缺氧誘導(dǎo)因子-1α與X染色體連鎖凋亡抑制蛋白在人卵巢癌中的表達(dá)及意義

肖貴華, 彭星辰

(1.四川錦欣西囡婦女兒童醫(yī)院病理科,四川 成都 610011; 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療科,四川 成都 610041)

缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1) 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá),是缺氧誘導(dǎo)的全局性調(diào)控缺氧應(yīng)答的因子[1,2]。HIF-1屬于DNA結(jié)合蛋白,是由氧調(diào)控性表達(dá)的α亞基(HIF-1α)與構(gòu)成型表達(dá)的β亞基(HIF-1β)組成的異源二聚體,α亞基是HIF-1的功能單位, 它的表達(dá)和活性決定了HIF-1的生物活性,而HIF-1α的穩(wěn)定性隨氧濃度的變化而變化[3]。X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAP)新成員[4],被認(rèn)為是IAP家族中抑制Caspases最強(qiáng)的因子之一。已經(jīng)證實(shí),XIAP在正常組織中幾乎不表達(dá),而在乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和急性白血病等腫瘤中都是高表達(dá),主要是通過(guò)抑制Caspase家族活性而發(fā)揮抑制凋亡的作用[5]。本研究探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)與XIAP的關(guān)系,為卵巢癌的早期診斷提供新思路。

【基金項(xiàng)目】中華醫(yī)學(xué)會(huì)基金項(xiàng)目(編號(hào):22-482)

【通訊作者】彭星辰

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來(lái)自四川錦欣西囡婦女兒童醫(yī)院病理科2023年1～6月手術(shù)切除、臨床病理資料完整的石蠟包埋組織。其中:①原發(fā)性惡性上皮性卵巢癌組織30例;年齡24～73歲[(49.0 ± 9.2)歲];其中漿液性囊腺癌27例、粘液性囊腺癌3例;2例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,28例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)臨床分期標(biāo)準(zhǔn),即TNM分期法,Ⅰ期、Ⅱ期共21例,Ⅲ期、Ⅳ期共9例;②正常卵巢組織10例(來(lái)源于卵巢活檢、多發(fā)性子宮肌瘤或功能性子宮出血、子宮脫垂等病例行全子宮切除,同時(shí)行卵巢切除,且病理證實(shí)卵巢組織無(wú)異常);年齡45～66[(54.9 ± 6.4)歲];③良性卵巢腫瘤10例,全為漿液性囊腺瘤,年齡16～63歲[(49.4 ± 12.9)歲];④交界性卵巢腫瘤10例,其中6例漿液性囊腺瘤,4例粘液性囊腺癌,年齡18～75歲[(49.2 ± 14.2)歲]。所選病例臨床、病理資料完整,且患者術(shù)前未進(jìn)行任何放、化療及其它抗腫瘤治療,由高年資病理科醫(yī)師復(fù)習(xí)閱片后重新制備切片。

1.2 標(biāo)本及試劑本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV-3,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。XIAP多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物試劑公司即用型;HIF-1α單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋試劑公司即用型;Envision試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。XIAP、HIF-1α及β-actin引物購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。PCR試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 采用Envision法。標(biāo)本連續(xù)切片,脫蠟、水化,用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。在pH9.0的檸檬酸鈉緩沖液中高壓修復(fù)抗原后加 入 已 稀 釋 的 一 抗HIF-1α(1∶50)、XIAP(1∶50),4 ℃孵育過(guò)夜;加入生物素標(biāo) 記 的 二 抗,滴加DAB顯色劑顯色。將陽(yáng)性的卵巢癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2卵巢癌SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng) 將SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2混合空氣中。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好(細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%左右)的細(xì)胞放進(jìn)無(wú)氧培養(yǎng)小室里,向小室里灌以1%氧氣+5%二氧化碳+94%氮?dú)獾幕旌蜌怏w,充氣約5分鐘,模擬細(xì)胞在小室里一個(gè)低氧環(huán)境,分別將細(xì)胞培養(yǎng)瓶在小室里放置12、24、36 h培養(yǎng),以使癌細(xì)胞的HIF-1α基因量隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而增加;將在以上3個(gè)時(shí)間段培養(yǎng)的SKOV-3細(xì)胞用Trizol法提取,按照試劑說(shuō)明書(shū)正確操作。

1.3.3RT-PCR檢測(cè)HIF-1α和 XIAP mRNA表達(dá)水平 取不同條件下培養(yǎng)的細(xì)胞RNA樣本,用核酸測(cè)定儀對(duì)RNA定量分析,采用Trizol法處理SKOV3細(xì)胞RNA,并測(cè)定RNA濃度。按TaKaRa RNAPCR(AMV) Ver3.0試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,PCR引物序列HIF-1α(5′-CCCTAACGTGTTATCTGTCGCT-3′,5′-ATGTTCCATTTTTCGCTTTCTCT-3′,112 bp);XIAP(5′-GCTCACCTAACCCCAAGAGAG-3′,5′-AATATTAAGATTCCGGCCCAA-3′,183 bp);β-actin(5′-CCAGGGCGTTATGGTAGGCA-3′, 5′-TTCCATATCGTCCCAGTTGGT-3′,130 bp)。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3min;95 ℃ 30 s; Tm ℃ 30 s; 72 ℃; 1 min/kb;33個(gè)循環(huán); 72 ℃終延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后拍照,測(cè)量吸光度值,mRNA表達(dá)水平以每一樣品與β-actin吸光度比值表示。

