高效液相色譜-管碟法聯(lián)合分析牛黃解毒片中抑菌物質(zhì)黃芩苷、甘草苷

張偉

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇淮安 223300）

中醫(yī)藥是我國的民族瑰寶和獨(dú)特的醫(yī)療衛(wèi)生資源，具有豐富完善的理論體系和天人合一的哲學(xué)內(nèi)涵，尤其在近年的疫情中發(fā)揮著中流砥柱的作用[1]。然而，鑒于中藥處方藥材多、成分復(fù)雜等原因，中藥中發(fā)揮藥效成分的物質(zhì)基礎(chǔ)一直模糊不清，這已成為中藥現(xiàn)代化與國際化發(fā)展道路上的瓶頸[2]。近年來，中藥功效成分研究的理念不斷創(chuàng)新，研究的技術(shù)日趨成熟，并涌現(xiàn)出很多的研究成果，諸如王靜等[3]對(duì)枸杞功效成分研究，馮敬騫等[4]對(duì)衢枳殼功效成分研究，賈傳青等[5]對(duì)條芩與枯芩的功效成分研究，以及劉久石等[6]對(duì)藁本類藥材功效成分研究等。而牛黃解毒片的功效成分研究成果尚未見報(bào)道。

牛黃解毒片處方中有8味藥材[7]，甘草和黃芩是重要的兩味藥材。唐金蓉等[8]對(duì)黃芩和劉秀麗等[9]對(duì)甘草研究可知，黃芩與甘草均具有抑菌功效，但研究人員未對(duì)其抑菌成分進(jìn)一步研究。而在檢查微生物限度時(shí)，亦發(fā)現(xiàn)牛黃解毒片具有抑菌效果，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抑制作用。魯倩等[10]研究發(fā)現(xiàn)黃芩中野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等具有抑菌作用；韓維維等[11]研究發(fā)現(xiàn)甘草中黃酮類化合物具有抑菌作用。筆者以黃芩和甘草中的黃酮類化合物黃芩苷、甘草苷為目標(biāo)抑菌物質(zhì)，運(yùn)用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)牛黃解毒片中的物質(zhì)進(jìn)行有效分離，然后用管碟法測(cè)定出牛黃解毒片的抑菌活性，最后借助指紋圖譜與灰色關(guān)聯(lián)度[12]分析方法，對(duì)12批不同廠家的牛黃解毒片中黃芩苷、甘草苷兩種抑菌成分進(jìn)行分析測(cè)定，不僅證明了牛黃解毒片中的黃芩與甘草兩味藥材具有抑菌作用，而且進(jìn)一步得出黃芩苷與甘草苷是牛黃解毒片中的兩種抑菌成分；同時(shí)，與試管二倍稀釋法和K-B 紙片法[13]相比，管碟法還可以直觀反映出牛黃解毒片的抑菌效果。該方法可為牛黃解毒片的功效成分研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters2695/2489 型，美國Waters公司。

電 子 天 平：(1)XP6 型，感 量 為0.01 mg；(2)XS205型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KH7200DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-LS-75SLL 型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

生化培養(yǎng)箱：SPX-300-Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：G2X-GF101-3BS 型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀：ZY-300IV 型，北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司。

甘草苷、黃芩苷對(duì)照品：批號(hào)分別為111610-201607、110715-201821，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為93.1%、95.4%，中國食品藥品檢定研究院。

金黃色葡萄球菌：編號(hào)為CMCC(B) 26003，江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院。

牛黃解毒片樣品：12 批，編號(hào)分別為S1～S12，分別來自12個(gè)不同的生產(chǎn)廠家。

阿莫西林膠囊樣品：1批，市售。

甲醇、乙腈：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

磷酸：分析純，上海久億化學(xué)試劑有限公司。

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

培養(yǎng)基：平板計(jì)數(shù)與抗生素檢定專用Ⅰ號(hào)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 HPLC法

色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪科馬科技有限公司)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm[14]；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的磷酸溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，流量為1.0 mL/min，按表1 程序進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 管碟法

