人類白細(xì)胞抗原-I類在錯(cuò)配修復(fù)缺陷型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其臨床意義

竹 萱,郭晶晶,謝文龍,肖 雪

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610072;2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院病理科,四川 成都 610072)

人類白細(xì)胞抗原(humall leukocyte antigen, HLA)-I類是一種在有核人類細(xì)胞上表達(dá)的膜結(jié)合蛋白復(fù)合體,在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中起著非常重要的作用[1]。HLA-I類參與抗原遞呈和CTL的激活,其在腫瘤細(xì)胞中的正常表達(dá)是CTL識別和殺傷腫瘤細(xì)胞的必要條件[1, 2]。HLA-I類在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失會(huì)減少腫瘤抗原的呈遞,影響CTL的激活,從而導(dǎo)致免疫逃逸和免疫治療耐藥[2]。目前錯(cuò)配修復(fù)缺陷/高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(mismatch repair deficiency, MMRd/microsatellite instability-high, MSI-H)型腫瘤對免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitor,ICI)具有較高的響應(yīng)率[3, 4]。但是這些MMRd/MSI-H腫瘤也有可能因?yàn)镠LA-I類的表達(dá)缺失對ICI不敏感。由于目前缺乏該分子在MMRd型腫瘤中表達(dá)情況的研究,故本文主要研究HLA-I類在MMRd型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況,其與CTL細(xì)胞浸潤情況以及其它臨床病理特征的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集四川省人民醫(yī)院病理科2017年1月至2021年3月的子宮內(nèi)膜癌組織MMRd腫瘤樣本90例。納入標(biāo)準(zhǔn):病理診斷子宮內(nèi)膜癌,至少有一種MMR蛋白缺失,且具有足夠的樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前曾接受過針對腫瘤的治療,或同時(shí)患有其它類型的腫瘤。所有石蠟包埋(FFPE)樣本均再次進(jìn)行切片和HE染色,并由兩位病理醫(yī)師復(fù)核診斷結(jié)果。隨后根據(jù)MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達(dá)情況,判定是否為MMRd腫瘤(見圖1)。選取TCGA數(shù)據(jù)庫中MSI-H子宮內(nèi)膜癌患者147例,分析mRNA水平HLA-A、HLA-B以及HLA-C以及CD8A這四個(gè)基因的表達(dá)情況。

圖1 1例代表性的子宮內(nèi)膜癌MMRd腫瘤 (×200) a:腫瘤HE染色示例;b:MSH2表達(dá)正常(IHC染色);c:MLH1表達(dá)缺失(IHC染色);d:PMS2表達(dá)缺失(IHC染色)。

1.2 方法免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)染色 對每一例FFPE樣本進(jìn)行連續(xù)切片,隨后在60 ℃下孵育1小時(shí)。經(jīng)過二甲苯脫蠟,梯度酒精復(fù)水,抗原修復(fù)后,用3% H2O2進(jìn)行阻斷,然后對MLH1(克隆ES05)、MSH2(克隆RED2)、MSH6(克隆EP49)、PMS2(克隆EP51)、CD8(克隆SP16)以及HLA Class I ABC(克隆EMR8-5)進(jìn)行染色。一抗4 ℃過夜孵育后,用二抗孵育30分鐘,隨后進(jìn)行DAB顯色(Dako REALTMEnVisionTM)。最后用蘇木素染色并封片。由于通過IHC檢測的MMRd結(jié)果和MSI-H的一致性高達(dá)90%以上,因此本研究未對樣本進(jìn)行MSI-H的檢測[5]。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1MMR狀態(tài)的判讀 MMRd定義為腫瘤細(xì)胞中任何一種MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)的核染色完全缺失,且存在陽性的內(nèi)部對照(淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞或正常子宮內(nèi)膜)[6]。腫瘤細(xì)胞中四種MMR蛋白均表達(dá)的腫瘤判定為錯(cuò)配修復(fù)正常(mismatch repair proficiency, MMRp)[6]。

