黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對D- 半乳糖致衰老小鼠改善作用

辛炫英，謝庭巖，付興培，王妍

（延邊大學 農學院，吉林 延吉 133000）

黃線狹鱈（Theragra chalcogramma）是鱈科、鱈屬魚類，是海洋中主要的經濟魚類，年產數量巨大，其總捕獲量位居世界第二，并且黃線狹鱈加工在世界各國都是重要的產業(yè)，能夠帶來十分可觀的經濟效益[1]。我國是世界上最大的黃線狹鱈生產和出口國，年加工量多達30 多萬t，吉林省延邊朝鮮族自治州是我國較大的黃線狹鱈制品加工廠所在地之一。鱈魚加工是吉林省延邊地區(qū)特色產業(yè)，在加工過程中副產物資源利用率不高，經濟效益低下，其中魚皮占比最多，總計每年約5 萬t 的魚皮被浪費，占魚總量的8%～10%。

衰老是自然界最基本的自然規(guī)律，也是最復雜的生物學現象。隨著我國老齡化問題加重，抗衰老問題已經成為研究熱點。在衰老過程中，位于機體表面的皮膚是最明顯的器官，延緩皮膚衰老問題已然成為抗衰老研究的重中之重[2]。在衰老過程中，膠原蛋白的流失會直接導致皮膚失去水分和彈性，使皮膚快速老化。此外膠原蛋白被黑色素物質吞噬后，被激活的黑色素不能及時排出，還會引起色斑、膚色不勻或暗沉等問題。膠原蛋白流失還容易造成關節(jié)疼痛、骨質疏松、視力下降、腸胃機能嚴重下降等一系列嚴重問題[3]。膠原蛋白肽是利用生物法或化學法，以各種生物中的膠原蛋白為原料，使膠原蛋白的水溶性和生物活性進一步提高而得到的小分子產物。國內外研究表明，膠原蛋白肽具有較好的抗氧化、抗衰老、免疫調節(jié)、促進組織創(chuàng)面修復、抑制血管緊張素-I 轉化酶、抗腫瘤、抗凝血、抗菌等活性，與膠原蛋白相比，膠原蛋白肽具有較好的抗氧化作用[4-5]。本文通過對D-半乳糖致衰老模型小鼠灌胃膠原蛋白肽，從小鼠皮膚的水分、膠原蛋白、羥脯氨酸和透明質酸的含量，小鼠血清和皮膚中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性以及皮膚組織形態(tài)學觀察等方面評價黃線狹鱈魚皮膠原蛋白延緩皮膚衰老的作用，以期為黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽在改善皮膚老化中的廣泛應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃線狹鱈魚干皮：市售；胃蛋白酶（1 500 U/g）、氯化鈉、氫氧化鈉、正丁醇、氯化鈣、活性炭（均為分析純）、D-半乳糖：北京索萊寶科技有限公司；KM 雄性小鼠：延邊大學動物實驗中心；黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽凍干粉：延邊大學生物技術實驗室制備；超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒、過氧化氫酶試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒、羥脯氨酸試劑盒：南京建成生物工程研究所；小鼠透明質酸試劑盒：上海聯碩生物科技有限公司；蛋白濃度（bicinchoninic acid assay，BAC）測定試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司。

MultiskanFC 酶標儀：賽默飛世爾科技公司；CT-15RT 臺式高速冷凍離心機：天美（中國）科學儀器有限公司；ZTJZ-200S 均質機：上海眾托實業(yè)有限公司；HSS7120-B 石蠟切片機：沈陽恒松科技有限公司；PZXJL04 光學顯微鏡：北京品智創(chuàng)思精密儀器有限公司；BMA550 磁力攪拌器：美國SPXFLOW 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 膠原蛋白肽制備