將培養(yǎng)皿置于37.0 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 溶液制備

1.3.1 HPLC法

樣品溶液A：取牛黃解毒片10片(包衣片除去包衣)，研細(xì)，取約2.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入水50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率為400 W，頻率為40 kHz) 30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

黃芩苷、甘草苷對(duì)照品溶液：分別取黃芩苷對(duì)照品、甘草苷對(duì)照品約1 mg，精密稱定，分別置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，即得。

1.3.2 管碟法

樣品溶液B：取牛黃解毒片(包衣片除去包衣)適量，研細(xì)，取約2.5 g，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，加入經(jīng)滅菌處理的磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)適量，溶解，超聲處理(功率為400 W，頻率40 kHz) 30 min，放冷，加入經(jīng)滅菌處理的磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)至標(biāo)線，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

阿莫西林對(duì)照溶液：取阿莫西林膠囊內(nèi)容物適量，研勻，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入滅菌水溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置于200 mL 容量瓶中，加入經(jīng)滅菌處理的磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)稀釋至標(biāo)線，搖勻，即得。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

首先用高效液相色譜法建立牛黃解毒片的指紋圖譜，獲取牛黃解毒片中化學(xué)成分信息；然后用管碟法對(duì)牛黃解毒片進(jìn)行抑菌性分析，獲取牛黃解毒片的功效信息；最后運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度法將牛黃解毒片中的化學(xué)信息與功效信息聯(lián)系起來分析出其中的抑菌性成分。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC法

2.1.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

參考文獻(xiàn)[14]，分別設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為237、260、280 nm，利用色譜峰測(cè)定牛黃解毒片，結(jié)果顯示在280 nm波長(zhǎng)下黃芩苷的響應(yīng)值最大，其色譜峰面積是237 nm 波長(zhǎng)條件下峰面積的2.74 倍，是260 nm波長(zhǎng)條件下黃芩苷峰面積的1.80 倍，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

對(duì)牛黃解毒片的提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別將樣品超聲處理30、40、50、60 min。結(jié)果表明，黃芩苷色譜峰面積在30 min時(shí)達(dá)到最大，故選擇超聲處理30 min的提取方法。

2.1.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取編號(hào)為S4 樣品，平行制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見表2。由表2 可知，黃芩苷與甘草苷保留時(shí)間測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.7%和0.9%，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.6%和0.9%，表明方法重現(xiàn)性良好。

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品溶液A，分別于室溫下放置0、2、6、12、18、20、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。黃芩苷與甘草苷的色譜峰面積測(cè)量數(shù)據(jù)列于表3。由表3可知，甘草苷與黃芩苷色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.8%、1.3%，表明樣品溶液A 在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 指紋圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)

取編號(hào)分別為S1～S12 的牛黃解毒片樣品，按照1.3.1樣品溶液A制備方法制備樣品溶液，然后分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。選取S12 樣品的色譜圖作為對(duì)照指紋圖譜(R)，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012 年版)建立指紋圖譜(見圖1)，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，與對(duì)照指紋圖譜相比，12 個(gè)廠家的牛黃解毒片HPLC 圖譜整體峰形一致，相似度均不低于0.937 (見表4)。表明不同廠家的牛黃解毒片成分差異較小，具有較好的一致性。

圖1 12批牛黃解毒片HPLC指紋圖譜

表4 12批牛黃解毒片相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.1.5 共有峰指認(rèn)與相對(duì)峰面積

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012年版)軟件，設(shè)置時(shí)間窗口為0.1 min，選擇指紋圖譜中峰形較好的色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，采用中位數(shù)法生成圖譜，同時(shí)結(jié)合對(duì)照品的HPLC圖譜，指認(rèn)出1#共有峰為甘草苷，2#共有峰為黃芩苷(見圖2)。

圖2 牛黃解毒片、黃芩苷對(duì)照品、甘草苷對(duì)照品液相色譜圖

采用Waters2695/2489 高效液相色譜儀數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)2 個(gè)共有峰進(jìn)行積分，計(jì)算各個(gè)峰相對(duì)色譜峰面積(色譜峰面積/取樣質(zhì)量)，結(jié)果見表5。

