支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒下呼吸道細(xì)菌定植及相關(guān)指標(biāo)研究

錢(qián)菲菲,包佳翔,史淋峰,陳旭韜,葉琛琛,吳文輝,馬笑雪,胡 健

(1.江蘇省宜興市中醫(yī)醫(yī)院 a檢驗(yàn)科,b兒科, c藥劑科,江蘇 宜興 214200;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,遼寧 沈陽(yáng) 110122)

小兒支氣管哮喘是常見(jiàn)的兒科氣道慢性炎癥,T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞均參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過(guò)程[1]。而合并肺部感染更會(huì)加重病情與治療的難度,嚴(yán)重威脅患兒的生命健康[2]。部分支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒存在下呼吸道細(xì)菌定植(lower airway bacterial colonization,LABC),這是由于哮喘的形成、反復(fù)發(fā)作與呼吸道感染密切相關(guān),LABC發(fā)生的基礎(chǔ)為上呼吸道定植細(xì)菌遷移,而器官黏膜抵抗力降低,無(wú)法抵御外來(lái)入侵,LABC能夠進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)體的炎癥發(fā)展,延長(zhǎng)病程,甚至可以導(dǎo)致難治性哮喘[3]。尋找預(yù)測(cè)支氣管合并肺部感染患兒LABC情況的指標(biāo)可有助于臨床預(yù)估患兒的預(yù)后情況。高遷移率族蛋白-1(HMGB1)參與多種細(xì)菌、DNA病毒和RNA病毒的致病過(guò)程,能夠促進(jìn)支氣管肺炎患兒的炎性因子分泌,與肺損傷、惡性腫瘤以及膿毒癥病情發(fā)展具有重要的聯(lián)系[4]。血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)對(duì)內(nèi)皮功能的受損程度有較好的評(píng)估價(jià)值;Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)在免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與抗感染中發(fā)揮重要的作用[5]。本研究對(duì)240例支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒血清VCAM-1、HMGB1及痰液TLR2、TLR4指標(biāo)水平與LABC的相關(guān)性進(jìn)行分析,為患兒的病情轉(zhuǎn)歸及臨床預(yù)后提供診療依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019年1月至2022年12月在宜興市中醫(yī)醫(yī)院接受治療的支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒240例,納入標(biāo)準(zhǔn):①符合相關(guān)診斷[6];②年齡2～11歲;③通過(guò)痰培養(yǎng)檢驗(yàn)以及胸部CT檢查,患兒確診患有肺部感染。排除標(biāo)準(zhǔn):①免疫性病變;②伴肝臟等重要器官疾病;③患兒以往存在肺部感染史;④后期隨訪失聯(lián)者。根據(jù)是否發(fā)生LABC分為陽(yáng)性組124例和陰性組116例。另選取50例同期健康體檢兒童作為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批,且參與患兒家屬對(duì)研究?jī)?nèi)容、方案知情并已簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法①LABC檢測(cè):指導(dǎo)入組兒童清洗口腔,誘導(dǎo)排痰,細(xì)菌培養(yǎng)后定植量達(dá)107CFU/ml以上者為陽(yáng)性,否則為L(zhǎng)ABC陰性[7]。②一般資料收集及肺功能檢測(cè):記錄三組兒童的性別、年齡,支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒定植菌種類(lèi)、支氣管哮喘病程等;檢測(cè)肺功能前對(duì)壓力傳感器進(jìn)行調(diào)零,后清理兒童的鼻咽分泌物,將面罩配戴在其口鼻上,并與氧氣連接管連接,記錄最大呼氣第一秒呼出的氣量容積(FEV1)、肺活量(VC)以及 呼氣峰流速(PEF)。③血清檢測(cè):取三組外周靜脈血3 ml后離心分離血清,采用Varioskan LUX酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)VCAM-1與HMGB1水平,VCAM-1試劑盒和HMGB1試劑盒均購(gòu)自深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司。④痰上清液中炎癥指標(biāo)檢測(cè):參照歐洲呼吸協(xié)會(huì)痰液誘導(dǎo)指南并改進(jìn)受試兒童痰液誘導(dǎo)操作,支氣管哮喘急性發(fā)病期患兒在入院24 h內(nèi)哮喘發(fā)作時(shí)予以痰液誘導(dǎo),臨床緩解期于臨床癥狀停止,哮喘哮鳴音消失后5 d予以痰液誘導(dǎo)。采用Varioskan LUX酶標(biāo)儀經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定導(dǎo)出痰上清液中炎癥因子濃度,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE),試劑盒均購(gòu)自深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。⑤痰液TLR2、TLR4表達(dá)檢測(cè):采用④中的方法獲取誘導(dǎo)痰液。經(jīng)熒光免疫分析儀(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)經(jīng)雙色免疫熒光直接法測(cè)定痰液中TLR2、TLR4水平,TLR2-PE、TLR4-PE及試劑盒均購(gòu)自深圳晶美生物有限公司。對(duì)于TLR2、TLR4水平采用相對(duì)平均熒光強(qiáng)度表示,相對(duì)平均熒光強(qiáng)度=平均熒光強(qiáng)度/對(duì)照組平均熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較采用t檢驗(yàn),三組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn);影響因素分析采用Logistic回歸分析;預(yù)測(cè)價(jià)值分析采用繪制受試者工作特征(ROC)曲線。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較三組性別、年齡及PEF水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);陽(yáng)性組與陰性組支氣管哮喘病程、并發(fā)肺部感染時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);陽(yáng)性組FEV1、VC低于陰性組及對(duì)照組,陰性組FEV1、VC低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組一般資料的比較