參照王艷[6]的方法并加以改進，取一定量的鱈魚皮，去離子水除去皮上雜質。將魚皮浸泡在含有0.02 mol/L NaOH 的7.5% NaCl 溶液中，同時使用磁力攪拌器連續(xù)攪拌18 h，再使用10%正丁醇溶液對除去雜質蛋白后的黃線狹鱈魚皮漂洗5 次，每次1 h。水沖至中性，烘干備用。隨后采用胃蛋白酶法提取膠原蛋白，將預處理好的魚皮剪碎，按照料液比為1 ∶20（g/mL）加入純水，加入1 500 U/g 胃蛋白酶，在45 ℃恒溫水浴鍋中水浴4 h 提取黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽。雜質去除干凈后添加5%干皮質量的活性炭和氯化鈣，以此達到脫色除味的目的。在60 ℃恒溫水浴鍋中將混合液靜置沉淀20 min，去除上清液后，再用800 目濾布進行過濾，將活性炭及雜質去除。6 000 r/min 離心20 min，取上清液。將純化的膠原蛋白溶液放在大培養(yǎng)皿中，-80 ℃冷凍4 h，待樣品完全結冰后進行真空冷凍干燥處理，24 h后得到黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽。

1.2.2 動物飼養(yǎng)與分組

50 只雄性KM 小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為5 組（每組10 只）：對照組、衰老模型組、低劑量膠原蛋白肽組、中劑量膠原蛋白肽組、高劑量膠原蛋白肽組。

1.2.3 衰老小鼠模型建立及給藥

建立衰老動物模型：每個實驗組的小鼠皮下注射5%D-半乳糖（1 000 mg/kg）。對照組皮下注射生理鹽水，每日0.2 mL。低劑量膠原蛋白肽組小鼠每日灌胃黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽200 mg/kg，中劑量膠原蛋白肽組每日灌胃黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽400 mg/kg，高劑量膠原蛋白肽組每日灌胃黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽800 mg/kg，同時，衰老模型組和對照組的小鼠每天同樣劑量灌胃蒸餾水，連續(xù)進行60 d。飼養(yǎng)期間，所有受試小鼠自由攝取飼料和飲用水。試驗期最后一晚小鼠禁食不禁水。

1.2.4 小鼠皮膚水分含量的測定

水分含量測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[7]。精確稱量所取小鼠的皮膚質量并記錄，然后將其放在100 ℃恒溫干燥箱中，每次干燥時間不宜過長，間隔30 min 稱量記錄1 次皮膚質量，直至連續(xù)兩次質量差小于2 mg。選取最后1 次作為干燥后質量，計算得到最終水分含量，計算公式如下。

式中：X 為水分含量，%；m2為樣品質量，g；m1為干燥后樣品質量，g。

1.2.5 小鼠皮膚蛋白質含量測定

稱取一定質量皮膚組織，加入生理鹽水混合后，4 000 r/min 離心1 min，取上清液，制得皮膚組織勻漿。然后按蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，計算待測樣品的蛋白質含量。

1.2.6 小鼠皮膚羥脯氨酸、透明質酸含量測定

沖洗小鼠背部皮膚，用鑷子將小鼠背部皮膚毛發(fā)處理干凈，取小鼠皮膚，根據羥脯氨酸試劑盒、透明質酸試劑盒說明書操作，分別測定小鼠皮膚羥脯氨酸、透明質酸含量。

1.2.7 小鼠血清及皮膚抗氧化指標的測定

1.2.7.1 小鼠血清抗氧化指標測定

眼球取血后靜置30 min，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書分別操作，測定各組小鼠血清中MDA 含量及SOD、CAT、GSH-Px 活性。

1.2.7.2 小鼠皮膚抗氧化指標測定

準確稱量小鼠皮膚質量，以生理鹽水為溶劑，4 000 r/min 離心1 min，取上清液，配制皮膚組織勻漿。根據相關試劑盒說明書，分別對各組小鼠皮膚組織勻漿中MDA 含量和SOD、CAT、GSH-Px 活性進行測定。

1.2.8 皮膚組織形態(tài)學觀察

將皮膚固定、脫水、包埋、切片、脫臘后進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察各組小鼠皮膚組織結構變化。

1.3 數據處理

分別采用Excel2019 和SPSS Statistics22.0 進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差表示，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著，同時采用GraphPadprism 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚水分含量的影響

黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚水分含量的影響見圖1。

圖1 膠原蛋白肽對小鼠皮膚水分含量的影響Fig.1 Effect of collagen peptide on moisture content in mouse skin

由圖1 可知，衰老模型組相比于對照組，皮膚水分含量明顯降低，表明衰老可以顯著降低皮膚含水量，同時也進一步驗證采用D-半乳糖致衰老小鼠模型建模成功。灌胃膠原蛋白肽可顯著提高小鼠皮膚水分含量，其中高劑量膠原蛋白肽組與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。以上結果表明，本實驗制備的黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽能夠提高皮膚水分含量。

