寧波市2022 年新報(bào)告HIV-1 感染者毒株基因型及耐藥研究

顧文珍 劉昱慧 譚詩文 王蓉 張姝 倪紅霞

寧波市疾病預(yù)防控制中心病毒研究所，寧波 315010

HIV 可分為HIV-1 和HIV-2 兩型，HIV-1 型是艾滋病的主要流行型，呈全球性流行趨勢(shì)。HIV-2 型主要在非洲少數(shù)國(guó)家呈局限性流行，根據(jù)ENV 基因核酸序列差異，HIV-1 型可以分為M、N 和O 3 個(gè)組， A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 和K 11 個(gè)亞型。 2015年全國(guó)第4 次HIV 分子流行病學(xué)調(diào)查顯示， 我國(guó)HIV 流行株基因亞型呈現(xiàn)更加復(fù)雜和多樣化特征，同時(shí)出現(xiàn)了多種流行重組型(circulating recombinant form, CRF)和獨(dú)特重組型(unique recombinant form,URF)[1], 主要流行亞型為CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC 和B 亞型。

HAART 能夠有效地控制HIV 感染率， 降低患者病死率， 于此同時(shí)HAART 加速耐藥株的產(chǎn)生與傳播，耐藥毒株能降低抗病毒藥物的有效性，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗，發(fā)病率和死亡率增加[2]。 寧波市自1990 年首次在勞務(wù)輸出漁民中發(fā)現(xiàn)HIV 感染者以來，報(bào)告病例數(shù)量不斷增加，年齡分布跨度大。 本研究通過分析寧波市2022 新報(bào)告年HIV-1 感染者的人口學(xué)特征， 病毒基因亞型分布和原發(fā)性耐藥情況，為寧波市HIV-1 疾病預(yù)防和檢測(cè)治療提供科學(xué)依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2022 年1—12 月寧波市新報(bào)告HIV-1 感染者，獲知情同意書并采集全血樣本。 流行病學(xué)信息來源于國(guó)家疫情網(wǎng)絡(luò)直報(bào)系統(tǒng)。 該研究通過寧波市疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)研究倫理審查（審查號(hào)為202304）。

二、核酸提取及PCR 擴(kuò)增

2022 年新報(bào)告感染者初次隨訪檢測(cè)時(shí)抽取4～8 mL 乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA) 抗凝全血， 全血樣本離心收集血漿分裝后于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?采用DNA/RNA 提取試劑盒從200 μL 血漿樣本中提取RNA。 逆轉(zhuǎn)錄后巢式PCR擴(kuò)增HIV-1 的pol基因蛋白酶(全長(zhǎng))和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(前300 個(gè)氨基酸位點(diǎn))， 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 316 bp。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)［3］，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker 比對(duì)確認(rèn)是否含目的片段，目標(biāo)產(chǎn)物送至杭州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

三、基因亞型及耐藥性分析

使用Sequencher 5.0 軟件對(duì)測(cè)序返回的序列進(jìn)行拼接和編輯， 使用BioEdit 7.2.0 軟件將樣本序列和國(guó)際參考株序列(來自美國(guó)Los Alamos 國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的HIV 序列數(shù)據(jù)庫) 進(jìn)行比對(duì)和校正， 用Mega 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)， 選擇Kimura 2-parameter 模型(Bootstrap=1 000)， 系統(tǒng)進(jìn)化樹確定HIV 毒株亞型。 將整理好的序列提交美國(guó)斯坦福大學(xué)HIV 耐藥數(shù)據(jù)庫(https://hivdb.stanford.edu/) 在線進(jìn)行HIV 耐藥相關(guān)突變分析。

四、序列重組和傳播簇分析

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析， 未能與已知的亞型和CRFs 聚類的序列考慮為URF，采用美國(guó)Los Alamos國(guó)家實(shí)驗(yàn)室HIV 序列數(shù)據(jù)庫RIP 重組分析工具和jpHMM-HIV 分析重組類型， 并使用SimPlot3.5.1 軟件進(jìn)一步復(fù)核。 傳播簇定義：系統(tǒng)進(jìn)化樹中分簇的Bootstrp≥90%， 簇內(nèi)樣本數(shù)≥2， 簇內(nèi)平均基因距離≤0.015。