2.2 三組血清VCAM-1、HMGB1濃度水平比較陽(yáng)性組血清VCAM-1 、HMGB1濃度均高于陰性組、對(duì)照組(P<0.05),陰性組與對(duì)照組上述指標(biāo)比較,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組血清VCAM-1、HMGB1濃度水平比較

2.3 三組痰標(biāo)本中TLR2、TLR4及炎性指標(biāo)水平比較陽(yáng)性組痰標(biāo)本中TLR2、TLR4及TNF-ɑ、IL-8、IL-6、NE水平均高于陰性組、對(duì)照組(P<0.05),陰性組與對(duì)照組上述指標(biāo)比較,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組痰標(biāo)本中TLR2、TLR4及炎性指標(biāo)水平比較

2.4 支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒發(fā)生LABC的影響因素分析血清VCAM-1、HMGB1濃度及痰液TLR2、TLR4表達(dá)水平是支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒發(fā)生LABC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒發(fā)生LABC的影響因素分析

2.5 相關(guān)指標(biāo)對(duì)支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒發(fā)生LABC的預(yù)測(cè)價(jià)值血清VCAM-1、HMGB1與痰液TLR2、TLR4聯(lián)合預(yù)測(cè)支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒LABC的曲線下面積為0.891,敏感度、特異度分別為0.85、0.83。見(jiàn)表5。

表5 相關(guān)指標(biāo)對(duì)支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒發(fā)生LABC的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

準(zhǔn)確預(yù)估支氣管哮喘伴肺部感染者LABC發(fā)生的可能性有助于臨床醫(yī)生制定合適的治療方案[8]。VCAM-1在肺炎、敗血癥、支氣管哮喘等炎癥反應(yīng)中均有表達(dá),可誘發(fā)變態(tài)反應(yīng);白介素等炎癥因子的釋放可誘發(fā)哮喘;HMGB1是肺部感染進(jìn)程的重要細(xì)胞因子[9]。臨床上或可根據(jù)HMGB1、VCAM-1血清濃度推測(cè)患兒發(fā)生LABC的概率,據(jù)此評(píng)估患兒的治療效果和預(yù)后情況。

