、大腦和心臟中Cd 濃度，具體參考Wan 等[12]的方法。

1.4.4 小鼠肝功能指標(biāo)的測(cè)定

將收集的小鼠血液使用離心機(jī)3 000 r/min 離心10 min，取血清。并使用試劑盒對(duì)小鼠ALT、AST、LDH 及ALP 活性進(jìn)行測(cè)定，具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4.5 小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定

處死小鼠后，立即切除肝組織，并在冰冷的磷酸鈉鹽緩沖液（0.1 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH7.4）中使用超聲波處理器進(jìn)行組織勻漿。將組織勻漿在4 ℃下，3 500 r/min 離心10 min，收集上清液。使用試劑盒對(duì)小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、GR、CAT 活性和MDA 含量進(jìn)行測(cè)定，參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel2010 和SPSS 22.0 進(jìn)行方差分析，使用Duncan 法進(jìn)行多重比較，并使用GraphPad Prism 7.0 制圖，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥硒多糖的得率、糖含量和硒含量

按照1.4.1 制備方法共制備合成20 批山藥硒多糖，其中山藥硒多糖平均得率為（48.24±1.16）%，硒平均含量為3.97 mg/g，多糖平均含量為52.37%。

2.2 山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠體質(zhì)量的影響

山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠體質(zhì)量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 The effect of Chinese yam selenium polysaccharide on the body weight of Cd-exposed mice

實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠活動(dòng)無(wú)異常，且無(wú)小鼠死亡，各組小鼠采食量和飲水量之間無(wú)明顯差異。由圖1 可知，隨著Cd 暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，Cd 組小鼠體質(zhì)量逐漸降低，并低于其他處理組，且H-SeY 組和M-SeY 組小鼠體質(zhì)量在第6 周時(shí)高于L-SeY 組小鼠。

2.3 山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠不同組織中Cd 蓄積的影響

山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠不同組織中Cd 蓄積的影響見(jiàn)圖2。

圖2 山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠不同組織中Cd 蓄積的影響Fig.2 Effects of Chinese yam selenium polysaccharide on Cd accumulation in different tissues of Cd-exposed mice

由圖2 可知，在Cd 組中，Cd 在小鼠各組織的蓄積情況排序?yàn)槟I臟（47.55 μg/g）＞肝臟（23.15 μg/g）＞心臟（13.26 μg/g）＞小腸（9.31 μg/g）＞大腦（0.07 μg/g），血液中Cd 含量為5.17 μg/L。與Cd 組相比，M-SeY 組和H-SeY 組小鼠血液、腎臟、肝臟、小腸和心臟中的Cd含量顯著降低（P<0.05）；而L-SeY 組和Cd 組差異不顯著（P＞0.05）。此外，除CK 組外，各組小鼠大腦中Cd含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠臟器指數(shù)的影響

山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠臟器指數(shù)的影響見(jiàn)表1。

由表1 可知，與CK 組相比，Cd 組小鼠肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與Cd 組相比，M-SeY 組和H-SeY 組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。此外，各組小鼠在腎臟指數(shù)、心臟指數(shù)和大腦指數(shù)間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠氧化應(yīng)激的影響

山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠氧化應(yīng)激的影響見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠血清中AST、ALT、LDH 和ALP水平的影響Fig.3 Effects of Chinese yam selenium polysaccharide on serum levels of AST，ALT，LDH and ALP in Cd-exposed mice

圖4 山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT、GR 和MDA 水平的影響Fig.4 Effects of Chinese yam selenium polysaccharide on the levels of SOD，GSH-Px，CAT，GR and MDA in the liver of Cdexposed mice

由圖3 可知，Cd 暴露顯著提高了小鼠血清中AST、ALT、LDH 和ALP 水平（P<0.05）。山藥硒多糖（M-SeY組和H-SeY 組）顯著降低了小鼠血清中AST、ALT、LDH 和ALP 水平（P<0.05）。然而，L-SeY 組小鼠血清中AST 和ALT 含量與Cd 組間無(wú)差異顯著性（P>0.05）。由圖4 可知，與CK 組相比，Cd 暴露小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT 和GR 水平顯著降低，而MDA 水平顯著升高（P<0.05）。與Cd 組相比，山藥硒多糖組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT 和GR 水平顯著升高，而MDA水平顯著降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。

