三合飲對AS模型小鼠主動脈斑塊形成的影響及其作用機(jī)制的實驗研究

黃超嵐,譚露南,盛曉生,吳 杰,許維東

(金華市人民醫(yī)院·浙江 金華 321015)

冠心病患病人數(shù)多、病死率高,對公眾健康危害重大[1]。動脈粥樣硬化(AS)是冠心病的主要病理基礎(chǔ),而炎癥反應(yīng)貫穿AS的各個階段,期間巨噬細(xì)胞的活化致使AS斑塊甚至機(jī)體處于微炎癥狀態(tài),而且巨噬細(xì)胞還可導(dǎo)致斑塊破裂[2-3];因此,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞可能是延緩AS進(jìn)展、增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性的重要途徑之一。NOD樣受體蛋白3(NLRP3)是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白復(fù)合體,研究報道,NLRP3炎癥小體可促進(jìn)斑塊局部炎癥反應(yīng)、易損和破裂,而抑制其活化可阻滯AS進(jìn)展[4]。疏肝通陽、活血滌痰法是冠心病的中醫(yī)治法,三合飲為依此法組方的治療冠心病經(jīng)驗方,可明顯減少冠心病患者胸痛發(fā)作頻率,長期服用可延緩病情進(jìn)展[5]。本研究將從NLRP3炎癥小體角度,分析三合飲穩(wěn)定AS斑塊的潛在機(jī)制,為臨床冠心病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-)43只,同遺傳背景普通C57BL/6J小鼠11只,雄性,8周齡,體質(zhì)量18～22 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2021-0006。

1.1.2 實驗藥物 三合飲:方由柴胡10 g,赤芍、炒枳殼、瓜蔞皮、法半夏各12 g,降香、薤白各9 g,丹參15 g,炙甘草6 g組成;上述中藥由桐君堂提供,加水煎煮2次合并煎液。阿托伐他汀鈣片:大連輝瑞制藥公司,國藥準(zhǔn)字H20051407。

1.1.3 試劑 高脂飼料和普通飼料均購自睿迪生物科技(深圳)有限公司,貨號D12108C;小鼠白細(xì)胞介素(IL-18、IL-1β)ELISA試劑盒:江蘇酶免實業(yè)有限公司,貨號MM-0169M2、MM-0040M2;免疫熒光共定位一抗NOD樣受體蛋白3(NLRP3):美國Invitrogen公司,貨號PA5-79740;一抗巨噬細(xì)胞抗體2(MOMA-2):美國Abcam公司,貨號ab33451。

1.1.4 實驗儀器 iMark酶標(biāo)儀:美國Bio-Rad公司;FV3000型激光共聚焦顯微鏡:日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 AS模型的建立 所有小鼠以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨后43只ApoE-/-小鼠用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)10周,建立AS模型,11只普通C57BL/6J小鼠以普通飼料喂養(yǎng)。10周結(jié)束時,ApoE-/-小鼠和普通C57BL/6J小鼠各處死3只,判斷造模是否成功。小鼠主動脈斑塊顯著增多,根部管壁增厚,提示AS模型構(gòu)建成功。

1.2.2 動物分組與給藥 40只AS模型小鼠隨機(jī)分為AS組,三合飲低、中、高劑量組和阿托伐他汀組,每組8只,另取8只普通C57BL/6J小鼠作正常對照組。三合飲低、中、高劑量組分別以7.5、15.0、30.0 g/kg三合飲藥液灌胃,每日1次,阿托伐他汀組以3 mg/kg阿托伐他汀鈣片藥液灌胃,每日1次,正常組和AS組予等量生理鹽水替代,連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.2.3.1 油紅O染色評估小鼠主動脈斑塊面積 末次給藥后禁食不禁水24 h,腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉小鼠快速分離全心臟及主動脈根部,制備主動脈竇切片,行油紅O染色,陽性染色即為斑塊,以主動脈竇部橫切面斑塊面積占主動脈管腔面積的百分比表示斑塊大小。取整條主動脈固定后縱向剖開,行油紅O染色大體拍照,與主動脈大體面積比值百分比來代表主動脈大體斑塊面積大小。

1.2.3.2 血清IL-18、IL-1β檢測 末次給藥后禁食不禁水24 h麻醉小鼠摘眼球取血,分離血清樣本,采用雙抗夾心ELISA檢測IL-18、IL-1β水平,參照試劑盒說明書操作。

1.2.3.3 免疫熒光檢測主動脈NLRP3和MOMA-2表達(dá)和共定位情況 取主動脈竇切片,置于破膜液處理30 min,再放入3%雙氧水孵育30 min,然后滴加牛血清白蛋白工作液,孵育30 min,滴加1∶100一抗NLRP3、MOMA-2抗體,4 ℃下孵育過夜,滴加熒光二抗,37 ℃避光反應(yīng)30 min,再避光DAPI染色10 min,最后添加放淬滅劑封片,于激光共聚焦顯微鏡下觀測NLRP3、MOMA-2表達(dá)和共定位情況。

