喹諾酮配合物材料的制備及其抗菌性能研究*

夏姣云,李瀟瀟,徐 彤,楊 燦

(長沙理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,長沙 410114)

0 引 言

癌癥是現(xiàn)代致死率最高的流行病之一。據(jù)研究,所有癌癥中有近1/5的感染源都是微生物感染,因其感染而導(dǎo)致的各種疾病,都嚴(yán)重威脅著人類健康[1-5]。細(xì)菌感染可以用抗生素治愈,這對(duì)癌癥的預(yù)防也具有重要意義。金屬配合物作為有效藥物的廣泛使用,例如癌癥治療藥物[6]、抗炎藥[7]、降糖藥或抗菌劑和診斷劑[8-9],表明金屬離子的細(xì)胞毒性可以通過適當(dāng)?shù)呐潴w選擇得到很好的控制。喹諾酮類是具有優(yōu)異配合特性的合成化合物,可作為雙齒配體、單齒配體和橋聯(lián)配體與金屬離子結(jié)合形成配合物[10-12]。喹諾酮類藥物與金屬離子的相互作用,可以獲得許多與母體喹諾酮類化合物具有同等或更強(qiáng)的抗菌活性的金屬配合物[13-15]。鉑、釕、鈷、鈀、銅和其他d-嵌段金屬離子的配合物已在醫(yī)學(xué)上廣泛應(yīng)用。但是鉑類抗癌藥物有很強(qiáng)的副作用,如周圍神經(jīng)病變、脫發(fā)和患者的骨髓毒性等。因此研究人員致力于開發(fā)可提供不同作用模式和改善抗癌活性的替代金屬藥物,而銅離子異于鉑類化合物的特殊生物活性使其脫穎而出,銅很容易在還原態(tài)Cu(Ⅰ)和氧化態(tài)Cu(Ⅱ)之間循環(huán),是生物系統(tǒng)、生命活動(dòng)甚至生物細(xì)胞成分中不可或缺的重要元素[16-17]。銅配合物的抗腫瘤活性早在幾十年前就已被報(bào)道,許多新的配合物已顯示出巨大的抗菌、抗腫瘤潛力[18-20]。銅配合物可能比鉑類藥物的副作用相對(duì)較低,并被認(rèn)為能夠克服順鉑的遺傳和獲得性耐藥性。本文選用喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星作為第一配體,苯并咪唑類化合物作為第二配體,通過微波輔助合成法合成新型三元銅配合物,并將銅配合物用于對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性測(cè)試。研究結(jié)果表明,配合物與單一的喹諾酮類抗生素具有更強(qiáng)的抗菌活性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原材料

5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑按照文獻(xiàn)[21]合成;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、牛血清白蛋白(BSA)、溴化乙錠(EB)均為生化試劑,生工生物工程(上海)股份有限公司;小牛胸腺DNA：生化試劑,索萊寶生物技術(shù)有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)：生化試劑,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)：生化試劑,上海麥克林生化科技有限公司;環(huán)丙沙星、高氯酸銅六水合物,上海麥克林生化科技有限公司;其他試劑為市售的分析試劑,實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。研究配合物與牛血清白蛋白作用時(shí),底液為含0.05 mol/L NaCl的pH值=7.2的Tris-HCl 緩沖溶液,配制的EB溶液和牛血清蛋白溶液濃度分別為1×10-3、3×10-6mol/L;研究配合物與牛血清白蛋白作用時(shí),底液為含0.05 mol/L NaCl的pH值=7.2的Tris-HCl 緩沖溶液,配制的EB溶液和牛血清蛋白溶液濃度分別為1×10-3、3×10-6mol/L。

1.2 配合物的合成

取0.3313 g(1 mmol)環(huán)丙沙星溶于10 mL水中,并用等摩爾量的NaOH中和,再加入0.2416 g(1 mmol)Cu(NO3)2·3H2O,室溫?cái)嚢?混合均勻。再將溶有0.2091 g(1 mmol)HPBM用30 mL乙醇溶解,再用(0.2 mol/L)NaOH 調(diào)節(jié)pH值至5～6,將混合溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,置于120 ℃油浴中,冷凝回流1.5 h,冷卻過濾,棄去淺綠色固體。濾液在室溫下放置,數(shù)周后有藍(lán)綠色晶體析出,乙醇重結(jié)晶,空氣中干燥后置于干燥器中保存。

