肺泡灌洗液基因甲基化聯(lián)合癌胚抗原、氣道徑向超聲對肺癌的診斷價值

陳 露,胡佩村,陳紹森

(廣東省佛山市第二人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,廣東 佛山 528000)

肺癌是最常見惡性腫瘤且死亡率高[1],肺癌的早期診斷對患者的預后有重要意義。隨著二代和三代高通量測序技術(shù)迅速發(fā)展,大量的肺癌生物標志物被挖掘發(fā)現(xiàn),這彌補了早期肺癌篩查的不足[2,3]。基因甲基化是一種表觀遺傳修飾之一,目前與肺癌相關(guān)的甲基化位點超過80種[4],其中包括肺泡灌洗液中矮小同源異型盒基因2(shortstature homeobox 2,SHOX2)和RAS關(guān)聯(lián)域家族1 A(ras association domain family 1A,RASSF1A)。目前肺泡灌洗液(BALF)基因甲基化對于明確肺癌診斷并不確切。腫瘤標志物中的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA),診斷非小細胞肺癌的特異性約80%,敏感性約60%,且其表達水平與肺癌分期相關(guān)[5～8],臨床應用廣泛。本研究通過檢測肺部病變患者的BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性率以及CEA水平,同時采集氣道徑向超聲圖像情況,探討上述指標在肺癌早期診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019年7月至2020年6月佛山市第二人民醫(yī)院經(jīng)低劑量胸部CT(LDCT)提示肺結(jié)節(jié)或肺占位的114例患者。納入標準:①對照組根據(jù)病理或經(jīng)相應治療后好轉(zhuǎn)診斷為肺部良性病變,肺癌組依據(jù)病理或細胞學,根據(jù)《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范2015》[8]診斷為肺癌;②生命體征穩(wěn)定;③意識清楚,可正常語言對答交流。排除標準:①無法耐受支氣管鏡檢查;②合并嚴重肝、腎、心功能不全;③精神異?；蛘J知障礙?；颊呒捌浼覍倬谌虢M前了解本項研究項目,并自愿簽署知情同意書。114例患者中經(jīng)病理診斷肺癌62例(肺癌組),診斷為肺良性病變患者52例(對照組),肺癌組與對照組的年齡、性別、BMI、吸煙指數(shù)以及既往病史等比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。本研究已通過佛山市第二人民醫(yī)院臨床科研項目倫理委員會審批(編號:KJ2019003)。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1樣本采集 ①血清樣本:抽取入組患者空腹外周靜脈血5 ml,1200 r/min離心10分鐘,留存上清液待測;②氣道徑向超聲操作:患者經(jīng)局麻或全麻后于內(nèi)鏡室進行常規(guī)氣管鏡檢查,均經(jīng)鼻入鏡,并根據(jù)胸部CT提示的病變部位,予氣道徑向超聲分別于各肺亞段進行檢測,采集超聲圖像并標記超聲進入深度。③BALF樣本:氣道徑向超聲定位后,退出超聲,將氣管鏡遠端楔在相應肺段管腔,注入37 ℃生理鹽水,灌洗3次,每次20 ml,以負壓13 kPa盡可能吸盡灌洗液,收集約40 ml灌洗液,保存待測。

1.2.2樣本的檢測 ①CEA的檢測:采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定血清中CEA水平(試劑盒購自金域有限公司),檢測值>5.2 ng/ml 判斷為陽性結(jié)果。②SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測:按照說明書步驟對肺泡灌洗液進行DNA提取,DNA修飾, RT-PCR檢測,兩基因甲基化檢測結(jié)果任一項陽性即判讀為陽性(DNA提取試劑盒,亞硫酸鹽修飾試劑盒,SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測試劑盒均購自金域檢驗公司)。③氣道徑向超聲陽性結(jié)果判讀為探及病灶超聲圖像。④細胞學檢查:根據(jù)中華醫(yī)學會呼吸病學分會BALF細胞學檢測技術(shù)規(guī)范[9]方法,將細胞檢查結(jié)果分為陰性、可疑、陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法使用 SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差描述,組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)(%)描述,組間比較采用卡方檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組SHOX2和RASSF1A基因甲基化結(jié)果比較兩組SHOX2基因陽性、RASSF1A基因陽性與任一甲基化陽性所占比例比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組SHOX2和RASSF1A基因甲基化結(jié)果比較 [n(%)]

