miR-155通過調(diào)控PKG1影響滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能并參與子癇前期的機(jī)制探討

岳巾晶　曾瑩　郭曉珮　董越　姬若楠　彭瑞　羅曉華

摘要：目的 探究miR-155和環(huán)磷酸鳥苷依賴性蛋白激酶1（PKG1）在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)及miR-155在核因子（NF）-κB的介導(dǎo)下通過抑制PKG1對滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo功能的影響。方法 收集剖宮產(chǎn)分娩的正常產(chǎn)婦（NPE組）以及子癇前期產(chǎn)婦（PE組）的胎盤各20個，體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo，分為NC組、mimics組、inhibitor組、siRNA NC組、PKG1 siRNA組、siRNA+inhibitor組；用NF-κB抑制劑PDTC處理細(xì)胞，分為Control組、PDTC組、PDTC+NC組、PDTC+mimics組。采用qPCR檢測胎盤和滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中miR-155和PKG1 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測PKG1蛋白的表達(dá)；分別采用CCK-8法、Transwell法、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡能力。結(jié)果 PE組胎盤組織中miR-155的表達(dá)升高，而PKG1的表達(dá)降低（P＜0.05）。體外實(shí)驗(yàn)表明，與NC組相比，miR-155 mimics組中PKG1的表達(dá)降低，滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、增殖能力減弱，凋亡能力增強(qiáng)，miR-155 inhibitor組中PKG1表達(dá)則升高，滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、增殖能力增強(qiáng)，凋亡能力減弱（P＜0.05）；與Control組相比，PDTC組miR-155的表達(dá)降低，滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、增殖能力增強(qiáng)，凋亡能力減弱（P＜0.05）。結(jié)論 miR-155在子癇前期中表達(dá)上調(diào)，并且可在NF-κB的介導(dǎo)下通過下調(diào)PKG1影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡。

關(guān)鍵詞：先兆子癇；細(xì)胞運(yùn)動；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；NF-κB；miR-155；PKG1；滋養(yǎng)細(xì)胞

中圖分類號：R714.244文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221869

MiR-155 affects the biological functions of trophoblastic cells through regulating

cGMP-dependent kinase 1 and is involved in the mechanism of preeclampsia

YUE JinjingZENG Ying GUO Xiaopei DONG YueJI Ruonan PENG Rui LUO Xiaohua

1 Department of Gynaecology and Obstetrics， 2 Department of Scientific Research Office， the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450000， China

Corresponding Author E-mail： Luoxiaohua620@163.com

Abstract： Objective To investigate the expression levels of miR-155 and cGMP-dependent protein kinase 1 （PKG1） in placental tissue of patients with preeclampsia， and the effect of miR-155 on the function of trophoblasts HTR-8/SVneo by inhibiting PKG1 under the mediation of nucleus factor kappa B （NF-κB）. Methods Twenty placentas were collected from normal pregnant women and pre-eclampsia pregnant women who delivered by cesarean section. In vitro trophoblasts HTR-8/SVneo were cultured and? divided into the NC group， the? mimics group， the inhibitor group， the siRNA NC group， the PKG1 siRNA group and the siRNA+inhibitor group. Cells were treated with NF-κB inhibitor PDTC and divided into the control group， the PDTC group， the PDTC+NC group and the PDTC+mimics group. Real-time quantitative polymerase chain reaction （qPCR） was performed to detect the expression of miR-155 and PKG1 mRNA in placentas and HTR-8/SVneo cells. Western blot assay was performed to measure the level of PKG1 protein. The cell proliferation， migration and apoptosis were assessed by CCK-8 assay， Transwell assay and flow cytometry. Results The expression of miR-155 was significantly upregulated in placental tissue of the PE group， while the expression of PKG1 decreased significantly （P＜0.05）. The vitro experiments showed that compared with the NC group， the expression of PKG1 was significantly reduced in the miR-155 mimics group （P＜0.05）. The migration and proliferation ability of trophoblast was significantly weakened， the apoptotic ability was significantly enhanced （P＜0.05）. The expression of PKG1 was significantly increased in the miR-155 inhibitor group， the migration and proliferation ability of trophoblast was significantly enhanced， and the apoptotic ability was significantly weakened. Compared with the control group， the expression of miR-155 was significantly reduced in the PDTC group， the migration and proliferation ability of trophoblast was significantly enhanced， and the apoptotic ability was significantly weakened （P＜0.05）. Conclusion Results indicate that the expression of miR-155 is upregulated in preeclampsia， and can affect proliferation， migration and apoptosis of trophoblast cells by down-regulating PKG1 mediated by NF-κB.

