黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)D- 半乳糖致衰老小鼠改善作用

辛炫英，謝庭巖，付興培，王妍

（延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

黃線狹鱈（Theragra chalcogramma）是鱈科、鱈屬魚(yú)類，是海洋中主要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，年產(chǎn)數(shù)量巨大，其總捕獲量位居世界第二，并且黃線狹鱈加工在世界各國(guó)都是重要的產(chǎn)業(yè)，能夠帶來(lái)十分可觀的經(jīng)濟(jì)效益[1]。我國(guó)是世界上最大的黃線狹鱈生產(chǎn)和出口國(guó)，年加工量多達(dá)30 多萬(wàn)t，吉林省延邊朝鮮族自治州是我國(guó)較大的黃線狹鱈制品加工廠所在地之一。鱈魚(yú)加工是吉林省延邊地區(qū)特色產(chǎn)業(yè)，在加工過(guò)程中副產(chǎn)物資源利用率不高，經(jīng)濟(jì)效益低下，其中魚(yú)皮占比最多，總計(jì)每年約5 萬(wàn)t 的魚(yú)皮被浪費(fèi)，占魚(yú)總量的8%～10%。

衰老是自然界最基本的自然規(guī)律，也是最復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象。隨著我國(guó)老齡化問(wèn)題加重，抗衰老問(wèn)題已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。在衰老過(guò)程中，位于機(jī)體表面的皮膚是最明顯的器官，延緩皮膚衰老問(wèn)題已然成為抗衰老研究的重中之重[2]。在衰老過(guò)程中，膠原蛋白的流失會(huì)直接導(dǎo)致皮膚失去水分和彈性，使皮膚快速老化。此外膠原蛋白被黑色素物質(zhì)吞噬后，被激活的黑色素不能及時(shí)排出，還會(huì)引起色斑、膚色不勻或暗沉等問(wèn)題。膠原蛋白流失還容易造成關(guān)節(jié)疼痛、骨質(zhì)疏松、視力下降、腸胃機(jī)能嚴(yán)重下降等一系列嚴(yán)重問(wèn)題[3]。膠原蛋白肽是利用生物法或化學(xué)法，以各種生物中的膠原蛋白為原料，使膠原蛋白的水溶性和生物活性進(jìn)一步提高而得到的小分子產(chǎn)物。國(guó)內(nèi)外研究表明，膠原蛋白肽具有較好的抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織創(chuàng)面修復(fù)、抑制血管緊張素-I 轉(zhuǎn)化酶、抗腫瘤、抗凝血、抗菌等活性，與膠原蛋白相比，膠原蛋白肽具有較好的抗氧化作用[4-5]。本文通過(guò)對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠灌胃膠原蛋白肽，從小鼠皮膚的水分、膠原蛋白、羥脯氨酸和透明質(zhì)酸的含量，小鼠血清和皮膚中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性以及皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察等方面評(píng)價(jià)黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白延緩皮膚衰老的作用，以期為黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽在改善皮膚老化中的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃線狹鱈魚(yú)干皮：市售；胃蛋白酶（1 500 U/g）、氯化鈉、氫氧化鈉、正丁醇、氯化鈣、活性炭（均為分析純）、D-半乳糖：北京索萊寶科技有限公司；KM 雄性小鼠：延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽凍干粉：延邊大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室制備；超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒、過(guò)氧化氫酶試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒、羥脯氨酸試劑盒：南京建成生物工程研究所；小鼠透明質(zhì)酸試劑盒：上海聯(lián)碩生物科技有限公司；蛋白濃度（bicinchoninic acid assay，BAC）測(cè)定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

MultiskanFC 酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；CT-15RT 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司；ZTJZ-200S 均質(zhì)機(jī)：上海眾托實(shí)業(yè)有限公司；HSS7120-B 石蠟切片機(jī)：沈陽(yáng)恒松科技有限公司；PZXJL04 光學(xué)顯微鏡：北京品智創(chuàng)思精密儀器有限公司；BMA550 磁力攪拌器：美國(guó)SPXFLOW 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 膠原蛋白肽制備