1.3.4卵巢癌細(xì)胞低氧培養(yǎng) 12、24、36 h后檢測(cè)XIAP mRNA隨HIF-1α mRNA的光密度值(MOD)變化。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)在切片中細(xì)胞質(zhì)染成淡黃色至棕黃色為陽(yáng)性標(biāo)志,將陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和顯色強(qiáng)度分為3級(jí):弱陽(yáng)性(+),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%,顯色強(qiáng)度為淡黃色或僅個(gè)別細(xì)胞為黃至棕黃色;強(qiáng)陽(yáng)性(+++),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>60%,多數(shù)細(xì)胞為黃至棕黃色;中度陽(yáng)性(++),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及強(qiáng)度介于前兩者之間。

1.5 圖像分析每張切片用美國(guó)MediaCybe-metics 公司生產(chǎn)的Image-ProPlusz圖像分析軟件(Version6.0)(IPP6.0)進(jìn)行圖像分析平均光密度值(mean optical density,MOD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。所有圖像分析結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;兩組陽(yáng)性表達(dá)率比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法等;各指標(biāo)相關(guān)性表達(dá)用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凋亡抑制因子X(jué)IAP在各組織標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率的比較XIAP的陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)主要見(jiàn)于細(xì)胞漿,呈棕黃色(見(jiàn)圖1),其在惡性上皮性卵巢癌、交界性卵巢腫瘤及良性卵巢腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為60%(18/30)、70%(7/10)、20%(2/10);在正常卵巢組織中無(wú)表達(dá)0%(0/10)。惡性上皮性卵巢癌中XIAP陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于良性卵巢腫瘤組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.900,P=0.028);交界性組XIAP陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于良性卵巢腫瘤組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.798,P=0.028);交界性與惡性組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.85)。

圖1 XIAP在人惡性上皮性卵巢癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(EnVision,×400)

2.2 HIF-1α在各實(shí)驗(yàn)組中陽(yáng)性表達(dá)率的比較HIF-1α陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核,主要見(jiàn)于細(xì)胞漿,呈棕黃色(見(jiàn)圖2)。HIF-1α在惡性上皮性卵巢癌、交界性卵巢腫瘤、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.3%(19/30)、70%(7/10)、20%(2/10)、10%(1/10)。惡性上皮性卵巢癌中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于良性卵巢腫瘤組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.043,P=0.044);交界性組HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于良性卵巢腫瘤組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.798,P=0.028);交界性與惡性組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。

2.3 XIAP與HIF-1α在不同臨床病理特征的上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)臨床分期越晚(Ⅲ期+Ⅳ期)組XIAP蛋白的表達(dá)水平明顯高于臨床分期早期(Ⅰ期+Ⅱ期)組(P=0.007);XIAP蛋白表達(dá)水平與患者年齡、病理分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 惡性上皮性卵巢癌組織中XIAP與HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性在30例惡性上皮性卵巢癌組織中XIAP蛋白與HIF-1α蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.359,P=0.035)。

2.5 卵巢癌細(xì)胞低氧培養(yǎng)12、24、36 h后XIAP mRNA及HIF-1α mRNA的MOD變化低氧24 h時(shí),SKOV3細(xì)胞系中HIF-1αmRNA表達(dá)量達(dá)高峰,36 h時(shí)HIF-1αmRNA表達(dá)量有所回落。見(jiàn)圖3。

圖3 卵巢癌細(xì)胞缺氧培養(yǎng)12、24、36 h后XIAP mRNA及HIF-1α mRNA的MOD值 a:XIAP mRNA;b:HIF-1α mRNA

2.6 缺氧組12、24、36 h,XIAP mRNA與HIF-1α mRNA相關(guān)性分析隨缺氧時(shí)間的變化,XIAP mRNA與HIF-1α mRNA呈正相關(guān)(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 低氧12、24、36 h,XIAP mRNA與HIF-1α mRNA相關(guān)性分析

3 討論

卵巢癌占女性卵巢惡性腫瘤的90%,是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的,近年來(lái)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。大量研究表明,腫瘤細(xì)胞的異常增殖、浸潤(rùn)及其惡性轉(zhuǎn)化與細(xì)胞凋亡調(diào)控紊亂有密切聯(lián)系。近年來(lái)對(duì)腫瘤治療的研究熱點(diǎn)已轉(zhuǎn)移到檢測(cè)抗凋亡因子所致的凋亡受阻在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用,進(jìn)一步探討阻斷腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的新方法。