圖1 化合物SF-Cu-HPBM結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the compound SF-Cu-HPBM structure

1.3 樣品的性能及表征

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)

通過FT-IR光譜儀分析樣品的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分,Nicolet iS20型,上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.3.2 元素分析儀(EA)

通過元素分析儀分析環(huán)丙沙星和SF-Cu-HPBM的元素組成和含量,Elementar UNICUBE型,德國元素-艾力蒙塔貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3.3 紫外分光光度計(jì)(UV-Vis)

通過紫外分光光度計(jì)分析環(huán)丙沙星和SF-Cu-HPBM的光吸收性能以及與小牛胸腺DNA的作用,F7000型,日本日立公司。

1.3.4 高分辨質(zhì)譜儀(ESI-MS)

通過ESI-MS測(cè)試SF-Cu-HPBM的組成,Waters G2-XS Qtof型,沃特世科技(美國)有限公司。

1.3.5 精密電導(dǎo)率儀

通過電導(dǎo)率儀分析化合物的電解質(zhì)類型,MP515-03型,上海三信儀表廠。

1.3.6 熒光分光光度計(jì)

通過熒光分光光度計(jì)分析配合物與DNA結(jié)合的方式,F7000型,美國Millipore System (Biocel) 公司。

1.3.7 烏氏粘度計(jì)

通過烏氏粘度計(jì)分析配合物與DNA的作用,PH-010A 型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物表征

2.1.1 紅外光譜分析

室溫下,測(cè)定了配體環(huán)丙沙星、及配合物SF-Cu-HPBM在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜。喹諾酮為第一配體,苯并咪唑類為第二配體的紅外分析結(jié)果見表1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)SF-Cu-HPBM配合物分別在3 474.39 cm-1出現(xiàn)吸收峰,而環(huán)丙沙星配體中未出現(xiàn),這歸因于配合物-NH2+的伸縮振動(dòng)ν—NH2+及結(jié)合水的O-H伸縮振動(dòng)峰ν—O—H。(2)環(huán)丙沙星在3 043.87 cm-1出現(xiàn)了吸收峰,這是哌嗪基上N—H的伸縮振動(dòng)v—NH,而SF-Cu-HPBM配合物分別在2979.78 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰,這是第二配體咪唑環(huán)上N-H的伸縮振動(dòng)ν—NH。(3)環(huán)丙沙星在1 613.96 cm-1(νC=O)、1 498.28 cm-1(νC—OH)、1 372.60 cm-1(νas(COO—))三處表現(xiàn)強(qiáng)的吸收峰,這歸因于羧基的C=O伸縮振動(dòng)、C—OH的伸縮振動(dòng)和COO-的對(duì)稱伸縮振動(dòng)。在配合物中并沒有出現(xiàn)—COO—的3個(gè)特征吸收峰,由于形成配合物,羧基峰特征峰向低波數(shù)方向位移,SF-Cu-HPBM配合物在1 627.25,1 461.83,1 292.23 cm-1處分別表現(xiàn)3個(gè)強(qiáng)吸收峰,分別歸屬于C=O的伸縮振動(dòng)(νC=O)、—COO—的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)νas(COO—)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)νas(COO—),這意味著第一配體環(huán)丙沙星中的羧酸基團(tuán)脫去了H離子,并通過COO-陰離子單齒與中心銅離子配位。(4)另外,SF-Cu-HPBM配合物在511.52、429.20 cm-1處分別表現(xiàn)的兩個(gè)吸收峰為Cu-O和Cu-N的伸縮振動(dòng),這進(jìn)一步表明兩種配體均與中心銅離子發(fā)生了配位。

表1 苯并咪唑類配合物與配體的紅外特征峰Table 1 Infrared characteristic peaks of benzimidazole complexes and ligands

2.1.2 元素分析

元素分析是研究有機(jī)化合物中元素組成和含量的化學(xué)分析方法。根據(jù)比較理論與實(shí)際合成化合物中C、H、N 3種元素的百分含量,來分析化合物是否與預(yù)期一致。如表2所示,配合物中各元素的實(shí)驗(yàn)測(cè)定值與計(jì)算值較為吻合,百分含量相差不大,與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 5種配合物的元素分析數(shù)據(jù)Table 2 Elemental analysis data of five complexes