參照王艷[6]的方法并加以改進(jìn)，取一定量的鱈魚(yú)皮，去離子水除去皮上雜質(zhì)。將魚(yú)皮浸泡在含有0.02 mol/L NaOH 的7.5% NaCl 溶液中，同時(shí)使用磁力攪拌器連續(xù)攪拌18 h，再使用10%正丁醇溶液對(duì)除去雜質(zhì)蛋白后的黃線狹鱈魚(yú)皮漂洗5 次，每次1 h。水沖至中性，烘干備用。隨后采用胃蛋白酶法提取膠原蛋白，將預(yù)處理好的魚(yú)皮剪碎，按照料液比為1 ∶20（g/mL）加入純水，加入1 500 U/g 胃蛋白酶，在45 ℃恒溫水浴鍋中水浴4 h 提取黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽。雜質(zhì)去除干凈后添加5%干皮質(zhì)量的活性炭和氯化鈣，以此達(dá)到脫色除味的目的。在60 ℃恒溫水浴鍋中將混合液靜置沉淀20 min，去除上清液后，再用800 目濾布進(jìn)行過(guò)濾，將活性炭及雜質(zhì)去除。6 000 r/min 離心20 min，取上清液。將純化的膠原蛋白溶液放在大培養(yǎng)皿中，-80 ℃冷凍4 h，待樣品完全結(jié)冰后進(jìn)行真空冷凍干燥處理，24 h后得到黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽。

1.2.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組

50 只雄性KM 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為5 組（每組10 只）：對(duì)照組、衰老模型組、低劑量膠原蛋白肽組、中劑量膠原蛋白肽組、高劑量膠原蛋白肽組。

1.2.3 衰老小鼠模型建立及給藥

建立衰老動(dòng)物模型：每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠皮下注射5%D-半乳糖（1 000 mg/kg）。對(duì)照組皮下注射生理鹽水，每日0.2 mL。低劑量膠原蛋白肽組小鼠每日灌胃黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽200 mg/kg，中劑量膠原蛋白肽組每日灌胃黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽400 mg/kg，高劑量膠原蛋白肽組每日灌胃黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽800 mg/kg，同時(shí)，衰老模型組和對(duì)照組的小鼠每天同樣劑量灌胃蒸餾水，連續(xù)進(jìn)行60 d。飼養(yǎng)期間，所有受試小鼠自由攝取飼料和飲用水。試驗(yàn)期最后一晚小鼠禁食不禁水。

1.2.4 小鼠皮膚水分含量的測(cè)定

水分含量測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》[7]。精確稱量所取小鼠的皮膚質(zhì)量并記錄，然后將其放在100 ℃恒溫干燥箱中，每次干燥時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，間隔30 min 稱量記錄1 次皮膚質(zhì)量，直至連續(xù)兩次質(zhì)量差小于2 mg。選取最后1 次作為干燥后質(zhì)量，計(jì)算得到最終水分含量，計(jì)算公式如下。

式中：X 為水分含量，%；m2為樣品質(zhì)量，g；m1為干燥后樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 小鼠皮膚蛋白質(zhì)含量測(cè)定

稱取一定質(zhì)量皮膚組織，加入生理鹽水混合后，4 000 r/min 離心1 min，取上清液，制得皮膚組織勻漿。然后按蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 小鼠皮膚羥脯氨酸、透明質(zhì)酸含量測(cè)定

沖洗小鼠背部皮膚，用鑷子將小鼠背部皮膚毛發(fā)處理干凈，取小鼠皮膚，根據(jù)羥脯氨酸試劑盒、透明質(zhì)酸試劑盒說(shuō)明書操作，分別測(cè)定小鼠皮膚羥脯氨酸、透明質(zhì)酸含量。

1.2.7 小鼠血清及皮膚抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

1.2.7.1 小鼠血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定

眼球取血后靜置30 min，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書分別操作，測(cè)定各組小鼠血清中MDA 含量及SOD、CAT、GSH-Px 活性。

1.2.7.2 小鼠皮膚抗氧化指標(biāo)測(cè)定

準(zhǔn)確稱量小鼠皮膚質(zhì)量，以生理鹽水為溶劑，4 000 r/min 離心1 min，取上清液，配制皮膚組織勻漿。根據(jù)相關(guān)試劑盒說(shuō)明書，分別對(duì)各組小鼠皮膚組織勻漿中MDA 含量和SOD、CAT、GSH-Px 活性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察

將皮膚固定、脫水、包埋、切片、脫臘后進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察各組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別采用Excel2019 和SPSS Statistics22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著，同時(shí)采用GraphPadprism 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚水分含量的影響

黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚水分含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚水分含量的影響Fig.1 Effect of collagen peptide on moisture content in mouse skin

