漢防己甲素對支氣管哮喘小鼠氣道重塑的影響及機制探討

王生成　李琪　蔡瀟陽　唐詠婕

摘要：目的 探究漢防己甲素對支氣管哮喘小鼠氣道重塑及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信號通路的影響。方法 構(gòu)建支氣管哮喘小鼠模型，將建模成功的40只小鼠隨機分為模型組，漢防己甲素低（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組和地塞米松（10 mg/kg）組，每組10只。另取10只小鼠不建模作為對照組。各組小鼠給予相應(yīng)干預(yù)2周。ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-1β水平；蘇木素-伊紅染色觀察肺組織病理學(xué)變化并進行肺損傷評分；測定小鼠支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度；熒光定量PCR（qPCR）和蛋白印跡法（Western blot）檢測肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果 對照組小鼠肺組織支氣管無病理損傷。與對照組相比，模型組小鼠支氣管管壁及平滑肌增厚，黏膜上皮增生、皺襞增多，管腔縮小，氣管內(nèi)黏液滲出明顯；血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，肺損傷評分，支氣管管壁及支氣管平滑肌厚度，HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，漢防己甲素低、高劑量組小鼠肺組織病變程度逐漸減輕，血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，肺損傷評分，支氣管管壁及支氣管平滑肌厚度，HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達水平依次降低（P＜0.05）；漢防己甲素高劑量組和地塞米松組小鼠各項指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 漢防己甲素可減輕支氣管哮喘小鼠氣道重塑程度和炎性因子水平，保護肺組織，其機制可能與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：粉防己堿；哮喘；氣道重塑；HMGB1蛋白質(zhì)；Toll樣受體4；NF-κB

中圖分類號：R562.25，R349.6文獻標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20222063

Effect and mechanism of tetrandrine on airway remodeling in bronchial asthma mice

WANG ShengchengLI Qi CAI Xiaoyang TANG Yongjie

1 Department of Respiratory Medicine， Danzhou People's Hospital， Danzhou 571700， China;

2 Department of Respiratory Medicine， the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College

Corresponding Author E-mail： lqlq198210@sina.com

Abstract： Objective To investigate the effect of tetrandrine on airway remodeling and high mobility group protein box 1 （HMGB1）/Toll-like receptor 4 （TLR4）/nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway in bronchial asthma mice. Methods A mouse model of bronchial asthma was established， and 40 model mice were randomly divided into the model group， the tetrandrine low dose （20 mg/kg） group， the high dose （40 mg/kg） group and the dexamethasone （10 mg/kg） group， with 10 mice in each group. Another 10 mice without modeling were useed as the control group. Each group was given corresponding intervention for 2 weeks. Serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL-6） and IL-1β were determined by ELISA. Hematoxylin-eosin staining was used to observe lung histopathological changes， and lung injury score was performed. The thickness of bronchial tube wall and bronchial smooth muscle were determined. Expression levels of HMGB1， TLR4， NF-κB mRNA and protein in lung tissue were detected by fluorescence quantitative PCR （qPCR） and Western blot assay. Results No pathological damage was found in bronchus of lung tissue in the control group. Compared with the control group， the bronchial tube wall and smooth muscle of lung tissue in the model group were thickened， mucosal epithelium hyperplasia， and lumen shrank and tracheal mucus exudated significantly. Serum levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β， lung injury score， bronchial wall thickness， bronchial smooth muscle thickness， HMGB1， TLR4， NF-κB mRNA and protein expression levels were increased significantly （P＜0.05）. Compared with the model group， the degree of lung lesions was gradually reduced in the low and high dose tetrandrine groups， and serum levels of TNF-α， IL-6， IL-1β， lung injury scores， bronchial wall and bronchial smooth muscle thickness， HMGB1， TLR4， NF-κB mRNA and protein expression were successively decreased. There were no significant differences in above indexed between the tetrandrine high dose group and the dexamethasone group （P＞0.05）. Conclusion Tetrandrine can reduce the degree of airway remodeling and the level of inflammatory factors in mice with bronchial asthma， and protect lung tissue， which may be related to the inhibition of HMGB1/TLR4/NF-κB signal pathway.