2.2 黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚蛋白質含量的影響

蛋白質濃度標準曲線見圖2，黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚蛋白質含量的影響見圖3。

圖3 膠原蛋白肽對小鼠皮膚蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of collagen peptide on protein content in mouse skin

由圖3 可知，與對照組相比，衰老模型組皮膚的蛋白質含量極顯著降低，表明衰老可降低皮膚中蛋白質含量。與衰老模型組相比，各實驗組小鼠皮膚蛋白質含量均有所提高，其中，高劑量膠原蛋白肽組皮膚蛋白質含量增加最多，與衰老模型組相比差異極顯著（P<0.01）。以上結果表明，本實驗制備的黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽有助于提高皮膚蛋白質的含量。

2.3 黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚羥脯氨酸及透明質酸含量的影響

黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚羥脯氨酸及透明質酸含量的影響見圖4、圖5。

圖4 膠原蛋白肽對小鼠皮膚羥脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of collagen peptide on hydroxyproline content in mouse skin

圖5 膠原蛋白肽對小鼠皮膚透明質酸含量的影響Fig.5 Effect of collagen peptide on hyaluronic acid content in mouse skin

羥脯氨酸主要存在于膠原蛋白中，極少存在于彈性蛋白中，也不存在于其他蛋白質中，所以羥脯氨酸的含量能間接反映膠原蛋白的數量[8]。透明質酸主要在肌膚中起到保濕的作用，是目前為止發(fā)現的自然界中最好的肌膚保濕物質，被稱為最理想的保濕因子。同時膠原蛋白含量和透明質酸含量有密切的關系，透明質酸的減少會直接導致皮膚膠原蛋白含量下降，從而導致皮膚老化[9]。由圖4、圖5 可知，衰老模型組羥脯氨酸、透明質酸含量極顯著低于對照組（P<0.01），說明衰老會降低皮膚中羥脯氨酸、透明質酸的含量。與衰老模型組相比，高劑量膠原蛋白肽組小鼠皮膚羥脯氨酸、透明質酸含量極顯著增高（P<0.01）。以上結果表明，本實驗制備的黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽能夠有效增加皮膚中羥脯氨酸、透明質酸含量，可以有效提高衰老皮膚膠原蛋白結合能力。

2.4 黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠血清中抗氧化指標影響

小鼠血清中抗氧化指標MDA 含量及SOD、CAT、GSH-Px 活性的變化見圖6。

圖6 膠原蛋白肽對小鼠血清中MDA 含量及SOD、CAT、GSHPx 活性的影響Fig.6 Effect of collagen peptide on MDA contents and SOD，CAT and GSH-Px activity in mouse serum

由圖6 可知，衰老模型組小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px 活性極顯著低于對照組（P<0.01），而MDA 含量極顯著高于對照組（P<0.01）。各實驗組小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px 活性均顯著提高且MDA 含量顯著降低，其中高劑量膠原蛋白肽組效果最優(yōu)，與衰老模型組相比差異極顯著（P<0.01）。以上結果表明，本實驗制備的黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽能夠有效修復衰老導致的氧化損傷。

2.5 黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚中抗氧化指標影響

小鼠皮膚中抗氧化指標MDA 含量及SOD、CAT、GSH-Px 活性的變化見圖7。

圖7 膠原蛋白肽對小鼠皮膚中MDA 含量及SOD、CAT、GSHPx 活性的影響Fig.7 Effect of collagen peptide on MDA contents and SOD，CAT and GSH-Px activity in mouse skin

研究抗衰老作用，檢測血清抗氧化指標的同時，皮膚組織勻漿抗氧化指標也是判斷改善衰老效果的關鍵。如圖7 所示，衰老模型組小鼠皮膚組織勻漿中SOD、CAT、GSH-Px 活性極顯著低于對照組（P<0.01），而MDA 含量極顯著高于對照組（P<0.01），與衰老模型組相比，各實驗組小鼠皮膚中SOD、CAT、GSH-Px 活性均顯著提高且MDA 含量顯著下降，其中高劑量膠原蛋白肽組效果最優(yōu)，與衰老模型組相比差異極顯著（P<0.01），以上結果表明，本實驗制備的黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽能夠有效恢復皮膚受到的氧化損傷。