結(jié)果

一、基本情況

2022 年寧波市新報(bào)告HIV-1 感染者628 例，收集抗凝血樣本560 份， 成功獲得核酸序列478 例，有完整流行病學(xué)資料426 例。 男性占82.2%（350/426）； 漢族占95.3%（406/426）； 年齡≥40 歲占52.6%（224/426）；文化程度初中占32.9%（140/426），大專及以上占25.4%（108/426）； 已婚有配偶占43.0%（183/426），未婚占36.2%（154/426），離異或喪偶占18.5%（79/426）；異性傳播占56.3%（240/426），同性傳播占43.4%（185/426），母嬰傳播1 例；職業(yè)中農(nóng)民/工人占比最高為36.0%（153/426），其次為家政/家務(wù)及待業(yè)占27.5%（117/426）。

二、序列亞型分析

426 例HIV-1 感染者的核酸序列包括15 個(gè)基因亞型，優(yōu)勢(shì)基因型為CRF07_BC（42.0%，179/426）和CRF01_AE （30.5%，130/426)， 其次依次為URF(01_AE/07_BC) (7.0%，30/426)、CRF 08_BC（6.6%，28/426)、CRF 55_01B （4.9% ，21/426)、CRF85_BC（2.3%，10/426）、B (2.1%，9/426)、C （1.9%，8/426)、URF(B/C) (0.7%，3/426)、URF (01_AE/C)（0.5%，2/426）、URF (01_AE/B) （0.5% ，2/426）、CRF59_01B（0.2%，1/426）、CRF64_BC （0.2%，1/426）、CRF67_B（0.2%，1/426）和A1（0.2%，1/426）。 詳見圖1。

三、序列重組分析

使用在線工具jpHMM 及RIP 對(duì)37 例URF 進(jìn)行重組分析：URF(01_AE/07_BC) 30 例、URF (B/C) 3例、URF (01_AE/C)和URF (01_AE/B) 各2 例。 流行病學(xué)資料顯示：37 例病例中34 例為男性，22 例有非婚異性接觸史，16 例為男男同性傳播， 部分病例同性性行為人數(shù)較多， 最多高達(dá)10 人。 其中22NB243 和22NB429 為男男性伴侶，22NB243 是傳染源， 22NB530 和22NB717 為男男性伴侶。

四、傳播簇分析

本次研究共發(fā)現(xiàn)40 個(gè)傳播簇， 成簇樣本數(shù)占樣本數(shù)比最高的3 個(gè)基因型為： CRF08_BC 占50.0%（14/28），CRF07_BC 占36.9%（66/179），URF(01_AE/07_BC) 占30.0%(9/30)。 CRF08_BC 有4 個(gè)傳播簇， 共14 個(gè)病例， 最大傳播簇有7 個(gè)病例；CRF07_BC 有20 個(gè)傳播簇，共66 個(gè)病例，最大傳播簇有12 個(gè)病例；URF (01_AE/07_BC) 有2 個(gè)傳播簇， 共9 個(gè)病例， 最大傳播簇有7 個(gè)病例。 URF(01_AE/07_BC)傳播簇分析，該傳播簇有7 例病例，5例為寧波市北侖區(qū)MSM 人群。

五、耐藥傳播分析

將pol區(qū)序列提交至美國(guó)斯坦福大學(xué)HIV 耐藥數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，426 例樣本中27 例存在耐藥突變，治療前總體耐藥率為6.3% (27/426)。 對(duì)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)、核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs) 和蛋白酶抑制劑(PIs) 的耐藥率分別為3.8%(16/426)、1.9%(8/426)和0.9% (4/426)。含有高度耐藥相關(guān)的突變有21 例， 總體高度耐藥比例達(dá)到4.9%（21/426），均為針對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑相關(guān)耐藥。與NNRTIs 相關(guān)耐藥位點(diǎn)中， 占比較高的有K103N（0.9%，4/426）、G190S（0.9%，4/426）和K101E（0.7%，3/426）； 與NRTIs 相關(guān)耐藥位點(diǎn)中， 占比較高的有M184V（0.9%，4/426）。1 例對(duì)NRTIs 和NNRTIs 都存在耐藥位點(diǎn)，包括184V、T215I 和Y181C 突變；1 例對(duì)NNRTIS 存在K103S 和G109A 兩個(gè)位點(diǎn)突變。具體耐藥位點(diǎn)和藥物見表1。