Key words： tetrandrine; asthma; airway remodeling; HMGB1 protein; Toll-like receptor 4; NF-kappa B

支氣管哮喘是一種由氣道平滑肌細胞、上皮細胞、嗜酸性粒細胞等多種細胞參與的呼吸道炎癥疾?。?］。由于氣道炎癥遷延不愈，導(dǎo)致組織增生，氣道重塑；而氣道重塑的發(fā)生會進一步引起不可逆的氣道阻塞，使得哮喘變得更加難以治愈［2］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box 1，HMGB1）是一種內(nèi)源性炎性因子，由壞死細胞或巨噬細胞等在炎癥刺激下釋放，釋放出細胞外可以激發(fā)免疫反應(yīng)或參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［3］。Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）是一種免疫識別受體，可參與炎癥的啟動和調(diào)節(jié)過程［4］。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與TLR4結(jié)合可激活核因子κB（NF-κB）炎癥通路，引起下游的炎性因子釋放［5］。HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑方面發(fā)揮重要作用［6］。漢防己甲素又稱粉防己堿，是一類具有良好生物活性的天然雙芐基四氫異喹啉生物堿，具有抗炎效果［7］。研究表明，漢防己甲素能有效改善塵肺患者的臨床癥狀和肺通氣功能，減輕炎癥反應(yīng)，改善病情［8］。但漢防己甲素可否通過HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮對哮喘的治療效果尚不明確。本研究分析漢防己甲素對支氣管哮喘小鼠氣道重塑及HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響，以期為支氣管哮喘的臨床防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只SPF級BALB/c小鼠（雌雄各半），6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自四川橫豎生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2021-0007，小鼠飼養(yǎng)于溫度為24 ℃±2 ℃、相對濕度為65%±3%、12 h光暗交替的飼養(yǎng)房中，自由飲食。本研究經(jīng)儋州市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號：DYLS2022-5-4）。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 漢防己甲素（原料藥，純度≥99.5%）購自西安飛達生物技術(shù)有限公司；地塞米松片購自廣東華南藥業(yè)集團有限公司；卵清蛋白（OVA）、氫氧化鋁、HE染色試劑盒、PCR試劑盒、蛋白檢測試劑盒均購自雅安普萊美生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、Trizol試劑、蛋白裂解液、ECL發(fā)光液均購自深圳靈賦拓普生物科技有限公司；兔源HMGB1、TLR4、NF-κB、GAPDH一抗，羊抗兔二抗均購自武漢時勝生物科技有限公司。超聲霧化器（型號JWS-CWN）、顯微鏡（型號XSZ-107）均購自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司；酶標(biāo)儀（型號K3-PLus）、熒光定量PCR（qPCR）儀（型號MA-1640Q）、凝膠成像系統(tǒng)（型號WD-9413B）均購自杭州比格飛序生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及分組給藥 采用OVA致敏法構(gòu)建支氣管哮喘小鼠模型［9］。各組小鼠于第1、14天腹腔注射致敏液（20 μg OVA和1 mg氫氧化鋁溶于0.2 mL生理鹽水），第20天開始使用超聲霧化器用3%OVA生理鹽水噴霧激發(fā)小鼠哮喘發(fā)作，噴霧每日1次，每次30 min，連續(xù)7 d，小鼠出現(xiàn)腹肌痙攣、呼吸加快、站立不穩(wěn)等現(xiàn)象提示建模成功［10］。將建模成功的40只小鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組，漢防己甲素低（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組［11］和地塞米松（10 mg/kg）組［12］，每組10只。另取10只小鼠作為對照組，以等量生理鹽水代替致敏液和噴霧，重復(fù)同樣實驗操作。

