類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者腸道黏膜屏障功能指標(biāo)及sIgA表達(dá)與外周血淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系探討

王紫璇,倪 華,章 玉,楊立娜

(中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 a.腎臟風(fēng)濕免疫科,b.消化內(nèi)科,四川 成都 610000)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)屬于一種慢性自身免疫性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)RA發(fā)病率為0.3%～0.5%,且呈逐年遞增趨勢(shì)[1,2]。隨著RA分子生物學(xué)及免疫學(xué)研究深入,馬雪雯[3]指出,RA患者體內(nèi)相關(guān)抗體可在出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫痛、晨僵等臨床癥狀之前存在于血液中,說(shuō)明觸發(fā)RA自身免疫的首發(fā)部位可能位于呼吸道、胃腸道等關(guān)節(jié)外的黏膜部位。其中腸道微生物群在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)及建立適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中具有重大意義,而腸黏膜屏障損傷與腸道菌群失調(diào)有著直接聯(lián)系[4]。分泌型免疫球蛋白A(sIgA)是維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的主要物質(zhì),而外周血淋巴細(xì)胞亞群紊亂易造成免疫功能異常,促進(jìn)RA的進(jìn)展[5]。故本文旨在分析RA患者腸道黏膜屏障功能指標(biāo)與sIgA的表達(dá)情況及其與外周血淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019年9月至2022年5月我院收治的126例RA患者(RA組)。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《2018中國(guó)RA診療指南》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)CT、MRI等檢查確診;②病歷資料完整;③患者關(guān)節(jié)壓痛數(shù)量在5個(gè)以上、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)量在3個(gè)以上;④患者均知情同意;⑤患者入院時(shí)處于疾病活動(dòng)時(shí)期且均未接受系統(tǒng)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①其他類(lèi)型骨關(guān)節(jié)炎及結(jié)締組織病;②合并乙型肝炎、肺炎等感染性疾病;③存在骨腫瘤、胃癌等惡性腫瘤或存在嚴(yán)重胃腸道疾病。其中男37例,女89例,年齡58～72歲[(65.34±3.28)歲],病程2月至11年[(5.08±2.15)年],紅細(xì)胞沉降率(56.39±19.27)mm/h;DAS-28評(píng)分(4.82±1.61)分;IgG水平(13.69±3.52)g/L;IgM水平(1.31±0.62)g/L;IgA水平(3.43±1.39)g/L;C3(1.09±0.35)g/L;C4水平[0.2(0.1,0.3)]g/L;RF滴度[111(30,433)]U/ml。選取同期體檢的健康志愿者81例為對(duì)照組,男23例,女58例,年齡57～73歲[(66.07±3.86)歲]。兩組性別、年齡等基線(xiàn)資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法①資料收集:由專(zhuān)業(yè)醫(yī)務(wù)人員在患者入院時(shí),詳細(xì)記錄患者年齡、性別、家族史、吸煙飲酒史、合并癥及各項(xiàng)生化指標(biāo)結(jié)果等臨床資料,并統(tǒng)一納入研究系統(tǒng)進(jìn)行比較。②腸屏障功能評(píng)估:抽取受檢者空腹靜脈血3～4 ml,隨后進(jìn)行離心處理(10 min,3000 r/min),分離血清后將其置于-80 ℃低溫保存待檢。使用DAO/D-乳酸/細(xì)菌內(nèi)毒素聯(lián)檢試劑盒(酶法)定量測(cè)定血清DAO、細(xì)菌內(nèi)毒素及D-乳酸水平。②sIgA水平檢測(cè):患者在采樣前均無(wú)腹瀉、嘔吐史,取糞便稱(chēng)重,加入生理鹽水,將其稀釋為1∶3。隨后進(jìn)行離心處理(2000 r/min,10 min),取上層清液置于-80 ℃低溫保存待檢,采用ELISA法檢測(cè)sIgA水平。③外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè):抽取受檢者肘靜脈血5 ml,使用流式細(xì)胞儀(Calibur,美國(guó)BD公司)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)①比較兩組腸道黏膜屏障功能相關(guān)指標(biāo)及sIgA水平,包括DAO、血細(xì)菌內(nèi)毒素及血D-乳酸。②比較兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群變化情況。③分析T淋巴細(xì)胞亞群與DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素及sIgA的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(Q1,Q3)表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson線(xiàn)性相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腸道黏膜屏障功能相關(guān)指標(biāo)及sIgA水平比較RA組DAO、細(xì)菌內(nèi)毒素、D-乳酸水平高于對(duì)照組,sIgA水平低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組腸道黏膜屏障功能相關(guān)指標(biāo)及sIgA水平比較

