Th1/Th2 免疫平衡偏移介導JAK2-STAT3 信號通路參與感染性早產(chǎn)發(fā)生機制研究

杜凌穎，李忠連，楊瓊艷，佀艷婷，郭 穎

（1.大理大學第一附屬醫(yī)院，云南大理 671000；2.大理白族自治州婦幼保健院，云南大理 671000）

早產(chǎn)是指妊娠滿28 周而不足37 周的分娩〔1〕，每年全球早產(chǎn)兒分娩量約為1 500 萬，早產(chǎn)平均發(fā)生率高達10%，高居妊娠并發(fā)癥首位〔2〕。感染是早產(chǎn)的主要危險因素之一，在引起早產(chǎn)的眾多病因中，感染約占25%～40%〔3〕。感染性早產(chǎn)發(fā)病機制尚不清楚，近年來相關研究聚焦于機體過度炎癥反應及免疫平衡調(diào)節(jié)，妊娠過程中免疫平衡被打破引起的過度炎癥及炎癥因子的過度分泌可能是感染性早產(chǎn)發(fā)生的關鍵。輔助性T 細胞（helper T cell，Th細胞）根據(jù)其分泌不同細胞因子被劃分為Th1 和Th2，Th1/Th2 免疫平衡是機體炎癥調(diào)節(jié)的關鍵，也與正常妊娠的維持密切相關。正常妊娠產(chǎn)婦體內(nèi)Th1/Th2 免疫平衡表現(xiàn)為Th2 占主要優(yōu)勢，國內(nèi)外研究證實，Th1/Th2 免疫平衡的病理性失衡將導致復發(fā)性流產(chǎn)、妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病等不良妊娠結局〔4〕，但Th1/Th2 免疫平衡參與感染性早產(chǎn)的具體機制尚不清楚。Th1/Th2 免疫平衡失衡可引起腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6 等炎癥因子異常表達，這些炎癥因子均參與了妊娠過程，研究〔5〕發(fā)現(xiàn)感染性早產(chǎn)產(chǎn)婦外周血及羊水中均存在這些炎癥因子的異常高表達。IL-6 的生物學功能主要通過Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信號轉導及轉錄激活因子3 （signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信號通路實現(xiàn)，同時JAK2-STAT3 信號通路作為機體炎癥調(diào)控的重要通路，也參與了正常妊娠的維持。本研究通過測定早產(chǎn)及足月分娩產(chǎn)婦外周血清中細胞因子干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、IL-6、TNF-α 表達水平以及胎膜組織中STAT3、核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）表達水平，探討Th1/Th2 免疫平衡偏移情況及其介導的JAK2-STAT3 信號通路傳導與感染性早產(chǎn)發(fā)生的機制，尋求其內(nèi)在的生物學功能和病理損傷相關性，揭示感染性早產(chǎn)炎癥調(diào)控信號通路，為對癥預防策略提供新的治療靶點，并篩選具有臨床價值的診斷因子。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年5月至2021年10月就診于大理大學第一附屬醫(yī)院的早產(chǎn)患者60 例為研究對象，將其納入早產(chǎn)組，根據(jù)早產(chǎn)組患者產(chǎn)后胎膜組織病理檢查結果分為感染性早產(chǎn)組（n=34）和非感染性早產(chǎn)組（n=26）。納入標準：①自然受孕、單胎、孕周明確、分娩孕周為28+0～36+6周者；②分娩方式為自然分娩、臨產(chǎn)后因產(chǎn)程異?；蛱壕狡刃衅蕦m產(chǎn)術者。排除標準：①高齡產(chǎn)婦；②習慣性流產(chǎn)者；③合并有胎盤早剝、前置胎盤、妊娠期高血壓、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、妊娠期糖尿病以及合并甲亢、心臟病等妊娠期合并癥及并發(fā)癥者；④產(chǎn)前有外傷、性交史者；⑤近3 周有絨毛膜羊膜炎之外的其他急慢性感染性疾病者。將同期就診于大理大學第一附屬醫(yī)院的正常足月分娩、無其他妊娠期疾病及合并癥的單胎妊娠產(chǎn)婦20 例納入正常對照組。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集 采集產(chǎn)婦分娩發(fā)動時的外周血，離心后取上清液，-80 ℃保存待測；產(chǎn)婦排出胎盤后，剪取破口處3 cm×3 cm 全層胎膜組織1 塊，24 h內(nèi)經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋待測。

1.2.2 外周血清檢測 血清標本恢復至室溫，采用ELISA 試劑盒檢測IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6 表達水平，以上試劑盒均購自泉州睿信生物科技有限公司。IFN-γ 代表Th1 型細胞因子，IL-4 代表Th2 型細胞因子，用IFN-γ/IL-4 表示Th1/Th2 免疫調(diào)節(jié)平衡指數(shù)（以下簡稱“平衡指數(shù)”）。