2 結(jié)果

2.1 三合飲對AS小鼠主動脈斑塊形成的影響 與正常組比較,AS組小鼠主動脈竇斑塊橫斷面面積占比明顯增加(P<0.05);與AS組比較,三合飲低、中、高劑量組和阿托伐他汀組斑塊橫斷面面積占比明顯減少(P<0.05),以三合飲高劑量組減少最顯著。見表1。與正常組比較,AS組小鼠全主動脈斑塊面積占比明顯增加(P<0.05);與AS組比較,三合飲低、中、高劑量組和阿托伐他汀組斑塊面積占比明顯減少(P<0.05),以三合飲高劑量組減少最顯著。見表1。

表1 各組小鼠主動脈斑塊的比較

2.2 三合飲對AS小鼠血清IL-18、IL-1β水平的影響 見表2。

表2 各組小鼠血清IL-18、IL-1β水平比較

2.3 三合飲對AS小鼠主動脈根部NLRP3和MOMA-2表達(dá)的影響 與正常組比較,AS組小鼠主動脈根部NLRP3、MOMA-2及共表達(dá)熒光活性明顯升高(P<0.05);與AS組比較,三合飲中、高劑量組和阿托伐他汀組NLRP3、MOMA-2及共表達(dá)熒光活性明顯降低(P<0.05),以三合飲高劑量組降低最顯著。見表3。

表3 各組小鼠主動脈根部NLRP3和MOMA-2表達(dá)的比較

3 討論

冠心病在中醫(yī)學(xué)屬于“胸痹”“心痛”等范疇,病位雖在心,然子病及母,心病則肝氣往往不疏,又母病及子,肝郁氣滯則血行不暢阻礙“心主血脈”,故臨證強(qiáng)調(diào)“治心必調(diào)肝,肝氣通則心氣和”及“祛瘀化痰之時,不忘疏通胸陽之本”,因此提出“疏肝通陽、活血滌痰”法這一“雙心同治”之法[6-7]。三合飲是程志清教授治療冠心病的自擬經(jīng)驗方,以“四逆散”“瓜蔞薤白半夏湯”“丹參飲”三方合用,具有疏肝氣、通心陽,活血滌痰疏痹的功效[8]。臨床應(yīng)用證實,三合飲可明顯減少冠心病患者胸痛發(fā)作頻率,改善抑郁狀態(tài),長期服用還可有效延緩AS進(jìn)展[9],但相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚。

AS斑塊形成是AS最具特征性的病變,其中不穩(wěn)定斑塊是導(dǎo)致急性心血管事件的重要因素,此類斑塊具有脂質(zhì)核心大且柔軟、炎性細(xì)胞浸潤增多、纖維帽少而薄及可見潰瘍等特征;其中巨噬細(xì)胞是斑塊內(nèi)重要的炎性因素,可刺激多種炎性因子向斑塊內(nèi)趨化、聚集,而且還可促進(jìn)脂質(zhì)堆積[10-11];因此,調(diào)控斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞活性、減少炎癥和脂質(zhì)含量,是穩(wěn)定AS斑塊的有效途徑。MOMA-2是單核巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物,其表達(dá)水平可反映巨噬細(xì)胞活性[12]。本研究免疫熒光檢測結(jié)果顯示,三合飲可明顯降低AS小鼠主動脈MOMA-2表達(dá),提示三合飲可增加AS小鼠主動脈斑塊穩(wěn)定性,與臨床研究結(jié)果[5]相符。

NLRP3炎癥小體是最具代表性的炎癥小體,在外界刺激下,NLRP3與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白結(jié)合,促進(jìn)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1成熟,進(jìn)一步切割下游IL-18、IL-1β因子前體,誘導(dǎo)其成熟與分泌,促進(jìn)AS病變,導(dǎo)致斑塊破裂[13-14]。據(jù)報道,通過阻滯NLRP3炎癥小體,可減輕炎癥病變,發(fā)揮抗AS的作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示,三合飲各劑量組血清IL-18、IL-1β水平和主動脈根部NLRP3表達(dá)明顯低于AS組,提示三合飲可調(diào)控NLRP3炎癥小體,減少下游炎癥因子IL-18、IL-1β表達(dá),減輕相關(guān)炎癥反應(yīng)。同時,促炎因子IL-18、IL-1β大量表達(dá),也是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移、浸潤、增殖等過程的重要因子。本研究共定位檢測結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞上NLRP3表達(dá)經(jīng)三合飲處理后明顯減少,進(jìn)一步說明三合飲可調(diào)節(jié)NLRP3表達(dá)、減少巨噬細(xì)胞,從而穩(wěn)定AS斑塊。

綜上所述,疏肝通陽、活血滌痰法冠心病驗方三合飲可調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定AS斑塊,可能與抑制NLRP3表達(dá)有關(guān)。中醫(yī)在穩(wěn)定AS斑塊方面具有整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢,但中藥方中生物活性成分眾多,三合飲是否還存在其他的抗AS機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。