高效液相色譜法測定冷面、米線中乙二胺四乙酸二鈉

丁梅

（梅河口市食品藥品檢驗檢測中心，吉林梅河口 135000）

目前真空包裝的冷面、米線等加工食品因食用方便、特色美味而深受廣大消費者的青睞，逐漸成為人們尤其是年輕人的主食之一。因為冷面、米線水分含量大且營養(yǎng)豐富，非常適合微生物生長繁殖，容易引起發(fā)霉變質(zhì)，影響保質(zhì)期，所以冷面、米線保質(zhì)期短是阻礙其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最大瓶頸。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規(guī)定，乙二胺四乙酸二鈉食品添加劑可作為穩(wěn)定劑、凝固劑、抗氧化劑、防腐劑，在果醬、果脯、腌漬的蔬菜、堅果與籽類罐頭、雜糧罐頭、復合調(diào)味料、飲料等食品中限量使用，但不允許在面粉制品和大米制品中使用[1]。然而，乙二胺四乙酸二鈉因具有良好的抗氧化和防腐作用，可有效延緩酶觸褐變，延長保質(zhì)期，經(jīng)常被部分不法商販超范圍使用在面粉及其制品中，以提高產(chǎn)品的感官品質(zhì)[2-6]，因此，以小麥粉、大米粉為原料加工的冷面和米線存在較大的安全風險，需建立冷面、米線中乙二胺四乙酸二鈉的測定方法，以便對其進行風險監(jiān)控和評估。

乙二胺四乙酸二鈉的測定方法主要有液相色譜法[2-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]，目前研究方向主要是針對番茄醬、腌漬蔬菜、各種罐頭等食品以及藥用注射液中乙二胺四乙酸二鈉的測定。國家標準GB 5009.278—2016[14]和 行 業(yè) 標 準SN/T 3855—2014[15]的適用范圍也不包括于冷面和米線樣品測定。采用高效液相色譜法測定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二鈉的含量雖然有文獻[2-6]報道，但其多采用三氯甲烷凈化或用陰離子(PXA)固相萃取柱凈化，前處理過程復雜。筆者根據(jù)冷面、米線樣品中含有大量淀粉，但其不含或少含色素和油脂的基質(zhì)特性，在國家標準方法和文獻[4,6]的基礎(chǔ)上，采用高速冷凍離心的凈化方式，建立了冷面、米線中乙二胺四乙酸二鈉的高效液相色譜測定方法。該方法操作簡單快速，回收率、重復性均滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求[16]，為冷面、米線中乙二胺四乙酸二鈉的檢測提供了技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

渦旋混合器：300～3 500 r/min，重載數(shù)顯型，上海安譜科學儀器有限公司。

超聲波清洗器：KQ-500DE型，江蘇昆山市超聲儀器有限公司。

高速冷凍離心機：KH20R-Ⅱ型，湖南凱達科學儀器有限公司。

甲醇：色譜純，美國飛世爾科學世界公司。

四丁基溴化銨、乙酸鈉：優(yōu)級純，上海安譜實驗科技股份有限公司。

磷酸、鹽酸：優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司。

三氯化鐵：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司。

乙二胺四乙酸二鈉標準物質(zhì)：純度(質(zhì)量分數(shù))為99.96%，標物編號為GBW(E) 060025，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

若記439nm、445nm、460nm…2209nm這45個指標的值分別為X1、X2、X3… X45,兩個主成分PC1、PC2的得分記為y1、y2,綜合得分記作y綜。利用表達式y(tǒng)=ZX×t,得到兩個主成分各自的得分y1、y2,再將這兩個主成分的得分值以各自對應(yīng)特征值的方差貢獻率求和,既得到主成分的綜合得分,即

微孔濾膜： wwPTFE 膜，孔徑為0.2 μm，φ13 mm，美國頗爾公司。

冷面、米線樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Shimpack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津制作所)；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL；流動相：四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液(pH 4.0)-甲醇(85∶15，體積比，下同)，流量為1.0 mL/min。

1.3 溶液配制

四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液：稱取6.45 g四丁基溴化銨、2.46 g 乙酸鈉，加入1 000 mL 水，超聲溶解，加入磷酸調(diào)節(jié)pH 至4.0±0.1，經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過濾后備用。

三氯化鐵溶液：稱取0.54 g 三氯化鐵，溶于90 mL 水中，加入0.10 mL 鹽酸，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用水定容至標線，混勻。

乙二胺四乙酸二鈉標準溶液：1 mg/mL，準確稱取乙二胺四乙酸二鈉標準品10 mg，用水溶解并定容至10 mL。

乙二胺四乙酸二鈉系列標準工作溶液：準確吸取乙二胺四乙酸二鈉標準溶液25、100、250、500、2 500 μL 于50 mL 比色管中，加入水25 mL、三氯化鐵溶液1.0 mL，渦旋混勻1 min，超聲20 min，加水定容至標線，配制成乙二胺四乙酸二鈉的質(zhì)量濃度分別為0.5、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的系列標準工作溶液。