2.1.3 紫外光譜分析

室溫下,測(cè)定了配合物的DMSO溶液(1×10-2～1×10-5mol/L)在200～450 nm和450～800 nm范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜。如表3所示,配合物與配體的DMSO溶液在近紫外區(qū)283.00～284.50 nm和331.50～332.00 nm處均有2個(gè)較強(qiáng)的吸收峰,這是由于配體和配合物的π→π*躍遷。研究發(fā)現(xiàn),配體和配合物最大吸收峰的位置并未發(fā)生改變,但吸收峰的強(qiáng)度卻有所減弱,這是由于金屬離子與配體配位后,氮原子的電子云密度的降低。其次,發(fā)現(xiàn)配合物在可見光區(qū)673.80 nm出現(xiàn)了配體中不含有的弱而寬的吸收峰,這是由于配合物分子中心Cu離子的d→d躍遷。

表3 配合物與配體的紫外光譜數(shù)據(jù)Table 3 UV spectral data of complexes and ligands

2.1.4 質(zhì)譜分析

室溫下,測(cè)定了配合物乙腈溶液(1×10-5mol/L)的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)。如圖2,在SF-Cu-HPBM配合物的質(zhì)譜圖中顯示,存在正離子峰m/z為604.39,推測(cè)配合物溶液中存在配離子[Cu(SF)(HPBM)]2+。

圖2 配合物的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of complexes

2.1.5 摩爾電導(dǎo)率

在室溫25 ℃下,測(cè)定配合物在甲醇和DMSO溶液中(1×10-3mol/L)的摩爾電導(dǎo)率分別為172.3和72.3 S·cm2/mol,配合物為1：2型電解質(zhì)。

2.2 新型三元銅配合物的抗菌性能

2.2.1 最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了配合物與配體對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性能,它們的體外活性數(shù)據(jù)如表4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物的抗菌活性優(yōu)于喹諾酮類抗生素配體的抑菌性能,第二配體HPBM的抑菌效果不是很明顯,而Cu(ClO4)2·6H2O也表現(xiàn)出優(yōu)異的抑菌性能。配合物SF-Cu-HPBM與環(huán)丙沙星相比,大腸桿菌(0.098 μg/mL<0.178 μg/mL)和對(duì)金黃色葡萄球菌(0.102 μg/mL<0.425 μg/mL)都有更好的活性。

表4 配合物與配體的最小抑菌濃度MICTable 4 MIC of complexes and ligands

2.2.2 抑菌效果實(shí)驗(yàn)

(1)平板涂布法

將配體、配合物藥液與菌液共同孵育4 h,平板涂布培養(yǎng)24 h后,各菌落的生長情況如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)從圖3中可以看出,相比于空白組和陰性對(duì)照組,第一配體環(huán)丙沙星組的大腸桿菌菌落明顯減少,但是仍有一些菌落分布于固體培養(yǎng)基的四周,說明第一配體對(duì)于大腸桿菌具備一定的殺菌效果,且殺菌效果良好。第二配體HPBM沒有明顯的殺菌效果。而相較于第一配體,配合物SF-Cu-HPBM將所有細(xì)菌都?xì)⑺懒?未長出任何菌落。因此喹諾酮類為第一配體、苯并咪唑類為第二配體的新型三元銅配合物對(duì)大腸肝菌的抑菌性能明顯高于單一的喹諾酮抗生素;(2)從圖4中可以看出,相比于空白組和陰性對(duì)照組,環(huán)丙沙星組金黃色葡萄球菌菌落有所減弱,但抑菌效果不是很完全,HPBM配體也幾乎未顯現(xiàn)出抑菌性能,而合成的SF-Cu-HPBM配合物抑制了所有菌落的生長。因此喹諾酮類為第一配體、苯并咪唑類為第二配體的新型三元銅配合物對(duì)金黃色葡萄球菌也達(dá)到了很好的抑菌效果。

圖3 喹諾酮-銅-苯并咪唑類配合物、配體對(duì)大腸桿菌的生長情況的影響圖：(a)為空白對(duì)照組;(b)為陰性對(duì)照組;(c)為配體HPBM組;(d)為環(huán)丙沙星(SF)組;(e)為喹諾酮-銅-苯并咪唑類(SF-Cu-HPBM)組Fig.3 Effect of quinolone-copper-benzimidazolium complexes and ligands on the growth of E.coli Figure：(a) blank control group;(b) negative control group;(c) ligand HPBM group;(d) ciprofloxacin (SF) group;(e) quinolone-copper-benzimidazolium complex (SF-Cu-HPBM) group