由圖1 可知，衰老模型組相比于對(duì)照組，皮膚水分含量明顯降低，表明衰老可以顯著降低皮膚含水量，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證采用D-半乳糖致衰老小鼠模型建模成功。灌胃膠原蛋白肽可顯著提高小鼠皮膚水分含量，其中高劑量膠原蛋白肽組與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽能夠提高皮膚水分含量。

2.2 黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚蛋白質(zhì)含量的影響

蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of collagen peptide on protein content in mouse skin

由圖3 可知，與對(duì)照組相比，衰老模型組皮膚的蛋白質(zhì)含量極顯著降低，表明衰老可降低皮膚中蛋白質(zhì)含量。與衰老模型組相比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚蛋白質(zhì)含量均有所提高，其中，高劑量膠原蛋白肽組皮膚蛋白質(zhì)含量增加最多，與衰老模型組相比差異極顯著（P<0.01）。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽有助于提高皮膚蛋白質(zhì)的含量。

2.3 黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚羥脯氨酸及透明質(zhì)酸含量的影響

黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚羥脯氨酸及透明質(zhì)酸含量的影響見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚羥脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of collagen peptide on hydroxyproline content in mouse skin

圖5 膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚透明質(zhì)酸含量的影響Fig.5 Effect of collagen peptide on hyaluronic acid content in mouse skin

羥脯氨酸主要存在于膠原蛋白中，極少存在于彈性蛋白中，也不存在于其他蛋白質(zhì)中，所以羥脯氨酸的含量能間接反映膠原蛋白的數(shù)量[8]。透明質(zhì)酸主要在肌膚中起到保濕的作用，是目前為止發(fā)現(xiàn)的自然界中最好的肌膚保濕物質(zhì)，被稱為最理想的保濕因子。同時(shí)膠原蛋白含量和透明質(zhì)酸含量有密切的關(guān)系，透明質(zhì)酸的減少會(huì)直接導(dǎo)致皮膚膠原蛋白含量下降，從而導(dǎo)致皮膚老化[9]。由圖4、圖5 可知，衰老模型組羥脯氨酸、透明質(zhì)酸含量極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），說(shuō)明衰老會(huì)降低皮膚中羥脯氨酸、透明質(zhì)酸的含量。與衰老模型組相比，高劑量膠原蛋白肽組小鼠皮膚羥脯氨酸、透明質(zhì)酸含量極顯著增高（P<0.01）。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽能夠有效增加皮膚中羥脯氨酸、透明質(zhì)酸含量，可以有效提高衰老皮膚膠原蛋白結(jié)合能力。

2.4 黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠血清中抗氧化指標(biāo)影響

小鼠血清中抗氧化指標(biāo)MDA 含量及SOD、CAT、GSH-Px 活性的變化見(jiàn)圖6。

圖6 膠原蛋白肽對(duì)小鼠血清中MDA 含量及SOD、CAT、GSHPx 活性的影響Fig.6 Effect of collagen peptide on MDA contents and SOD，CAT and GSH-Px activity in mouse serum

由圖6 可知，衰老模型組小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px 活性極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），而MDA 含量極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px 活性均顯著提高且MDA 含量顯著降低，其中高劑量膠原蛋白肽組效果最優(yōu)，與衰老模型組相比差異極顯著（P<0.01）。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽能夠有效修復(fù)衰老導(dǎo)致的氧化損傷。

2.5 黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚中抗氧化指標(biāo)影響

小鼠皮膚中抗氧化指標(biāo)MDA 含量及SOD、CAT、GSH-Px 活性的變化見(jiàn)圖7。

圖7 膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚中MDA 含量及SOD、CAT、GSHPx 活性的影響Fig.7 Effect of collagen peptide on MDA contents and SOD，CAT and GSH-Px activity in mouse skin

研究抗衰老作用，檢測(cè)血清抗氧化指標(biāo)的同時(shí)，皮膚組織勻漿抗氧化指標(biāo)也是判斷改善衰老效果的關(guān)鍵。如圖7 所示，衰老模型組小鼠皮膚組織勻漿中SOD、CAT、GSH-Px 活性極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），而MDA 含量極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），與衰老模型組相比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚中SOD、CAT、GSH-Px 活性均顯著提高且MDA 含量顯著下降，其中高劑量膠原蛋白肽組效果最優(yōu)，與衰老模型組相比差異極顯著（P<0.01），以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽能夠有效恢復(fù)皮膚受到的氧化損傷。

2.6 黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚組織形態(tài)的影響

黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚組織形態(tài)的影響見(jiàn)圖8。

圖8 膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚組織形態(tài)的影響Fig.8 Effect of collagen peptide on tissue morphology in mouse skin