表1 寧波市2022 新報(bào)告HIV 感染者抗病毒治療前耐藥率和耐藥位點(diǎn)（n=426）

討論

pol基因編碼聚合酶前體蛋白，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H 等，由于逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏3'→5'外切酶活性, 使得HIV 在復(fù)制的過程中不能校正錯(cuò)誤摻入的單核苷酸, 從而表現(xiàn)出易錯(cuò)傾向,使得HIV 產(chǎn)生高度變異，有非常復(fù)雜的基因型和重組基因型。 目前全球流行的HIV 有11 種基因亞型和130 多種CRF 以及幾十種URF，HIV 的進(jìn)化和傳播已經(jīng)導(dǎo)致全球HIV-1 亞型、CRF 及URF出現(xiàn)地域化分布特征[4-6]。

一、寧波市HIV 呈多種基因亞型并存且新的亞型不斷出現(xiàn)

寧波市HIV 流行形勢(shì)不斷變化，新的亞型從不同國(guó)家和地區(qū)傳入，寧波市流行的基因型也呈現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化特點(diǎn)。2010 年寧波市僅監(jiān)測(cè)到5 種基因亞型， 未檢測(cè)到URF， 具體包括CRF01_AE（44.4%)、CRF07_BC（25.0%）、CRF 08_BC（11.1%）、C(11.1%）和B(8.4%)，而2012 年中國(guó)URF 的占比僅為4.4%[7]。 2022 年寧波市監(jiān)測(cè)到15 種基因亞型，URF 占比高達(dá)8.7%， 以CRF01_AE 為重組結(jié)構(gòu)模式的URF 為主占7.0%， 基因分型較其他省市更多樣化和復(fù)雜化，與曹棟卿等[8]對(duì)2018—2019 年浙江省紹興市研究結(jié)論相似。 楊介者等[9]報(bào)道2015 年浙江省HIV 流行基因以CRF07_BC 和CRF01_AE 為主，CRF07_BC 超過CRF01_AE 成占比最高的基因型，以及以CRF01_AE 為重組模式結(jié)構(gòu)的URF 呈上升趨勢(shì)。袁子焰等[10]分析了1990—2020 年間亞洲地區(qū)HIV-1 基因型的流行特征， 發(fā)現(xiàn)B 亞型和CRF01_AE 亞型已經(jīng)是東亞地區(qū)的主要流行類型?？梢婋S著HIV-1 流行時(shí)間的推移和傳播途徑的多樣化，寧波市HIV-1 呈現(xiàn)多種基因亞型并存且新的重組亞型不斷出現(xiàn)特點(diǎn)，給艾滋病防控工作帶來極大挑戰(zhàn)。

CRF07_BC 是寧波市最高比例的基因型，有20個(gè)傳播簇，涉及寧波市每個(gè)區(qū)縣。 建議對(duì)新報(bào)告病例及時(shí)進(jìn)行分型及分子網(wǎng)絡(luò)分析，與基因庫中傳播簇比較，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和快速應(yīng)對(duì)新近出現(xiàn)或擴(kuò)大的傳播簇， 對(duì)高危行為人群及接觸者干預(yù)和溯源調(diào)查，從源頭上控制傳染病發(fā)生發(fā)展。 CRF 55_01B 起源于廣東省MSM 人群， 然后迅速在全國(guó)各地流行，2018 年全國(guó)31 個(gè)省份均監(jiān)測(cè)到CRF 55_01B[11]，浙江省首例CRF 55_01B 毒株是2011 年在MSM 人群中發(fā)現(xiàn)的， 傳播方式也由MSM 人群同性傳播擴(kuò)散到異性傳播， 雙性戀男性在CRF 55_01B 傳播和擴(kuò)散中起了重要作用[12]。 寧波市2022 年共監(jiān)測(cè)到21例CRF 55_01B 病例，20 例男性病例，10 例為男男同性性傳播。 1 株CRF59_01 亞型毒株與深圳市發(fā)現(xiàn)的CRF59_01 亞型毒株序列高度相似，為96.5%；1 株CRF64_BC 亞型毒株與北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)的CRF64_BC 亞型毒株相似度為 97% 、1 株CRF67_01B 亞型毒株與深圳地區(qū)發(fā)現(xiàn)的CRF67_01B 相似度為97.86%；1 株A1 亞型毒株與北京發(fā)現(xiàn)的A1 亞型毒株相似度為95.38%，對(duì)于新發(fā)現(xiàn)基因型需要連續(xù)關(guān)注，防止繼續(xù)滲透?jìng)鞑ァ?/p>