2.2 肺癌組中甲基化結(jié)果與LDCT結(jié)果相關(guān)性分析甲基化陽性的40例肺癌患者中,根據(jù)胸部CT報告,肺占位最大直徑均值50.39 mm,中位數(shù)43 mm,最大直徑30～50 mm有20例(50%);甲基化陰性的22例肺癌患者中,肺占位最大直徑均值 40.28 mm,中位數(shù)28.5 mm,最大直徑10～30 mm有13例(59.09%)。肺癌組中基因甲基化與胸部CT中惡性結(jié)節(jié)大小呈負相關(guān)(r=-0.287,P<0.05)。見表3。

表3 肺癌組中甲基化結(jié)果與結(jié)節(jié)直徑大小相關(guān)性分析 [n(%)]

2.3 細胞學檢查、SHOX2和RASSF1A基因甲基化、血清CEA水平對肺癌診斷價值比較單一檢測指標診斷肺癌,細胞學檢查特異性最高 (100%),任一基因甲基化敏感性最高,細胞學檢查聯(lián)合任一基因甲基化,血清CEA聯(lián)合任一基因甲基化敏感性均高于單一檢測指標(P<0.05)。見表4。

2.4 BALF中CEA聯(lián)合SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷效能本研究40例BALF中同時進行SHOX2、RASSF1A的基因甲基化及CEA水平檢測,根據(jù)病理診斷肺癌患者23例,肺良性病變患者17例。肺癌患者BLAF中CEA水平≥5 ng/ml有20例,CEA聯(lián)合任一基因甲基化陽性有22例;肺良性病變患者中CEA<5 ng/ml的有12例,CEA聯(lián)合基因甲基化陰性的有11例。BALF中檢測指標CEA聯(lián)合任一基因甲基化敏感性均高于單一指標檢測(P<0.05)。見表5。

表5 CEA聯(lián)合基因甲基化對肺癌診斷價值效能

2.5 不同病理類型的肺癌BALF SHOX2、RASSF1A基因甲基化情況肺癌患者病理類型分布:鱗癌19例,小細胞肺癌6例,腺癌29例,肺肉瘤樣癌1例,組織類型不確定肺癌8例。其中SHOX2、RASSF1A甲基化陽性分布情況見表6。

表6 肺癌亞組SHOX2和RASSF1A基因甲基化結(jié)果分布情況 [n(%)]

2.6 氣道徑向超聲陽性與陰性患者肺癌SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性率比較62例肺癌患者中,氣道徑向超聲可探及明顯回音圖像的有49例,其中任一基因甲基化陽性的為34例(71.4%),氣道徑向超聲無探及回音圖像有13例,其中基因甲基化陰性的為8例(38.4%)。徑向超聲陽性患者基因甲基化陽性率高于徑向超聲陰性患者(χ2=4.88,P<0.05)。見表7。

表7 氣道徑向超聲陽性與陰性患者肺癌SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性率比較 [n(%)]

3 討論

早期肺癌的缺乏特異性癥狀,導致大部分患者在就診時已處于肺癌晚期,錯過最佳診斷和治療時機,晚期肺癌5年總體生存率小于15%[2]。早期肺癌患者得到有效治療后,5年總體生存率可上升到90%[2],因此,肺癌的早期診斷至關(guān)重要。

本研究對肺部病變患者肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測結(jié)果和CEA水平進行了分析,證實了BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯(lián)合血清CEA可提高肺癌的診斷效能,同時在BALF中CEA有類似表現(xiàn)。另外,根據(jù)氣道徑向超聲定位后收集肺泡灌洗液可提高BALF基因甲基化陽性率。

表觀遺傳學機制主要是關(guān)于基因特定的表達以及個體的正常生長發(fā)育的研究[9],2010年,Schmidt等首次發(fā)現(xiàn)SHOX2甲基化可區(qū)分肺部良惡性病變(敏感性68%,特異性95%)[5,10]。RASSF1A是Ras信號通路的一部分,其表達缺失與肺腺癌相關(guān)[10～12]。肺癌相關(guān)DNA甲基化用于診斷早期肺癌成為研究熱點[13～15]。在本研究中,肺癌組SHOX2和RASSF1A基因甲基化陽性率明顯高于對照組,說明SHOX2或RASSF1A基因甲基化均具有鑒別肺部良惡性病變的潛能。同時,對各肺癌亞組進行分析,發(fā)現(xiàn)在各種類型的肺癌患者的BALF中SHOX2陽性率均高于RASSF1A基因,提示單一SHOX2甲基化對肺癌監(jiān)測可能更具有敏感性。SHOX2和RASSF1A甲基化陽性率在小細胞肺癌和鱗狀細胞癌中的表現(xiàn)優(yōu)于腺癌,這可能與中央型肺癌可釋放更多腫瘤細胞至BALF中有關(guān)。本研究顯示,肺腺癌兩組基因單獨監(jiān)測的陽性率均相對較低,SHOX2基因陽性率為60%,而RASSF1A為31.85%,與雙陽性率(30%)接近,提示對于肺腺癌,RASSF1A基因甲基化特異性可能優(yōu)于SHOX2。