1.4 樣品處理

稱取冷面或米線樣品5.0 g 于50 mL 具塞離心管中，加入25 mL 水，渦旋1 min，超聲20 min，于4 ℃下以9 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液于50 mL 比色管中。剩余殘渣重復提取一次，離心后合并上清液，加水定容至50 mL。吸取5 mL上清液于15 mL離心管中，加入0.5 mL三氯化鐵溶液，渦旋混勻1 min，超聲20 min，于4 ℃下以9 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液過0.22 μm 濾膜，作為樣品溶液。

1.5 樣品測定

將乙二胺四乙酸二鈉系列標準工作溶液分別注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的色譜峰面積，以標準工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。將樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，根據(jù)標準工作曲線得到待測樣品溶液中乙二胺四乙酸二鈉的質(zhì)量濃度，再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)，計算樣品中乙二胺四乙酸二鈉的含量，以質(zhì)量分數(shù)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱與流動相選擇

乙二胺四乙酸二鈉是極性很強的化合物，在普通C18色譜柱上基本無保留，若選擇使用普通C18色譜柱，必須使用含離子對試劑的流動相進行洗脫，以增加乙二胺四乙酸二鈉在C18色譜柱上的保留時間；或者選擇使用SAX強陰離子交換色譜柱，以含磷酸二氫鉀緩沖液的流動相洗脫。由于C18色譜柱的普及性和通用性均較好，同時考慮到配制離子對試劑流動相和配制磷酸鹽緩沖液流動相的難易程度相當，所以選擇以Shimpack VP-ODS C18色譜柱分離。參考國家標準方法GB 5009.278—2016，以四丁基溴化銨-乙酸鈉混合溶液-甲醇(體積比為85∶15)為流動相等度洗脫，乙二胺四乙酸二鈉色譜保留時間、色譜峰形、響應(yīng)值均滿足檢測要求。乙二胺四乙酸二鈉標準溶液的色譜圖如圖1所示。

2.2 樣品處理方法優(yōu)化

GB 5009.278—2016 方法的適用檢測對象不包括冷面和米線樣品，若以該標準方法處理冷面和米線樣品，采用過混合陰離子(PXA)固相萃取柱凈化，很容易發(fā)生固相萃取柱堵塞。另外經(jīng)實驗證實，采用過固相萃取柱的凈化方式，冷面、米線加標樣品(加標量為100 mg/kg)的回收率均小于20%。其主要原因是冷面、米線樣品中含大量淀粉基質(zhì)，在堵塞萃取小柱的同時，阻礙乙二胺四乙酸二鈉的洗脫，即用國標方法規(guī)定的5%甲酸-甲醇水溶液5 mL 無法完全將乙二胺四乙酸二鈉洗脫下來，從而造成回收率偏低。根據(jù)冷面和米線樣品中不含或少含色素和油脂的基質(zhì)特性，樣品經(jīng)水提取，再用三氯化鐵絡(luò)合，采用在4 ℃下以9 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min的凈化方式，能有效去除樣品基質(zhì)干擾。采用該處理方法分別對冷面、米線加標樣品(加標量100 mg/kg)進行測定，加標回收率均在90%以上，滿足檢測要求?？瞻桌涿妗⒓訕死涿鏄悠飞V圖分別如圖2、圖3所示。

圖3 加標冷面色譜圖

2.3 線性方程與檢出限

在1.2儀器工作條件下，分別對乙二胺四乙酸二鈉系列標準工作溶液進行測定，以乙二胺四乙酸二鈉的質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。乙二胺四乙酸二鈉的質(zhì)量濃度在0.5～50 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=33 620.783 29x-19 773.734 48，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

在空白冷面和空白米線中加入低濃度的乙二胺四乙酸二鈉標準溶液，按1.2儀器工作條件測定并計算信噪比，分別以3倍、10倍信噪比對應(yīng)的樣品中乙二胺四乙酸二鈉的質(zhì)量分數(shù)為方法檢出限、定量限，得冷面、米線樣品中乙二胺四乙酸二鈉檢出限均為1.5 mg/kg，定量限均為5 mg/kg。

2.4 加標回收與精密度試驗

按三個濃度水平在空白冷面、米線樣品中加入乙二胺四乙酸二鈉標準溶液，按1.4方法制備成加標樣品溶液，進行樣品回收試驗。對每個添加水平平行測定6 次，結(jié)果見表1。由表1 可知，乙二胺四乙酸二鈉的加標回收率為90.7%～103.5%，測定結(jié)果的相對標準偏差為1.2%～5.0% (n=6)，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》對精密度、回收率的要求。

表1 冷面、米線樣品加標回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

國家標準方法GB 5009.278—2016 適用于果醬、果脯、腌漬的蔬菜罐頭、蔬菜泥(醬)、堅果與籽類罐頭、八寶粥罐頭、復合調(diào)味料、飲料等基質(zhì)樣品中乙二胺四乙酸二鈉的測定，在國標方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了樣品處理方法，建立了適合冷面、米線基質(zhì)樣品的乙二胺四乙酸二鈉分析方法，是國標方法的有力補充。該方法操作簡單、快速，準確度、重現(xiàn)性好，為冷面、米線中乙二胺四乙酸二鈉的測定提供了方法依據(jù)和技術(shù)支持。