XIAP是新發(fā)現(xiàn)的IAP新成員,被認(rèn)為是IAP家族中抑制Caspases最強(qiáng)的因子之一,是作用最強(qiáng)的內(nèi)源性凋亡抑制蛋白[6,7]。XIAP在正常組織中幾乎不表達(dá),而在多種惡性腫瘤中其表達(dá)明顯升高,已經(jīng)證實(shí)在乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和急性白血病等腫瘤中XIAP都是高表達(dá),這是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡下降、預(yù)后差的重要原因。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)XIAP的高表達(dá)與多種腫瘤的耐藥性相關(guān),下調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[8～10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), XIAP在正常卵巢組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá),而在良性卵巢腫瘤、交界性卵巢腫瘤和惡性上皮性卵巢癌中的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高(P<0.01)。XIAP在惡性上皮性卵巢癌中的表達(dá)明顯高于良性,提示XIAP有可能成為診斷卵巢上皮腫瘤的一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)記物。多數(shù)學(xué)者均認(rèn)為 XIAP、HIF-1α與腫瘤組織病理分型、患者年齡以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性,而與腫瘤的臨床分期相關(guān)[11]。表明XIAP、HIF-1α是高度侵襲性疾病的生物標(biāo)志,更加證實(shí)XIAP、HIF-1α蛋白在卵巢癌發(fā)生的不同階段的表達(dá)逐漸增高,提示預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示:臨床分期晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)組的XIAP和HIF-1α的蛋白表達(dá)水平明顯高于臨床分期早期(Ⅰ期和Ⅱ期)組(P<0.05)。同時(shí)在上皮性卵巢癌中患者的年齡及有無(wú)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移中發(fā)現(xiàn),上皮性卵巢癌與患者的年齡、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)。進(jìn)一步說(shuō)明了二者高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

HIF-1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá),是缺氧誘導(dǎo)的全局性調(diào)控缺氧應(yīng)答的因子。HIF-1屬于DNA結(jié)合蛋白,是由氧調(diào)控性表達(dá)的α亞基(HIF-1α)與構(gòu)成型表達(dá)的β亞基(HIF-1β)組成的異源二聚體,α亞基是HIF-1的功能單位, 它的表達(dá)和活性決定了HIF-1的生物活性,而HIF-1α的穩(wěn)定性隨氧濃度的變化而變化。受到HIF-1調(diào)控的HRG稱為HIF-1的靶基因。缺氧時(shí),活化的HIF-1與其靶基因結(jié)合,并促進(jìn)靶基因表達(dá)。這些表達(dá)產(chǎn)物在腫瘤新生血管的形成、腫瘤代謝和腫瘤的轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用[12]。研究者用免疫組化方法檢測(cè)19種類型的人實(shí)質(zhì)性腫瘤,發(fā)現(xiàn)其中有13種過(guò)表達(dá)HIF-1α,而且90%的腎癌、前列腺癌、肺癌及結(jié)腸癌組織中HIF-1α高表達(dá)[13]。另有研究顯示,在乳腺纖維腺瘤、子宮平滑肌瘤等良性腫瘤中無(wú)HIF-1α表達(dá)?？梢?jiàn)HIF-1α的表達(dá)與腫瘤原發(fā)性、良惡性以及轉(zhuǎn)移性有密切關(guān)系。在本研究中我們用免疫組化技術(shù)檢測(cè)卵巢上皮性腫瘤組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)HIF-1α在細(xì)胞核和細(xì)胞漿都有表達(dá),但主要表達(dá)于細(xì)胞漿。在惡性卵巢癌組HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率為60.3%,交界性腫瘤組陽(yáng)性表達(dá)率為70%,良性腫瘤組為20%,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

大量研究表明,PI3K活化以后促進(jìn)下游Akt磷酸化,然后促進(jìn)下游靶蛋白GSK-3磷酸化,抑制HIF-1α降解,使得HIF-1α表達(dá)增加[14～17]。Akt還可通過(guò)激活下游mTOR基因的表達(dá)促進(jìn)HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄[18]。IAPs家族中XIAP是最強(qiáng)有力的Caspase抑制物。XIAP有3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域(BIR-1, -2, -3),BIR-2與BIR-1和BIR-2之間的連接區(qū)參與抑制caspase-3,-7的活性。單獨(dú)的BIR-3結(jié)構(gòu)域即可抑制caspase-9,且其自身RING指結(jié)構(gòu)域具有泛素連接酶活性,自身可被泛素化而降解[19]。Zhou等[20]研究還發(fā)現(xiàn),XIAP的Ser87位點(diǎn)可被Akt磷酸化,磷酸化后的XIAP可保護(hù)其免于泛素化和降解,且Akt還可抑制XIAP的自動(dòng)泛素化,增強(qiáng)其穩(wěn)定性和在細(xì)胞內(nèi)的水平,改善細(xì)胞生存,發(fā)揮抑制凋亡的作用。XIAP是Akt的新下游信號(hào)傳遞者,它在Akt的凋亡抑制作用中發(fā)揮重要作用。失去Akt磷酸化位點(diǎn)的突變XIAP在細(xì)胞中被迅速降解, 細(xì)胞凋亡加速。由此可見(jiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)于HIF-1α和XIAP介導(dǎo)的卵巢腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,臨床可通過(guò)干預(yù)PI3K/Akt信號(hào)通路治療卵巢癌,這將成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。