HMGB1最初是在牛胸腺中發(fā)現(xiàn)的結(jié)合蛋白,是由肺泡巨噬細(xì)胞以及單核細(xì)胞生成;HMGB1在健康體中僅限于細(xì)胞核內(nèi),血清濃度較低,在細(xì)胞凋亡或單核、巨噬細(xì)胞主動(dòng)釋放時(shí)大量存在于血流循環(huán)中,具有協(xié)調(diào)炎癥和機(jī)體免疫的作用[10,11];HMGB1也可在慢阻肺患兒的呼吸氣道內(nèi)高度表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,陽(yáng)性患兒的HMGB1濃度高于陰性組,這是由于HMGB1具有多種生物學(xué)功能,可介導(dǎo)輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)、Treg細(xì)胞(regulatory cell,Treg)上的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體結(jié)合,與免疫炎癥中T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失衡有關(guān)。陳金妮等[12]的研究顯示,難治性肺炎患兒的血清HMGB1濃度顯著高于普通肺炎,血清HMGB1水平對(duì)肺炎病情嚴(yán)重程度的判斷具有較高臨床價(jià)值,該結(jié)論與本研究結(jié)果較一致。

此外,HMGB1能夠從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì),再釋放于細(xì)胞外,調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng);而炎癥介質(zhì)又能進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的分泌。哮喘患兒機(jī)體中幼稚T細(xì)胞分化成為輔助性T細(xì)胞,Th17、Th2等細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能,其中Th17需要IL-6促進(jìn)分化,存在于肺炎組織中,可誘導(dǎo)機(jī)體分泌中性粒細(xì)胞[13];同時(shí)還能干擾嗜酸性細(xì)胞活化因子。本研究結(jié)果顯示,陽(yáng)性組患兒痰液中炎性因子水平更高,肺功能指標(biāo)更差,可能是由于陽(yáng)性組患兒的炎癥反應(yīng)更加劇烈、機(jī)體損傷較陰性組更為嚴(yán)重。這也再次證實(shí)了LABC的發(fā)生與HMGB1具有重要的聯(lián)系,對(duì)支氣管哮喘合并肺部感染的病情發(fā)展具有重要預(yù)測(cè)價(jià)值。

在本研究中,還發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性組VCAM-1濃度高于陰性組,說(shuō)明VCAM-1也可預(yù)測(cè)支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒的病情發(fā)展,可能是由于VCAM-1導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答水平升高,增加了炎性細(xì)胞因子濃度,從而加重了患兒的病情。于斌等[14]研究發(fā)現(xiàn),哮喘患兒的HMGB1水平更高,且與患兒的病情及臨床預(yù)后有密切聯(lián)系。在孫磊等[15]研究中,感染細(xì)菌性肺炎的患兒血清VCAM-1表達(dá)水平明顯升高,且VCAM-1的濃度變化與患兒的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),表明檢測(cè)VCAM-1水平有助于臨床判斷肺炎的轉(zhuǎn)歸情況。多因素Logistics回歸分析結(jié)果也顯示,氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒血清VCAM-1、HMGB1濃度及痰液TLR2、TLR4水平是發(fā)生LABC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,ROC曲線則顯示血清VCAM-1、HMGB1與痰液TLR2、TLR4聯(lián)合預(yù)測(cè)支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒發(fā)生LABC的曲線下面積為0.891,敏感度、特異度分別為0.85、0.83。另外,TLR為跨膜受體,胞外段結(jié)構(gòu)與果蠅蛋白同源,是一種重要的模式識(shí)別分子受體。TLR2、TLR4可識(shí)別相關(guān)脂蛋白以激活NK細(xì)胞等,從而介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng),因此陽(yáng)性組患兒的機(jī)體免疫反應(yīng)更為強(qiáng)烈,痰液中TLR2、TLR4表達(dá)相對(duì)顯著[16,17]。

綜上所述,血清VCAM-1、HMGB1及痰液TLR2、TLR4高表達(dá)的支氣管哮喘并發(fā)肺部感染患兒更易發(fā)生LABC,臨床醫(yī)生可根據(jù)患兒血清VCAM-1、HMGB1水平以及TLRs表達(dá)判斷治療效果并及時(shí)調(diào)整治療方案。