1.3.2CTL密度的判定 CD8+TILs被判定為CTL。CTL的密度以浸潤到腫瘤細(xì)胞區(qū)域的CD8+TILs的數(shù)量來評價(jià)。對于每個(gè)樣本,從五個(gè)隨機(jī)選擇的高倍視野(High power field, HPF)中對CD8+TILs計(jì)數(shù),再取平均值作為該樣本的CD8+TILs密度[7]。

1.3.3HLA-I類表達(dá)狀態(tài)的判讀 HLA-I類正常(+)定義為>90%的腫瘤細(xì)胞具有該蛋白的膜和/或細(xì)胞質(zhì)表達(dá);HLA-I類部分缺失(±)定義為10%～90%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)該蛋白;HLA-I類陰性(-)定義為<10%腫瘤細(xì)胞表達(dá)該蛋白。HLA-I(±)腫瘤和HLA-I(-)腫瘤均屬于HLA-I缺失[8]。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)驗(yàn)證HLA-I類和CD8+TILs浸潤情況的關(guān)聯(lián)從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出147例MSI-H子宮內(nèi)膜癌,隨后對組成HLA-I類的三個(gè)基因HLA-A、HLA-B以及HLA-C的mRNA表達(dá)豐度和CD8A 的mRNA表達(dá)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,非正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)采用M(Q1,Q3)表示,采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。組間率的比較采用Chi-square或Fisher′s exact檢驗(yàn)。Pearson相關(guān)分析用于衡量兩組變量之間的線性關(guān)系。采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存曲線,采用Log-rank檢驗(yàn)確定其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制ROC曲線圖分析HLA-I類IHC染色對CTL密度的預(yù)測價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMRd腫瘤的臨床病理特征90例MMRd腫瘤患者年齡(55.5±7.7)歲;其中子宮內(nèi)膜樣型86例(95.5%);低級別70例(77.7%);76例為早期(84.4%)。56例具有MLH1和PMS2表達(dá)缺失(62.2%),16例具有MSH2和MSH6表達(dá)缺失(17.8%),18例具有MSH6單獨(dú)缺失(20%)。

2.2 不同臨床病理參數(shù)中HLA-I類表達(dá)狀態(tài)的比較90例MMRd腫瘤中,僅有48例(53.3%)HLA-I類表達(dá)正常(+)(圖2a),30例(33.3%)為部分缺失(±)(圖2b),12例(13.3%)為完全缺失(-)(圖2c)。相比HLA-I類表達(dá)正常的腫瘤,HLA-I類缺失腫瘤中CD8+TILs的密度顯著更低(P=0.0236)。不同組織學(xué)類型、腫瘤級別、腫瘤分期等其它臨床病理特征之間,HLA-I類表達(dá)狀態(tài)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)中HLA-I類表達(dá)狀態(tài)的比較

圖2 子宮內(nèi)膜癌MMRd腫瘤HLA-I類表達(dá)及CD8免疫組化染色示例 a:HLA-I類表達(dá)正常;b:HLA-I類部分缺失;c:HLA-I類完全缺失;d:腫瘤中的CD8+TILs (IHC染色,×200)

2.3 MMRd腫瘤中HLA-I類mRNA表達(dá)和CD8A mRNA表達(dá)的關(guān)系通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中147例MSI-H子宮內(nèi)膜癌的分析,發(fā)現(xiàn)在mRNA水平HLA-A、HLA-B以及HLA-C基因的表達(dá)都和CD8A的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.4395;r=0.4543;r=0.3837,P<0.05)。見圖3。

圖3 mRNA水平HLA-I類表達(dá)和CD8A表達(dá)的相關(guān)性 a:HLA-A和CD8A呈正相關(guān);b:HLA-B和CD8A呈正相關(guān);c:HLA-C和CD8A呈正相關(guān)