漢防己甲素低、高劑量組小鼠分別給予20、40 mg/kg漢防己甲素灌胃給藥［11］（將漢防己甲素以生理鹽水溶解成濃度分別為2、4 g/L的混懸液，灌胃體積10 mL/kg）；地塞米松組小鼠給予10 mg/kg地塞米松灌胃給藥［12］（將地塞米松片以生理鹽水溶解濃度為1 g/L的混懸液，灌胃體積10 mL/kg）；模型組和對照組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃。各組給藥每日1次，連續(xù)2周。

1.2.2 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平 給藥結(jié)束24 h后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠，腹主動脈取血，4 ℃、4 700 r/min離心14 min，取上層血清。ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.2.3 標(biāo)本采集 采血后處死小鼠，分離肺組織，切取左肺組織和部分支氣管，4%多聚甲醛固定，切取部分右肺組織凍存于液氮中。

1.2.4 HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化及肺損傷評分 將左肺組織于4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石臘包埋，切片（厚度5 μm），HE染色，光鏡下觀察。同時根據(jù)肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、中性粒細胞浸潤、肺泡內(nèi)充血沉積4項指標(biāo)病理變化情況進行肺損傷評分［13］：每項指標(biāo)0～4分，無明顯變化記0分，輕度變化記1分，中度變化記2分，重度變化記3分，嚴(yán)重變化記4分，總分為16分。肺損傷評分總分為4項指標(biāo)評分之和。每只小鼠取3張切片，每張切片隨機選取6個視野觀察，記錄肺損傷評分，取平均值。

1.2.5 支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度測定 取1.2.4中HE染色的肺組織切片，置于光鏡下觀察，挑選有完整橫斷面的支氣管進行測量，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別測量肺組織中支氣管基底膜周徑（Pbm）、支氣管管壁總面積（Wat）、支氣管平滑肌面積（Wam）。根據(jù)上述測量指標(biāo)計算支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度。支氣管管壁厚度（μm）=Wat/Pbm，支氣管平滑肌厚度（μm）=Wam/Pbm，以這2個指標(biāo)代表小鼠氣道重塑程度，比值越大，表明氣道重塑程度越高。

1.2.6 qPCR檢測肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達水平 取1.2.3中小鼠右肺組織，Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qPCR法檢測HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達水平，內(nèi)參基因為GAPDH。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，緩沖液5 μL，dNTPs 4 μL，上、下游引物各1 μL，DNA聚合酶1 μL，ddH2O 16 μL，共30 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物由湖北逸摯誠生物科技有限公司合成，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA相對表達量。

1.2.7 蛋白印跡法檢測肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平 取1.2.3中小鼠右肺組織，勻漿后加入蛋白裂解液提取總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒定量總蛋白。取適量蛋白，上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入兔源HMGB1（1︰620）、TLR4（1︰550）、NF-κB（1︰750）、GAPDH（1︰720）一抗，4 ℃下孵育過夜，再加入羊抗兔二抗（1︰1 700），室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯色。以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件進行灰度值分析，計算目標(biāo)蛋白相對表達量（目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值之比）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平變化 與對照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，漢防己甲素低、高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平依次降低（P＜0.05）；漢防己甲素高劑量組和地塞米松組上述3項指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 各組肺組織病理學(xué)改變及肺損傷評分變化 HE染色顯示，對照組小鼠支氣管管壁完整、平滑肌厚度正常、黏膜平整，基層細胞排列整齊；模型組小鼠支氣管管壁及平滑肌厚度明顯增厚，黏膜上皮增生、皺襞增多，管腔縮小，氣管內(nèi)黏液滲出明顯；漢防己甲素低、高劑量組的上述病理學(xué)變化程度逐漸減輕；漢防己甲素高劑量組與地塞米松組小鼠肺組織病理學(xué)變化相近；見圖1。