2.6 黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚組織形態(tài)的影響

黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚組織形態(tài)的影響見圖8。

圖8 膠原蛋白肽對小鼠皮膚組織形態(tài)的影響Fig.8 Effect of collagen peptide on tissue morphology in mouse skin

由圖8 可知，對照組小鼠與衰老模型組小鼠相比皮膚染色均勻，真皮層與表皮層連接完整、緊密，皮下細胞層數較多較整齊，皮層纖維組織較多、排列有序，毛囊、皮脂腺較完整，數量較多，皮下脂肪細胞較少。衰老模型組小鼠皮膚真皮層與表皮層結合不緊密，交界處變得平坦，細胞層數減少，皮膚纖維組織排列不清晰不規(guī)則，皮下脂肪細胞數量增加，毛囊、皮脂腺數量少、欠完整。膠原蛋白組小鼠相比于衰老模型組皮膚變厚，真皮層與表皮層連接變得完整緊密，皮層纖維組織排列較規(guī)則、皮下脂肪減少，毛囊、皮脂腺相比于衰老組也較完整、數量也有所增加，并且高劑量膠原蛋白肽組優(yōu)于其他對照組。以上結果說明黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽能夠有效改善衰老皮膚粗糙松弛，增加皮膚膠原。

3 討論與結論

通過注射D-半乳糖建立實驗動物衰老模型的原理是采用皮下注射一定劑量的D-半乳糖，使實驗動物體內D-半乳糖的濃度升高，在醛糖還原酶的作用下被還原成半乳糖醇，大量的半乳糖醇導致細胞滲透壓升高，細胞失去部分功能，并且在氧化酶的作用下D-半乳糖分解生成很多自由基，加速機體衰老。D-半乳糖建立實驗動物衰老模型相比于其他方法，具有簡單易行、花費低、良好的衰老效果等優(yōu)點，在延緩衰老研究的領域應用較多[10-19]。氧化損傷指標是檢測衰老情況極其重要的指標，衰老會使各項指標變化很大。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶、細胞內活性氧、丙二醛等都是抗氧化試驗中主要研究的氧化代謝指標[20]。其中SOD、GSH-Px、CAT 在氧化代謝過程中扮演者很重要的角色，細胞內ROS 是直接導致細胞發(fā)生氧化損傷及衰老的原因；細胞氧化則會生成MDA，因此MDA 的多少也能反映抗氧化活性的強弱[21]。衰老導致的各項指標的改變會引起自身抗氧化能力發(fā)生改變，對細胞的活性及功能產生影響[22]。在皮膚的結構和功能中，膠原蛋白起著至關重要密不可分的作用。皮膚的衰老會導致膠原蛋白含量降低。因此測定膠原蛋白含量是判斷皮膚是否衰老的關鍵之一。羥脯氨酸是膠原蛋白區(qū)別于其他種類蛋白的一種特有氨基酸，它的含量也可以間接影響皮膚所含膠原蛋白。酶類的檢測也是判斷是否衰老常用的檢測指標。I 型前膠原羧基末端肽是新生膠原分子由相關特異性酶水解產生的，可以反映I 型膠原蛋白含量，也可以作為檢測膠原代謝指標[23-25]。經實驗，模型組動物出現了血清抗氧化酶活性降低、脂質過氧化產物含量增加、皮膚老化等衰老癥狀，說明皮膚衰老模型建立成功。本實驗研究了黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽能有效改善衰老引起的各項指標異常，但具體保護機制還有待進一步研究。

本試驗研究黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽對D-半乳糖致衰老小鼠的改善作用，結果表明黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽可以提高衰老皮膚的水分、膠原蛋白、羥脯氨酸和透明質酸的含量，同時抗氧化試驗結果表明，本實驗制備的黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽能顯著提高血清和皮膚中SOD、CAT 和GSH-Px 的活性，抑制MDA的生成。黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽還能有效改善衰老皮膚粗糙松弛，增加皮膚膠原纖維，使其排列規(guī)則有序等，且高劑量膠原蛋白肽組的效果最好。因此本實驗制備的黃線狹鱈魚皮膠原蛋白肽能明顯改善D-半乳糖致衰老小鼠氧化損傷。