3 討論

Cd 進(jìn)入機(jī)體后，首先在血液中分布，隨后隨血液循環(huán)不斷進(jìn)入肝臟和腎臟等器官。Cd 進(jìn)入肝臟后會(huì)不斷誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成分泌金屬硫蛋白（metallothionein，MT），并與MT 結(jié)合形成Cd-MT 復(fù)合物運(yùn)輸至腎臟，在腎小管溶酶體的作用下Cd-MT 復(fù)合物中游離出Cd2+，從而在腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)揮毒性[13]。Cd 進(jìn)入機(jī)體后會(huì)在機(jī)體內(nèi)器官內(nèi)蓄積，引起器官氧化損傷。Cd在機(jī)體內(nèi)不同器官的蓄積情況不同，并且Cd 在機(jī)體器官內(nèi)的蓄積與Cd 暴露的濃度和方式等有關(guān)。當(dāng)前的結(jié)果表明，Cd 進(jìn)入體內(nèi)后主要在腎臟和肝臟蓄積。此外，心臟中較高的Cd 含量可能與Cd 進(jìn)入體內(nèi)后通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟的過(guò)程有關(guān)。本文結(jié)果還顯示，對(duì)小鼠灌胃山藥硒多糖可降低Cd 在小鼠器官中的蓄積。與Cd 組小鼠相比，山藥硒多糖組小鼠腎臟、肝臟、心臟、小腸和血液中Cd 含量顯著降低，并且還呈現(xiàn)出劑量依賴性。

當(dāng)動(dòng)物受到重金屬的危害時(shí)，重金屬會(huì)引起機(jī)體器官的損傷，相應(yīng)的臟器指數(shù)也隨著變化[14]。李光先[13]研究表明，對(duì)小鼠Cd 暴露后，小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)升高。藍(lán)田豐等[15]的研究也表明，小鼠Cd 暴露后，其肝臟指數(shù)和睪丸指數(shù)顯著升高。本研究結(jié)果顯示，Cd暴露后，小鼠的肝臟指數(shù)顯著升高。Cd 暴露還會(huì)導(dǎo)致脂肪肝和急性肝炎的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致肝臟指數(shù)升高。當(dāng)對(duì)Cd 暴露小鼠進(jìn)行山藥硒多糖灌胃后，小鼠的肝臟指數(shù)逐漸降低。推測(cè)這與山藥硒多糖的抗氧化活性有關(guān)，其提高了肝臟的抗氧化能力，緩解了因Cd 暴露導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

ALT 和AST 是評(píng)價(jià)機(jī)體肝損傷的重要指標(biāo)，其中，血清中ALT 和AST 活性增高表明肝臟線粒體被破壞，細(xì)胞膜通透性增加，ALT 和AST 被釋放到肝臟中[16]。此外，LDH 和ALP 也是反映肝功能正常與否的重要指標(biāo)。在本文中，Cd 暴露后，小鼠血清中AST、ALT、LDH和ALP 水平顯著升高，表明小鼠出現(xiàn)肝損傷。而對(duì)小鼠進(jìn)行山藥硒多糖灌胃后，小鼠血清中AST、ALT、LDH和ALP 水平顯著降低，表明山藥硒多糖緩解了Cd 暴露導(dǎo)致的小鼠肝功能異常。此外，Cd 暴露還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激的特征是產(chǎn)生自由基，誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞膜的破壞[17]。研究表明，鎘暴露會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)GSH 的含量以及細(xì)胞內(nèi)SOD、過(guò)氧化物酶和CAT 活性，從而導(dǎo)致氧自由基積累和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的增加[18]。自由基的產(chǎn)生及其相關(guān)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是鎘誘導(dǎo)毒性的主要機(jī)制之一[19-20]。Yang 等[21]研究指出，Cd 暴露后小鼠肝臟中SOD、GST、GSH、CAT 和GR 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高。本研究結(jié)果也表明，Cd 暴露顯著降低了小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT 和GR 水平，顯著提高了MDA 含量。然而，山藥硒多糖的治療緩解了Cd 暴露導(dǎo)致的小鼠肝臟氧化應(yīng)激（SOD、GSH -Px、CAT 和GR 水平升高，MDA 水平降低），且呈現(xiàn)劑量依賴性。這表明山藥硒多糖可通過(guò)提高Cd 暴露小鼠抗氧化酶活性來(lái)緩解Cd 暴露導(dǎo)致的小鼠氧化應(yīng)激和肝損傷。

4 結(jié)論

本研究旨在探究山藥硒多糖對(duì)Cd 暴露小鼠鎘蓄積和氧化應(yīng)激的緩解作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山藥硒多糖能夠降低Cd 在小鼠各組織中的蓄積，并通過(guò)提高肝臟抗氧化酶活性來(lái)改善Cd 毒性引起的小鼠氧化應(yīng)激和肝損傷。但關(guān)于山藥硒多糖降低Cd 在小鼠體內(nèi)的蓄積以及緩解氧化應(yīng)激的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。