2.2 兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群變化情況比較RA組總T淋巴細(xì)胞CD3+、輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞CD4+、抑制/殺傷T淋巴細(xì)胞CD8+及NK淋巴細(xì)胞CD16+CD56+絕對(duì)計(jì)數(shù)低于健康對(duì)照組(P<0.05),兩組B淋巴細(xì)胞CD19+絕對(duì)計(jì)數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)比較 (cell/μl)

2.3 外周血淋巴細(xì)胞亞群與DAO、D-乳酸、細(xì)菌內(nèi)毒素及sIgA的相關(guān)性分析輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞CD4+絕對(duì)計(jì)數(shù)與血清DAO、細(xì)菌內(nèi)毒素、D-乳酸水平呈負(fù)相關(guān),與sIgA呈正相關(guān)(P<0.05);B淋巴細(xì)胞CD19+絕對(duì)計(jì)數(shù)與sIgA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 外周血淋巴細(xì)胞亞群與DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素及sIgA的相關(guān)性分析

3 討論

RA是以B淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)和T淋巴細(xì)胞機(jī)能顯著下降為特征的自身免疫性疾病,具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。但以往多項(xiàng)研究顯示,RA患者存在較為嚴(yán)重的細(xì)胞免疫異常,RA的發(fā)生與外周血淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量及功能紊亂存在聯(lián)系[7,8]。故密切監(jiān)測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化情況在RA的臨床診斷及早期治療中具有重要意義。