對照組、模型組、漢防己甲素低劑量組、漢防己甲素高劑量組、地塞米松組小鼠肺損傷評分分別為（0.00±0.00）、（9.95±0.87）、（6.37±0.52）、（3.06±0.45）、（3.20±0.42）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=10，F(xiàn)=508.567，P＜0.01）。與對照組相比，模型組小鼠肺損傷評分升高（P＜0.05）；與模型組相比，漢防己甲素低、高劑量組小鼠肺損傷評分依次降低（P＜0.05）；漢防己甲素高劑量組與地塞米松組小鼠肺損傷評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組支氣管管壁和平滑肌厚度改變 與對照組相比，模型組小鼠支氣管管壁及平滑肌厚度增厚（P＜0.05）；與模型組相比，漢防己甲素低、高劑量組支氣管管壁及平滑肌厚度依次降低（P＜0.05）；漢防己甲素高劑量組與地塞米松組支氣管管壁及平滑肌厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 漢防己甲素對肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達水平的影響 與對照組相比，模型組小鼠肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，漢防己甲素低、高劑量組小鼠肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達水平依次降低（P＜0.05）；漢防己甲素高劑量組與地塞米松組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

2.5 漢防己甲素對肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平的影響 與對照組相比，模型組小鼠肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，漢防己甲素低、高劑量組小鼠的肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平依次降低（P＜0.05）；漢防己甲素高劑量組與地塞米松組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表5。

3 討論

3.1 支氣管哮喘小鼠模型的建立 支氣管哮喘會引發(fā)肺功能進行性損傷和下降，最終導(dǎo)致氣道阻塞，這一系列變化被稱為氣道重塑［14］。氣道重塑是引起氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性的重要機制，是影響哮喘反復(fù)發(fā)作及肺功能進行性下降的重要因素［15］。因此，有效緩解哮喘氣道重塑反應(yīng)在支氣管哮喘的治療中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，肺損傷評分增加，支氣管管壁及支氣管平滑肌厚度增厚。病理學(xué)結(jié)果顯示，對照組小鼠肺組織支氣管無病理損傷；模型組小鼠肺組織支氣管管壁及平滑肌厚度明顯增厚，黏膜上皮增生、皺襞增多，管腔縮小，氣管內(nèi)黏液滲出明顯。提示建模成功的小鼠炎性因子增多且氣道發(fā)生重塑。

3.2 漢防己甲素對支氣管哮喘的保護作用 漢防己甲素是中藥漢防己的提純物，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等多重功效，臨床常應(yīng)用于治療關(guān)節(jié)痛、肺纖維化、矽肺等疾?。?6］。Song等［17］研究發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素可抑制肺巨噬細胞中的NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎癥小體來減輕矽肺病的癥狀。Jiao等［18］研究表明，漢防己甲素通過抑制NF-κB和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2途徑，改善高氧誘導(dǎo)的新生大鼠肺損傷。本研究結(jié)果顯示，漢防己甲素處理后的支氣管哮喘小鼠肺組織病變程度減輕，血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，肺損傷評分，支氣管管壁厚度，支氣管平滑肌厚度降低，且漢防己甲素劑量越高，改善效果越明顯。由此表明漢防己甲素能降低支氣管哮喘小鼠炎性因子水平，改善氣道重塑程度。

3.3 漢防己甲素可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路保護支氣管哮喘小鼠肺組織 HMGB1/TLR4/NF-κB是促成炎癥損傷的重要信號通路，作為應(yīng)激信號，HMGB1可通過與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體、TLR4等受體識別結(jié)合，激活NF-κB等信號通路，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［19］。樸穎等［20］研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路可減輕OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘豚鼠的氣道炎癥。Zhang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，維生素D通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路減輕哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)和肺組織中的細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘小鼠肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達升高；漢防己甲素處理后的支氣管哮喘小鼠肺組織中三者mRNA和蛋白表達降低，且漢防己甲素劑量越高效果越明顯。表明漢防己甲素可抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路，結(jié)合樸穎等［20-21］的研究結(jié)果，筆者認為漢防己甲素可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路保護支氣管哮喘小鼠肺組織。

綜上所述，漢防己甲素可減輕支氣管哮喘小鼠氣道重塑程度和炎性因子水平，保護肺組織，其機制可能與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的激活有關(guān)。但本研究僅限于動物實驗，與臨床應(yīng)用還有很大差距。

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（2023-01-16收稿 2023-03-16修回）

（本文編輯 李鵬）