由圖8 可知，對(duì)照組小鼠與衰老模型組小鼠相比皮膚染色均勻，真皮層與表皮層連接完整、緊密，皮下細(xì)胞層數(shù)較多較整齊，皮層纖維組織較多、排列有序，毛囊、皮脂腺較完整，數(shù)量較多，皮下脂肪細(xì)胞較少。衰老模型組小鼠皮膚真皮層與表皮層結(jié)合不緊密，交界處變得平坦，細(xì)胞層數(shù)減少，皮膚纖維組織排列不清晰不規(guī)則，皮下脂肪細(xì)胞數(shù)量增加，毛囊、皮脂腺數(shù)量少、欠完整。膠原蛋白組小鼠相比于衰老模型組皮膚變厚，真皮層與表皮層連接變得完整緊密，皮層纖維組織排列較規(guī)則、皮下脂肪減少，毛囊、皮脂腺相比于衰老組也較完整、數(shù)量也有所增加，并且高劑量膠原蛋白肽組優(yōu)于其他對(duì)照組。以上結(jié)果說(shuō)明黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽能夠有效改善衰老皮膚粗糙松弛，增加皮膚膠原。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)注射D-半乳糖建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物衰老模型的原理是采用皮下注射一定劑量的D-半乳糖，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)D-半乳糖的濃度升高，在醛糖還原酶的作用下被還原成半乳糖醇，大量的半乳糖醇導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓升高，細(xì)胞失去部分功能，并且在氧化酶的作用下D-半乳糖分解生成很多自由基，加速機(jī)體衰老。D-半乳糖建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物衰老模型相比于其他方法，具有簡(jiǎn)單易行、花費(fèi)低、良好的衰老效果等優(yōu)點(diǎn)，在延緩衰老研究的領(lǐng)域應(yīng)用較多[10-19]。氧化損傷指標(biāo)是檢測(cè)衰老情況極其重要的指標(biāo)，衰老會(huì)使各項(xiàng)指標(biāo)變化很大。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶、過(guò)氧化氫酶、細(xì)胞內(nèi)活性氧、丙二醛等都是抗氧化試驗(yàn)中主要研究的氧化代謝指標(biāo)[20]。其中SOD、GSH-Px、CAT 在氧化代謝過(guò)程中扮演者很重要的角色，細(xì)胞內(nèi)ROS 是直接導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷及衰老的原因；細(xì)胞氧化則會(huì)生成MDA，因此MDA 的多少也能反映抗氧化活性的強(qiáng)弱[21]。衰老導(dǎo)致的各項(xiàng)指標(biāo)的改變會(huì)引起自身抗氧化能力發(fā)生改變，對(duì)細(xì)胞的活性及功能產(chǎn)生影響[22]。在皮膚的結(jié)構(gòu)和功能中，膠原蛋白起著至關(guān)重要密不可分的作用。皮膚的衰老會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白含量降低。因此測(cè)定膠原蛋白含量是判斷皮膚是否衰老的關(guān)鍵之一。羥脯氨酸是膠原蛋白區(qū)別于其他種類蛋白的一種特有氨基酸，它的含量也可以間接影響皮膚所含膠原蛋白。酶類的檢測(cè)也是判斷是否衰老常用的檢測(cè)指標(biāo)。I 型前膠原羧基末端肽是新生膠原分子由相關(guān)特異性酶水解產(chǎn)生的，可以反映I 型膠原蛋白含量，也可以作為檢測(cè)膠原代謝指標(biāo)[23-25]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，模型組動(dòng)物出現(xiàn)了血清抗氧化酶活性降低、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物含量增加、皮膚老化等衰老癥狀，說(shuō)明皮膚衰老模型建立成功。本實(shí)驗(yàn)研究了黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽能有效改善衰老引起的各項(xiàng)指標(biāo)異常，但具體保護(hù)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的改善作用，結(jié)果表明黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽可以提高衰老皮膚的水分、膠原蛋白、羥脯氨酸和透明質(zhì)酸的含量，同時(shí)抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽能顯著提高血清和皮膚中SOD、CAT 和GSH-Px 的活性，抑制MDA的生成。黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽還能有效改善衰老皮膚粗糙松弛，增加皮膚膠原纖維，使其排列規(guī)則有序等，且高劑量膠原蛋白肽組的效果最好。因此本實(shí)驗(yàn)制備的黃線狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽能明顯改善D-半乳糖致衰老小鼠氧化損傷。