2012年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)提出,將RA相關(guān)環(huán)境及遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素階段、無(wú)臨床關(guān)節(jié)炎癥狀階段及RA相關(guān)系統(tǒng)性自身免疫階段總稱(chēng)為RA臨床前期[9]。Greenblatt[10]報(bào)道,部分患者在RA臨床前期未發(fā)生自身免疫性組織損傷的條件下已出現(xiàn)自身抗體水平異常等情況,在環(huán)境、遺傳等多種因素的共同作用下啟動(dòng)自身免疫反應(yīng),造成免疫性組織損傷。且多種基因測(cè)序技術(shù)證實(shí),RA的始動(dòng)源于機(jī)體黏膜系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)部分RA患者腸道乳酸菌豐度增加、嗜血桿菌減少,且上述改變與自身抗體滴度和疾病的活動(dòng)度相關(guān),提示腸道菌群紊亂可出現(xiàn)于RA臨床癥狀之前[11,12]。胡丹[13]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,RA臨床前期人群的腸道菌群使得小鼠腸道黏膜屏障損傷,導(dǎo)致相關(guān)菌群穿透黏膜發(fā)生移位,造成全身免疫系統(tǒng)失衡。因此,本文主要分析RA患者腸道黏膜屏障功能指標(biāo)與sIgA的表達(dá)情況及二者與外周血淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系,旨在為RA的臨床診療提供新思路。DAO、D-乳酸及細(xì)菌內(nèi)毒素等實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)常用于評(píng)估腸黏膜屏障受損情況,而sIgA主要位于腸系膜淋巴結(jié)等黏膜下相關(guān)組織中,其屬于黏膜免疫系統(tǒng)的重要抗體,在復(fù)雜的腸道內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮保護(hù)作用;若sIgA選擇性不足可造成循環(huán)免疫復(fù)合物水平的升高,從而增加消化系統(tǒng)感染性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[14]。本研究結(jié)果顯示,RA組DAO、細(xì)菌內(nèi)毒素、D-乳酸水平高于對(duì)照組。陳昌明等[15,16]研究表明,部分早期RA患者均存在亞臨床腸道炎癥,主要以T、B細(xì)胞及浸潤(rùn)性單核細(xì)胞、CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量增加為典型特征。RA相關(guān)自身免疫及生物標(biāo)志物的改變是在黏膜部位觸發(fā)的,如胃腸道、口腔等部位,當(dāng)腸黏膜屏障完整性被破壞后,導(dǎo)致黏膜通透性增加,造成相關(guān)細(xì)菌產(chǎn)物向血清和淋巴器官的移位,故RA患者DAO、細(xì)菌內(nèi)毒素、D-乳酸水平顯著升高。而腸上皮細(xì)胞形成的動(dòng)態(tài)物理屏障通過(guò)細(xì)胞旁途徑嚴(yán)格控制抗原的運(yùn)輸,當(dāng)腸黏膜受到內(nèi)源性、外源性等不同抗原刺激時(shí),易產(chǎn)生大量sIgA,其能包裹有害病原體抗原且有效中和毒素,抑制病原體黏附于腸上皮表面。本研究中,RA組sIgA水平低于對(duì)照組。說(shuō)明RA患者存在明顯的黏膜免疫功能紊亂,抵御外來(lái)病原微生物的能力減弱,當(dāng)DAO、細(xì)菌內(nèi)毒素、D-乳酸水平升高、sIgA濃度降低則提示RA患者存在腸道黏膜屏障受損。另一方面,本次結(jié)果顯示,RA組CD3+、CD4+、CD8+及CD16+CD56+絕對(duì)計(jì)數(shù)低于對(duì)照組,與黃懿敏[17]研究結(jié)果相似。分析原因在于:RA患者存在免疫調(diào)節(jié)紊亂,由于過(guò)度刺激NK淋巴細(xì)胞CD16+和輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞CD4+,進(jìn)而導(dǎo)致上述細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重衰竭,且隨著抑制/殺傷T淋巴細(xì)胞CD8+的損害,造成CD4+/CD8+比例失調(diào),誘發(fā)B淋巴細(xì)胞過(guò)度增殖,引起自身抗體的大量生成。由于T淋巴細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)及免疫效應(yīng)的雙重功效,其中抑制/殺傷T淋巴細(xì)胞CD8+發(fā)揮免疫抑制作用,而輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞CD4+通過(guò)分泌相關(guān)細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答過(guò)程,而上述兩類(lèi)細(xì)胞在功能上相互制約,共同維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡,若外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及功能紊亂導(dǎo)致該平衡被打破,進(jìn)而引起RA的發(fā)生及發(fā)展[18]。除此之外,本研究顯示,輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞CD4+與血清DAO、細(xì)菌內(nèi)毒素、D-乳酸水平呈負(fù)相關(guān),與sIgA呈正相關(guān),B淋巴細(xì)胞CD19+與sIgA呈負(fù)相關(guān)。目前在已確診的RA和RA前期的患者中已觀察到腸道通透性改變的跡象,腸道菌群在免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)和功能以及個(gè)體對(duì)自身抗原的反應(yīng)中起著基礎(chǔ)性作用。由于自身抗體可在發(fā)炎的腸道內(nèi)產(chǎn)生,當(dāng)腸道炎癥及屏障功能損傷時(shí),腸道組織中的相關(guān)免疫細(xì)胞可進(jìn)入全身部位和關(guān)節(jié),關(guān)節(jié)組織通常被 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn),產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子,促進(jìn)炎癥并最終導(dǎo)致組織破壞,引起RA的發(fā)生[19]。而B(niǎo)淋巴細(xì)胞存在于腸系膜淋巴結(jié)及派氏淋巴結(jié)等腸道相關(guān)淋巴組織中,腸道微生物代謝產(chǎn)物及相關(guān)抗原易促進(jìn)黏膜漿細(xì)胞的分化,易加快B細(xì)胞類(lèi)別轉(zhuǎn)換至IgA型細(xì)胞,其中富含IgA的漿細(xì)胞在免疫應(yīng)答過(guò)程中可分泌大量sIgA。本研究只初步探討腸黏膜屏障功能及sIgA二者與外周血淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系,為RA腸道研究提供新證據(jù),但具體的影響機(jī)制仍需進(jìn)一步分析。

綜上所述,RA患者DAO、細(xì)菌內(nèi)毒素、D-乳酸水平升高,sIgA水平降低;二者與輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞CD4+相關(guān)。