Key words： pre-eclampsia; cell movement; cell proliferation; apoptosis; NF-kappa B; miR-155; PKG1; trophoblast

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有的疾病，其特征是妊娠20周后出現(xiàn)蛋白尿和高血壓。PE的發(fā)病率為2%～8%［1］，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及新生兒死亡的主要原因之一，占全球孕產(chǎn)婦死亡的10%～15%［2］。目前普遍認(rèn)為胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲異常、血管內(nèi)皮功能受損與PE的發(fā)病密切有關(guān)［3］，但具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，缺少有效的治療措施。微小RNA（microRNA，miR）是一類小分子非編碼RNA，長度約22個核苷酸［4］。研究表明，miRNA的表達(dá)失調(diào)可能與PE的發(fā)生有關(guān)［5］。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在子癇前期患者胎盤組織中高表達(dá)，并且可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)其凋亡和炎性反應(yīng)［6］。已有研究表明，miR-155可通過與一氧化氮（NO）/環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）通路的主要下游分子環(huán)磷酸鳥苷依賴性蛋白激酶1（cGMP-dependent protein kinase 1，PKG1）的3′-非翻譯區(qū)（UTR）互補(bǔ)結(jié)合，從而負(fù)向調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）中PKG1的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致VSMC表型轉(zhuǎn)換和功能障礙［7］。然而，該通路在PE和滋養(yǎng)細(xì)胞中的作用尚未被證實(shí)，筆者推測miR-155可能通過調(diào)節(jié)PKG1參與PE的進(jìn)展。本研究旨在探究miR-155/PKG1軸對PE的影響以及對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2020年6月—2021年12月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院剖宮產(chǎn)分娩的PE產(chǎn)婦20例作為PE組，選擇同期剖宮產(chǎn)分娩的正常產(chǎn)婦20例作為NPE組。PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》［8］。2組產(chǎn)婦均排除雙胎及多胎妊娠、慢性肝腎疾病、妊娠期糖尿病、傳染性或代謝性疾病等。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：2022-238-01），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/SVneo購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；Trizol試劑購自日本TAKARA公司；Lipofectaimine 2000、Transwell小室購自美國Thermo Fisher Scientific公司；miR-155 mimic、inhibitor、NC、PKG1 siRNA以及PKG1 siRNA NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；PDTC購自英國Abcam公司；熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自德國DBI公司；PKG1抗體購自美國Boster公司；BCA蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物發(fā)展有限公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PCR擴(kuò)增儀（Mx3000P）購自杭州晶格科學(xué)儀器有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 標(biāo)本的收集與處理 所有標(biāo)本均在剖宮產(chǎn)胎盤娩出后5 min內(nèi)收集，避開鈣化灶及出血區(qū)域，于胎盤母面不同位置剪取胎盤組織，置于無菌的EP管中，并迅速置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染 將體外培養(yǎng)的HTR-8/SVneo細(xì)胞分為6組：NC組（轉(zhuǎn)染miR-155 NC）、mimics組（轉(zhuǎn)染miR-155 mimic）、inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor）、siRNA NC組（轉(zhuǎn)染PKG1 siRNA NC）、PKG1 siRNA組（轉(zhuǎn)染PKG1 siRNA）、siRNA+inhibitor組（轉(zhuǎn)染PKG1 siRNA和miR-155 inhibitor）。取對數(shù)期生長至密度為90%的細(xì)胞接種至6孔板（3?105/孔），并更換為無血清無雙抗的培養(yǎng)基，按照Lipofectaimine 2000試劑盒說明書對各組細(xì)胞分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 核因子（NF）-κB抑制劑PDTC處理 PDTC是國際公認(rèn)的NF-κB抑制劑，可以在多種細(xì)胞中抑制NF-κB的激活。將細(xì)胞分為4組：Control組（常規(guī)培養(yǎng)）、PDTC組（PDTC處理）、PDTC+NC組（PDTC與miR-155 NC共處理）、PDTC+mimics組（PDTC與miR-155 mimics共處理）。PDTC組使用含PDTC 30 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，PDTC+NC組與PDTC+mimics組中，miR-155 NC或miR-155 mimics轉(zhuǎn)染后更換為含PDTC 30 μmol/L的培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h。

1.3.4 總RNA提取及qPCR檢測 將所保存的胎盤組織從冰箱中取出，采用Trizol法進(jìn)行胎盤組織和各組HTR-8/SVneo細(xì)胞中總RNA的提取，質(zhì)檢后繼續(xù)-80 ℃保存。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA合成cDNA，隨后用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量， PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。miR-155以U6為內(nèi)參，PKG1以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155和PKG1的相對表達(dá)量。