(2)抑菌圈

采用濾紙片法研究了各配體及銅配合物(20 μg/mL)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果,結(jié)果以抑菌圈直徑來表示。每個(gè)培養(yǎng)皿都放置了相應(yīng)的配體與配合物,更直觀的比較配合這一作用方式,是否能夠在喹諾酮抗生素抗菌活性的基礎(chǔ)上得到提高。如圖5(a)和 (b)所示,明顯看出,配合物4位上的抑菌圈直徑明顯大于1位上的,抑菌效果明顯提高,與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 新型三元銅配合物與DNA的相互作用

2.3.1 DNA紫外滴定分析

紫外滴定分析法應(yīng)用廣泛,操作簡便,是探究生物大分子(DNA/蛋白質(zhì))與過渡金屬離子之間的相互作用的有力手段,不僅能夠判斷兩者之間的作用模式,還能夠準(zhǔn)確地表征作用強(qiáng)度。當(dāng)配合物與DNA作用,雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,則會(huì)產(chǎn)生增色效應(yīng);若配合物與DNA作用,而導(dǎo)致分子構(gòu)象變化,則會(huì)產(chǎn)生紅移和減色效應(yīng),作用越強(qiáng)減色效果越明顯。

由圖6可知,配合物、配體與DNA作用均產(chǎn)生明顯的紅移和減色效應(yīng)。這可能歸因于配合物插入DNA堿基對(duì)中,發(fā)生電子堆積,配合物作用配體的π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生耦合,能級(jí)下降,產(chǎn)生π→π*躍遷。如圖6(a)所示,隨著DNA濃度的升高,苯并咪唑類為第二配體的配合物SF-Cu-HPBM在277 nm處產(chǎn)生了33.66%的減色;如圖6(b)所示,環(huán)丙沙星在273.5 nm處產(chǎn)生了8.03%的減色效應(yīng)。新型三元銅配合與DNA的作用明顯高于單一的喹諾酮類化合物。配合物、配體與DNA作用的大小為SF-Cu-HPBM>環(huán)丙沙星。配合物、配體與DNA作用的紫外光譜數(shù)據(jù)見表5。

圖6 配合物、配體與DNA相互作用的紫外光譜圖：(a)為SF-Cu-HPBM與的DNA相互作用的紫外光譜圖;(b)為SF與的DNA相互作用的紫外光譜圖;(a)(b)兩圖中,曲線1為游離的待測(cè)樣品的吸收曲線,曲線2-12為不同DNA濃度下的吸收光譜Fig.6 UV spectra of the interaction between the complexes,ligands and DNA：(a) the UV spectra of the interaction between SF-Cu-HPBM and the DNA;(b) the UV spectra of the interaction between SF and the DNA;(a) (b) in both figures,curve 1 is the absorption curve of the free sample to be tested,and curves 2-12 are the absorption spectra at different DNA concentrations

2.3.2 EB競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)分析

溴化乙錠(EB)是一種因其物理性質(zhì)和生物活性而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的熒光化合物。它是一種具有抗病毒特性的錐蟲染料,可插入核酸雙螺旋區(qū)域的相鄰堿基對(duì)之間。通過嵌入,EB的熒光量子產(chǎn)率顯著提高,它與DNA形成的體系在可見光區(qū)顯示出光學(xué)活性。當(dāng)DNA-EB體系被DNA-待測(cè)物體系所替代,EB從DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中游離出來,熒光被猝滅。利用這種方法進(jìn)一步研究兩者之間的相互作用。

由圖7可知,在僅有待測(cè)樣品或DNA時(shí),在332 nm的激發(fā)光下,580～600 nm處都沒有熒光產(chǎn)生。而DNA-EB體系在580～600 nm處顯示出熒光,這說明EB已經(jīng)嵌入DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中。隨著待測(cè)樣品的不斷加入,DNA-EB體系的熒光強(qiáng)度明顯減弱,這說明了DNA-EB體系被DNA-待測(cè)物體系所替代,待測(cè)樣品與DNA很可能是通過經(jīng)典插入模式相結(jié)合。