2.2 管碟法

2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

取第Ⅱ代金黃色葡萄球菌放置至室溫，移至生物安全柜中，用接種環(huán)取適量至10 mL 的生理鹽水試管中，用生理鹽水稀釋至10 倍體積，取稀釋液1 mL 至平皿中，加入20 mL 新鮮的平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，凝固后移至生化培養(yǎng)箱中于32 ℃培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)，菌液濃度為2.7×107cfu/mL。

2.2.2 抑菌試驗(yàn)

取滅菌的抗生素鑒定用培養(yǎng)基Ⅰ號(hào)200 mL，加入0.12 mL的第Ⅱ代金黃色葡萄球菌菌液，混勻，取20 mL加入平皿中，冷卻凝固，在培養(yǎng)基表面放置牛津杯。分別向牛津杯中加入樣品溶液B與阿莫西林對(duì)照溶液，置于培養(yǎng)箱中于37.0 ℃培養(yǎng)24 h[15-16]。抑菌效果如圖3所示。

采用抑菌圈掃描儀，測(cè)定抑菌圈直徑，按照式(1)計(jì)算相對(duì)抑菌活性：

式中：RA——樣品的相對(duì)抑菌活性；

Ax——樣品的抑菌圈面積；

ms——阿莫西林對(duì)照品質(zhì)量；

mx——樣品質(zhì)量；

As——阿莫西林對(duì)照品的抑菌圈面積。

12批樣品相對(duì)抑菌活性計(jì)算結(jié)果見表6。

表6 12批牛黃解毒片抑菌作用測(cè)定結(jié)果

2.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析

參考文獻(xiàn)[17]、[18]，采用均值法處理表5與表6的原始數(shù)據(jù)，對(duì)各個(gè)數(shù)據(jù)歸一化。將變換后的相對(duì)抑菌活性數(shù)據(jù)記為參考數(shù)列Y(k)，其中k=1，2，3……n，指紋圖譜黃芩苷與甘草苷峰相對(duì)峰面積記為比較數(shù)列Xi(k)，其中i=1，2，3……n，則絕對(duì)差計(jì)算公式為△i(k)=|Y(k)-Xi(k)|，i表示指紋圖譜中共有峰編號(hào)(i=1，2，3……n)；關(guān)聯(lián)系數(shù)按式(2)計(jì)算：

式中：ρ——分辨系數(shù)，ρ=0.5。

計(jì)算12 批樣品中黃芩苷與甘草苷色譜峰的關(guān)聯(lián)系數(shù)，12 批樣品關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值作為關(guān)聯(lián)度，結(jié)果列于表7。由表7可知，黃芩苷與甘草苷的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，表明兩組分與抑菌活性有關(guān)聯(lián)性[19]。

表7 2個(gè)共有峰關(guān)聯(lián)系數(shù)與關(guān)聯(lián)度結(jié)果

3 結(jié)語

采用高效液相色譜法和管碟法對(duì)牛黃解毒片中的抑菌性功效成分進(jìn)行定性檢測(cè)，通過灰色關(guān)聯(lián)度法將牛黃解毒片中的化學(xué)物質(zhì)信息與功效信息關(guān)聯(lián)分析，科學(xué)準(zhǔn)確地分析出牛黃解毒片中2 種抑菌性化學(xué)物質(zhì)——黃芩苷和甘草苷。該方法以水為提取溶劑，更接近牛黃解毒片在人體中發(fā)揮抑菌作用的環(huán)境，所提取的物質(zhì)亦類似于人體中發(fā)揮藥效的物質(zhì)成分。但由于水為極性溶劑，一些非水溶性成分如黃芩素?zé)o法提取分離，也未能考察其抑菌活性。該法簡(jiǎn)便、直觀、科學(xué)、準(zhǔn)確，可以為牛黃解毒片功效成分研究以及具有抑菌功效的中藥研究提供方法參考。