1.3.5 Western blot檢測各組PKG1的表達(dá) 采用RIPA裂解液提取胎盤組織和各組HTR-8/SVneo細(xì)胞中的總蛋白，按照BCA試劑盒檢測蛋白濃度，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗（1∶1 000）孵育過夜，然后加入二抗（1∶2 000）室溫下孵育2 h，之后進(jìn)行ECL顯影，各條帶的灰度值采用Image Pro Plus Ver.6.0進(jìn)行分析，目的蛋白相對表達(dá)量=目的條帶灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.6 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力 在Transwell小室的上室接種細(xì)胞（3?104/孔），下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后采用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，隨機(jī)抽取3張圖片，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

1.3.7 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性 將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板（3?103/孔）中培養(yǎng)12 h，分別于0 h、24 h、48 h、72 h時取出培養(yǎng)板，加入100 μL CCK-8工作液，再培養(yǎng)2 h，然后檢測450 nm處的吸光度（A）值。

1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先收集培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，然后加入凋亡檢測工作液，避光孵育15 min。用FlowJo軟件測定細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0及Graphpad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P₂₅，P₇₅）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者一般資料比較 與NPE組相比，PE組年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）和孕周的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），收縮壓（SBP）及舒張壓（DBP）升高，而胎兒出生體質(zhì)量降低（P＜0.05），見表2。

2.2 2組胎盤組織中miR-155及PKG1的表達(dá)比較 與NPE組相比，PE組miR-155的表達(dá)水平升高（P＜0.01），而PKG1的mRNA及蛋白［0.15（0.07，0.32） vs. 0.88（0.77，1.03），n=4，Z=16.000］水平均降低（P＜0.05），見表3、圖1。

2.3 miR-155對滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中PKG1表達(dá)的影響 與NC組相比，miR-155 mimics組miR-155水平升高，miR-155 inhibitor組降低（P＜0.05），miR-155 inhibitor組PKG1 mRNA和蛋白水平升高，而miR-155 mimics組降低（P＜0.05）。見表4、圖2。

2.4 miR-155對滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo遷移、增殖、凋亡的影響 與NC組相比，miR-155 inhibitor組細(xì)胞遷移、增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率減少（P＜0.05），而miR-155 mimics組細(xì)胞遷移、增殖能力減弱，細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05），見表5，圖3、4。

2.5 抑制PKG1的表達(dá)后對miR-155、PKG1表達(dá)的影響 與NC組相比，inhibitor組miR-155水平降低，PKG1 mRNA和蛋白的水平升高（P＜0.05）；與PKG1 siRNA組相比，siRNA+inhibitor組miR-155水平降低，PKG1在mRNA和蛋白水平均升高（P＜0.05），見表6、圖5。

2.6 抑制NF-κB的表達(dá)對滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中miR-155和PKG1水平的影響 與Control組相比，PDTC組miR-155水平降低，PKG1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與PDTC+NC組相比，PDTC+mimics組miR-155的水平升高（P＜0.05），PKG1 mRNA和蛋白水平均降低（P＜0.05），見表7、圖6。

2.7 抑制NF-κB表達(dá)對滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo生物學(xué)功能的影響 與Control組相比，PDTC組滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、增殖能力增強(qiáng)，凋亡率下降（P＜0.05）；與PDTC+NC組相比，PDTC+mimics組滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、增殖能力減弱，凋亡率增加（P＜0.01）。見表8，圖7、8。

3 討論

PE是一種嚴(yán)重威脅母嬰健康的妊娠特異性疾病，伴有炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［9］，如不及時治療會導(dǎo)致腦卒中、腎功能衰竭、肺水腫、肝破裂、子癇等嚴(yán)重并發(fā)癥［10］。目前PE的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，治療旨在減緩病理進(jìn)展以延長孕周，然而可用于治療該疾病的臨床策略有限，只有胎盤娩出才可徹底解除母體的癥狀，因而尋找有效的治療靶點(diǎn)是當(dāng)前圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。