2.3.3 牛血清蛋白實(shí)驗(yàn)分析

熒光分析是評(píng)價(jià)金屬配合物與牛血清白蛋白相互作用的一種有效方法。許多蛋白質(zhì)的特征熒光都主要由色氨酸貢獻(xiàn)。在牛血清白蛋白中,熒光發(fā)射強(qiáng)度取決于兩個(gè)色氨酸側(cè)鏈134和212在極性溶劑中的暴露程度。銅配合物的加入能夠使BSA體系熒光產(chǎn)生規(guī)律性猝滅,觀察BSA最大發(fā)射峰的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象,可以進(jìn)一步分析待測(cè)樣品與BSA的作用關(guān)系。從圖8中可以看出,隨著配合物與配體的加入,BSA的熒光強(qiáng)度都發(fā)生了不同程度的猝滅。

圖8 配合物、配體與BSA作用的熒光譜圖：(a)為SF-Cu-HPBM與BSA作用的熒光譜圖,曲線1為BSA的熒光曲線,曲線2-8為向BSA中逐次加入等量DMSO溶解的配合物待測(cè)樣品濃度(濃度控制為10～150 μmol/L)的吸收曲線;(b)為SF與BSA作用的熒光譜圖,曲線1為BSA的熒光曲線,曲線2-8為向BSA中逐次加入等量DMSO溶解的配體待測(cè)樣品濃度(濃度控制為10-150 μmol/L)的吸收曲線Fig.8 Fluorescence spectra of the interaction between the ligands and BSA：(a) shows the fluorescence spectra of SF-Cu-HPBM with BSA,curve 1 shows the fluorescence curve of BSA,curves 2-8 show the absorption curves of the concentration of the ligand to be tested (concentration control 10-150 μmol/L) by adding equal amount of DMSO to BSA one at a time;(b) shows the fluorescence spectra of SF with BSA fluorescence spectra,curve 1 is the fluorescence curve of BSA,and curves 2-8 are the absorption curves of the concentration of the ligand to be tested (concentration controlled as 10-150 μmol/L) by adding equal amount of DMSO to BSA one at a time

圖9和表6是配合物、配體與BSA相互作用的熒光變化趨勢(shì)和光譜數(shù)據(jù),更直觀的闡明了各種化合物與BSA的作用強(qiáng)度。根據(jù)Stern-Volmer方程計(jì)算得出各種配合物、配體與BSA作用的Ksv,配合物與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)Ksv為2.36×105M-1,明顯高出第一配體環(huán)丙沙星與BSA的結(jié)合力3.85×103M-1,表明BSA在承擔(dān)藥物分子血液運(yùn)輸?shù)冗^程中,更易與配合物產(chǎn)生作用,抵達(dá)靶細(xì)胞。

表6 配合物、配體與BSA相互作用的熒光光譜數(shù)據(jù)Table 6 Fluorescence spectrum data of complexes,ligands and BSA interactions

圖9 不同濃度化合物下BSA體系熒光的變化趨勢(shì)Fig.9 Variation trend of fluorescence in BSA system under different concentrations of compounds

3 結(jié) 論

(1)成功合成了喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星為第一配體、苯并咪唑類化合物為第二配體的銅離子配合物。配合物可能的分子式為：[Cu(SF)(HPBM)](NO3)2·1.5H2O。

(2)結(jié)合紅外光譜、紫外光譜、電噴霧質(zhì)譜、元素分析以及摩爾電導(dǎo)率的測(cè)試結(jié)果表明,喹諾酮類配體是通過4-位羰基氧原子、3-位羧基氧原子與銅離子配位,苯并咪唑類配體是通過芳香雜環(huán)上的兩個(gè)氮原子與銅離子配位,配合物性質(zhì)穩(wěn)定、性能優(yōu)異。

(3)將新型三元銅配合物,用于對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性測(cè)試,發(fā)現(xiàn)配合物比單一的喹諾酮類抗生素具有更強(qiáng)的抗菌活性。

(4)通過研究新型三元銅配合物與小牛胸腺DNA的作用及DNA-EB競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn),證明了配合物以經(jīng)典插入模式與DNA結(jié)合。并且在牛血清蛋白實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)配合物與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合常數(shù)為2.36×105M-1,第一配體環(huán)丙沙星與BSA的結(jié)常數(shù)為3.85×103M-1,明顯看出配合物與BSA的結(jié)合能力高于與配體與BSA的結(jié)合能力,表明BSA在承擔(dān)藥物分子血液運(yùn)輸?shù)冗^程中,更易與配合物產(chǎn)生作用,抵達(dá)靶細(xì)胞。