二、 寧波市2022 年新報(bào)告病例URF 基因型與國(guó)內(nèi)一些地區(qū)的序列相似度高

寧波市2022 年有4 個(gè)URF， 主要為URF(01_AE/07_BC)， 即CRF01_AE 與07_BC 發(fā)生二代重組，國(guó)內(nèi)多個(gè)城市均有URF(01_AE/07_BC)病例報(bào)道，且已經(jīng)在人群中廣泛流行[6,13-16]，由于寧波地區(qū)主要流行基因型為CRF01_AE 與07_BC，同時(shí)存在多種亞型共流行及復(fù)雜的傳播網(wǎng)絡(luò)，容易造成亞型混合感染， 繼而導(dǎo)致基因重組并產(chǎn)生新的URF，再傳播給其他個(gè)體。 URF(01_AE/07_BC)有2 個(gè)傳播簇，其中1 個(gè)傳播簇中的22NB717 毒株與深圳發(fā)現(xiàn)的URF(01_AE/07_BC)亞型毒株有97%相似度；另1個(gè)傳播簇的22NB243 毒株與深圳發(fā)現(xiàn)的URF(01_AE/07_BC) 亞型毒株有95.94%同源性；URF(01_AE/C) 亞型毒株2022 NB227 與石家莊發(fā)現(xiàn)的URF (01_AE/C) 亞型毒株相似度為96%。 URF(01_AE /B)22NB408 亞型毒株與深圳發(fā)現(xiàn)的URF(01_AE /B) 亞型毒株相似度為97%；URF (B/C)NB462 與云南發(fā)現(xiàn)URF (B/C) 亞型毒株相似度為96%。寧波市發(fā)現(xiàn)的URF 主要與深圳等發(fā)達(dá)地區(qū)及昆明HIV 高發(fā)地區(qū)序列相似度較高。

三、 寧波市2022 年新報(bào)告病例治療前處于中度耐藥

HIV 是一種RNA 逆轉(zhuǎn)錄病毒， 其RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶具有復(fù)制能力卻沒有校正功能。 在藥物的選擇壓力下，HIV 更易出現(xiàn)變異，產(chǎn)生耐藥突變，這是導(dǎo)致HIV 耐藥的根本因素[17]。本文耐藥檢測(cè)結(jié)果顯示，寧波市2022 年報(bào)告HIV 感染者治療前耐藥率為6.3%(27/426) ，處于中度耐藥，低于重慶市2014—2017 新確診HIV 感染者耐藥率[18]。出現(xiàn)頻率較高的耐藥突變位點(diǎn)是M184V、K103N、G190S、K101E 和V106M，與臺(tái)州市2016—2018 年研究相似[19]。 這些位點(diǎn)均可引起對(duì)NRTIs 類藥物的高水平耐藥，NRTIs 類藥物是 《中國(guó)艾滋病診療指南(2021 版)》[1]一線推薦用藥, 廣泛使用增加了耐藥毒株產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。 2021 年WHO HIV 耐藥監(jiān)測(cè)指南建議每3 年進(jìn)行一次全國(guó)性治療前耐藥調(diào)查， 以便實(shí)時(shí)掌握HIV的耐藥情況并指導(dǎo)治療。

綜上所述， 寧波市2022 年新報(bào)告HIV 感染者毒株呈現(xiàn)復(fù)雜化和多樣化特點(diǎn)，治療前耐藥處于中度水平。 建議加強(qiáng)加大及時(shí)對(duì)新報(bào)告病例分子分型，強(qiáng)化流行病學(xué)及社會(huì)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)查和干預(yù)，并進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)新報(bào)告病例治療前耐藥檢測(cè)和優(yōu)選敏感治療方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明顧文珍：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作、數(shù)據(jù)采集、分析和撰寫論文； 劉昱慧：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作，數(shù)據(jù)分析；譚詩文：數(shù)據(jù)采集和分析；王蓉：實(shí)驗(yàn)操作和序列分析； 張姝、倪紅霞：行政支持、研究指導(dǎo)、工作支持