2.4 MMRd腫瘤中HLA-I類表達(dá)對CD8+TILs密度的預(yù)測價(jià)值HLA-I類IHC染色狀態(tài)曲線下面積為0.7613,對CD8+TILs密度具有較好的預(yù)測價(jià)值。見圖4。

圖4 HLA-I類表達(dá)免疫組化檢測對CD8+TILs的浸潤情況的預(yù)測價(jià)值ROC曲線

3 討論

近年來ICI已成為子宮內(nèi)膜癌患者的一種選擇,MMRd/MSI-H也被FDA批準(zhǔn)為篩選接受ICI治療的患者的標(biāo)志物[9]。其機(jī)理在于MMRd/MSI-H腫瘤會(huì)因?yàn)殄e(cuò)配修復(fù)功能的缺陷導(dǎo)致腫瘤中累積大量的突變,繼而產(chǎn)生很多新抗原,因此更容易被CTL識別和殺滅[4, 10]。然而臨床數(shù)據(jù)顯示大約一半的MMRd/MSI-H子宮內(nèi)膜癌對ICI治療并不敏感[11～13],提示還需考慮其它因素才能更有效地篩選對ICI敏感的患者。因此在MMRd/MSI-H的基礎(chǔ)上,探尋補(bǔ)充性的標(biāo)志物對提高ICI的治療效果具有重要的意義。

ICI產(chǎn)生療效的前提條件是CTL識別腫瘤細(xì)胞后發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[2]。HLA-I類對腫瘤抗原呈遞和CTL激活至關(guān)重要,該分子在腫瘤細(xì)胞的有效表達(dá)是CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的必要條件[14]。因此,CTL的抗腫瘤效應(yīng)會(huì)受到HLA-I類功能的影響。多種惡性腫瘤中都存在該分子的表達(dá)異常,從而限制CTL的激活和對腫瘤細(xì)胞的識別,導(dǎo)致免疫逃逸和對免疫治療的抵抗[1, 14]。

Friedman等曾報(bào)道HLA-I類在子宮內(nèi)膜癌中的缺失非常普遍[8],而本研究發(fā)現(xiàn)即便在腫瘤突變負(fù)荷很高的MMRd子宮內(nèi)膜癌中,該分子的缺失比例也達(dá)到了近50%,提示該分子及其介導(dǎo)的抗原呈遞通路失活在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。由于腫瘤中CD8+TILs密度和ICI的治療敏感性高度相關(guān),我們希望了解HLA-I類能否作為一種標(biāo)志物來預(yù)測MMRd腫瘤中CD8+TILs的浸潤情況,從而間接反應(yīng)腫瘤對ICI治療是否敏感。IHC結(jié)果顯示HLA-I類的表達(dá)情況能較準(zhǔn)確地預(yù)測CD8+TILs密度。

HLA-I類分子缺失可能由遺傳、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后改變引起,從而導(dǎo)致其表達(dá)的不可逆或可逆變化[15～17]。不可逆的HLA-I類缺失往往由于關(guān)鍵基因的結(jié)構(gòu)改變而產(chǎn)生,比如HLA-I類重鏈基因、β2M和TAP編碼基因;而可逆性缺失往往和這些基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后下調(diào)有關(guān)[15, 18]。由于我們未對這些基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異和轉(zhuǎn)錄分析,因此無法判斷這些MMRd子宮內(nèi)膜癌HLA-I類分子缺失的原因。近年來的研究顯示針對可逆性的缺失,靶向HLA-I類抗原呈遞的相關(guān)通路,特別是NF-κB,IFN和NLRC5,能逆轉(zhuǎn)HLA-I類的表達(dá)[19～23]。因此,這些通路也成為了腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述,由于該分子對腫瘤抗原向CTL的呈遞至關(guān)重要,盡管MMRd/MSI-H腫瘤中具有大量的新抗原,HLA-I類缺失的腫瘤也很可能會(huì)因?yàn)榭乖蔬f的失敗導(dǎo)致CTL無法激活并聚集到腫瘤細(xì)胞區(qū)域,從而對免疫治療不響應(yīng)。HLA-I類的IHC染色可能作為一種結(jié)合MMRd/MSI-H的補(bǔ)充性生物標(biāo)志物,用于篩選ICI治療候選患者,避免對該療法不響應(yīng)的患者使用這類藥物。