3.1 miR-155在PE中的表達(dá)及作用 miRNAs在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，其通過與靶基因mRNA的3′-UTR反向互補(bǔ)，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過程［11］。有學(xué)者研究miRNAs的基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，一些miRNAs，如miR-335、miR-424、miR-18a、miR-155可以通過作用于多種靶點(diǎn)導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞功能障礙［12-13］。miR-155是保守性較好的多功能miRNA之一，由位于21號染色體上的miR155宿主基因（MIR155HG）編碼，可以在包括PE在內(nèi)的多種疾病中表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在PE患者中高表達(dá)，并與其啟動子區(qū)域DNA甲基化水平呈負(fù)相關(guān)［6］，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過對PE患者和正常產(chǎn)婦胎盤中相關(guān)因子的檢測發(fā)現(xiàn)，PE患者胎盤組織中miR-155的表達(dá)水平顯著升高，與Wu等［14］研究結(jié)果一致，而PKG1的表達(dá)明顯降低，提示miR-155的高表達(dá)與PE的發(fā)生密切相關(guān)。

3.2 miR-155通過抑制PKG1的表達(dá)在PE中發(fā)揮作用 PKG1是cGMP的重要效應(yīng)物，具有多種重要功能，如血管舒張與重建、細(xì)胞分化和凋亡等。NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在內(nèi)皮功能和心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［15］。NO由L-精氨酸通過內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化形成，在調(diào)節(jié)血壓方面起重要作用，NO可結(jié)合平滑肌細(xì)胞中NO的受體可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），從而將三磷酸鳥苷（GTP）轉(zhuǎn)化為cGMP，引起cGMP依賴性蛋白激酶（PKG）水平的升高而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，當(dāng)這一途徑受損時可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損、血管舒張障礙［16］。在哺乳動物中，PKG有2種同工酶，即PKG1和PKG2，由不同基因編碼［17］。PKG1主要在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮作用，而PE是一種以血管功能障礙為特征的疾?。?8］，這表明在PE中PKG1可能更為重要。Choi等［7］研究認(rèn)為，miR-155模擬物可降低VSMC細(xì)胞中PKG1的水平，從而導(dǎo)致VSMC表型發(fā)生改變和舒張功能障礙。為驗(yàn)證miR-155是否可通過抑制PKG1的表達(dá)進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)功能，本研究采用滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染miR-155 mimics或inhibitor建立過表達(dá)或干擾細(xì)胞模型，結(jié)果顯示miR-155低表達(dá)可以上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞PKG1 mRNA和蛋白的水平，還可增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示miR-155可通過抑制PKG1引起滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)生改變。

3.3 抑制NF-κB表達(dá)后對PE的影響 NF-κB是一種細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如炎癥反應(yīng)、胚胎發(fā)生、細(xì)胞增殖與凋亡以及對各種有害刺激的應(yīng)激反應(yīng)［19］。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一種經(jīng)典的促炎通路，在感染或損傷期間，組織會迅速釋放促炎因子，如白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8、腫瘤壞死因子α，從而激活NF-κB通路，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子、趨化因子等的釋放［20］。根據(jù)Staff［21］提出的改良PE兩階段模型，筆者認(rèn)為PE的致病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在炎性因子的刺激下NF-κB通路被激活，促進(jìn)機(jī)體進(jìn)一步分泌大量的炎性細(xì)胞因子，持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)可引發(fā)血管內(nèi)皮損傷，從而促進(jìn)PE的發(fā)展［22］。有研究表明，在PE大鼠體內(nèi)選擇性抑制NF-κB的表達(dá)可降低大鼠血壓以及尿蛋白，并可減緩胎盤損傷［23］。Mann等［24］研究發(fā)現(xiàn)，炎癥刺激可激活NF-κB，導(dǎo)致miR-155水平升高，進(jìn)而抑制SHIP1和SOCS1以及其他潛在靶標(biāo)的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，NF-κB抑制劑PDTC處理后滋養(yǎng)細(xì)胞miR-155表達(dá)降低，PKG1的表達(dá)則明顯升高，滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、增殖能力明顯增強(qiáng)，凋亡能力減弱，而轉(zhuǎn)染miR-155模擬物后可逆轉(zhuǎn)PTDC對PKG1水平以及滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。筆者推測NF-κB可能是通過miR-155發(fā)揮生物學(xué)作用，并影響PE進(jìn)展的重要信號因子。

綜上，PE患者胎盤組織中miR-155呈高表達(dá)，而PKG1呈低表達(dá)；NF-κB介導(dǎo)的miR-155通過下調(diào)PKG1的表達(dá)，從而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和遷移，增加細(xì)胞凋亡。本研究對miR-155在PE發(fā)病中的作用進(jìn)行了初步分析，為明確PE的致病機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)。

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（2022-11-18收稿 2023-03-02修回）

（本文編輯 李鵬）