為進一步分析腫瘤大小是否影響B(tài)ALF甲基化結(jié)果,本研究根據(jù)胸部CT提示的病變部位,予氣道徑向超聲分別于各肺亞段進行檢測,采集超聲圖像并標記超聲進入深度,隨后將氣管鏡遠端楔在相應肺段管腔,灌洗及收集灌洗液送檢,通過增加定位采集方式,提高操作的同質(zhì)性及灌洗液的陽性率。本研究發(fā)現(xiàn),甲基化陽性的肺腫瘤直徑范圍處于30～50 mm的陽性率占52.63%,腫瘤直徑越大BALF甲基化陽性率越低,這可能與晚期巨大腫物發(fā)生壞死、出血等影響B(tài)ALF內(nèi)腫瘤細胞的獲取有關(guān);而甲基化陰性的肺腫瘤直徑有59.09%處于10～30 mm,提示對于早期微小惡性肺結(jié)節(jié),甲基化假陰性可能性大,但這可能與肺腫瘤位置、BALF技術(shù)等因素相關(guān),尚需擴大樣本量進一步探討。

診斷肺癌的金標準是細胞學檢查,但敏感性低(38.71%),聯(lián)合BALFDNA甲基化測顯著提升細胞學檢測敏感性,同時保持較高的特異性,提示基因甲基化檢測可作為細胞學診斷的重要補充。CEA最早應用于篩查以及評價惡性腫瘤的標志物之一[6],包括原發(fā)性肺癌在內(nèi)的多器官腫瘤中均可見血清CEA水平增高[2]。BALF中 SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性聯(lián)合血清CEA水平,診斷肺癌的敏感性由63.64%提升至81.82%,特異性由84.44%升至97.78%,診斷效能明顯提高。

腫瘤標志物是由腫瘤細胞代謝、分泌所產(chǎn)生,最先積聚在病灶處,繼而進入血液循環(huán)[2],對BALF直接進行腫瘤標志物檢測可能更有利于肺癌的早期診斷。故在研究后期,對收集到的40例肺癌患者BALF進行基因甲基化檢測的同時進行CEA檢測,發(fā)現(xiàn)BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化聯(lián)合CEA檢測同樣可提高診斷的敏感性以及特異性。受限于一定客觀條件,后續(xù)研究樣本量較少,需進一步研究驗證。同時,通過對比不同標本CEA水平聯(lián)合基因甲基化在肺癌的診斷效能,血清CEA診斷肺癌的靈敏度及特異度均高于BALF,提示基因甲基化聯(lián)合血清CEA對肺癌的診斷效能優(yōu)于聯(lián)合BALF中的CEA,這可能與BALF容易收到回收率、操作者熟練程度、可溶性成分等影響。

氣道徑向超聲對肺周圍型病變診斷陽性率為61.5%[16]。本研究中納入的肺部病變患者,肺癌患者在收集BALF之前均進行了氣道徑向超聲定位,結(jié)果提示氣道徑向超聲可探及回音圖像的患者,相應獲得的BALF基因甲基化陽性率較高。同時,本研究注意到肺癌患者中13例無法獲得滿意的超聲定位圖像,但在這些患者當中,5例BALFSHOX2或RASSF1A基因甲基化陽性,提示支氣管內(nèi)徑向超聲聯(lián)合BALF甲基化檢測可能更有利于肺癌的診斷。另外,BALF中細胞學檢查結(jié)果容易收到標本可溶性成分影響,使檢測結(jié)果產(chǎn)生差異,細胞學檢查的臨床價值有限[9];而甲基化檢測作為補充,可很好地提高診斷準確率,同時BALF樣本容易獲取,降低了對基層醫(yī)院的呼吸介入技術(shù)的要求[17];CEA檢測與甲基化檢測優(yōu)點相似,兩者結(jié)合檢測在操作和經(jīng)濟方面具有一定優(yōu)勢。

本研究仍存在著不足,包括BALF CEA收集例數(shù)過少、SHOX2和RASSF1A基因甲基化定量情況與肺癌診斷的關(guān)聯(lián)未完全明確等,均需要進一步研究。綜上,BALF SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯(lián)合癌胚抗原、氣道徑向超聲檢查有助于肺癌的診斷,敏感性和特異性高,操作簡單,可作為早期肺癌篩查工具。