1.2.3 胎膜組織檢測 胎膜組織石蠟切片經(jīng)蘇木精-伊紅染色后由2 位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師進行雙盲閱片，根據(jù)炎癥細胞浸潤及組織結構改變程度，診斷胎膜組織是否存在絨毛膜羊膜炎。胎膜組織石蠟切片按照免疫組織化學染色法檢測STAT3、NF-κB 蛋白在胎膜組織中的表達情況。免疫組織化學結果判定：細胞中未出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陰性細胞，反之為陽性細胞，根據(jù)陽性細胞顯色強度進行分級，其中，黃色為弱陽性（計1 分）、棕黃色為陽性（計2 分）、深棕黃色為強陽性（計3 分）。使用Image-ProPlus 圖像分析軟件進行圖像分析，每張切片隨機選取5 個視野，觀察高倍視野中的所有細胞，記錄陽性染色細胞百分數(shù)，其中，0%～1%計0分、2%～10%計1 分、11%～50%計2 分、51%～80%計3 分、81%～100%計4 分。免疫組織化學評分（IHS值）=陽性細胞顯色強度計分×陽性染色細胞百分數(shù)計分。

1.3 統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 9.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x± s）描述，使用單因素方差分析（方差齊）或Brown-Forsythe方差分析（方差不齊）進行比較；不符合正態(tài)分布的計量資料用［M（Q）］描述，使用K-W 秩和檢驗進行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料比較 各組產(chǎn)婦年齡、孕次比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。早產(chǎn)組產(chǎn)婦孕周明顯少于正常對照組產(chǎn)婦，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；感染性早產(chǎn)組與非感染性早產(chǎn)組產(chǎn)婦孕周差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 臨床資料比較（x±s）

2.2 外周血清IFN-γ、IL-4 表達水平及平衡指數(shù)比較 與正常對照組比較，早產(chǎn)組的IFN-γ 水平顯著升高，IL-4 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與非感染性早產(chǎn)組比較，感染性早產(chǎn)組的IFN-γ 水平顯著升高，IL-4 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。比較各組平衡指數(shù)可知，感染性早產(chǎn)組顯著高于其他2組，非感染性早產(chǎn)組顯著高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。上述結果表明，在早產(chǎn)組中，尤其是感染性早產(chǎn)組，Th1/Th2 免疫平衡具有明顯向Th1 方向偏移趨勢。見表2。

表2 IFN-γ、IL-4 表達水平及平衡指數(shù)比較（x±s）

2.3 外周血清TNF-α、IL-6 表達水平比較 感染性早產(chǎn)組的TNF-α、IL-6 水平顯著高于其他2組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與正常對照組比較，非感染性早產(chǎn)組的TNF-α 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但IL-6 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 TNF-α、IL-6 表達水平比較（pg/mL，x±s）

2.4 胎膜組織病理學改變 感染性早產(chǎn)組胎膜組織滿視野遍布中性粒細胞浸潤，部分浸潤蛻膜絨毛膜，并有羊膜組織水腫，且部分細胞已破裂溶解，組織正常形態(tài)消失；非感染性早產(chǎn)組和正常對照組胎膜組織均未見明顯中性粒細胞浸潤，細胞排列整齊，組織完整性好，羊膜層無水腫。見圖1。

2.5 胎膜組織中STAT3、NF-κB 表達水平比較 感染性早產(chǎn)組的STAT3、NF-κB 水平顯著高于其他2組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與正常對照組比較，非感染性早產(chǎn)組的STAT3、NF-κB 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4，圖2～3。

圖2 胎膜組織中STAT3 表達

圖3 胎膜組織中NF-κB 表達

表4 STAT3、NF-κB 表達水平比較（IHS 值）

3 討論

早產(chǎn)發(fā)生率居高不下，嚴重威脅母嬰健康。感染是早產(chǎn)的主要危險因素之一〔2〕，但感染性早產(chǎn)發(fā)病機制尚不清楚，探究感染性早產(chǎn)發(fā)病機制，尋求其內(nèi)在的生物學功能和病理損傷相關性至關重要。分娩的最終發(fā)動機制是前列腺素的合成及分泌，而基質(zhì)金屬蛋白酶、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放和細胞因子表達等也在分娩發(fā)動中起到協(xié)同作用〔6-7〕，當孕婦機體出現(xiàn)過度炎癥反應，往往會導致未足月分娩發(fā)動，孕婦機體的炎癥反應及免疫調(diào)節(jié)可能是感染性早產(chǎn)發(fā)病機制的關鍵。Th1/Th2 免疫平衡及JAK2-STAT3 信號通路作為機體免疫調(diào)節(jié)的關鍵，在妊娠維持中扮演著重要角色。TNF-α 和IL-6 是目前被廣泛研究，且已被證實與妊娠結局密切相關的炎癥因子，TNF-α 作為典型Th1 型細胞因子，可通過激活Toll 樣受體4（Toll-like receptor-4，TLR4）-NF-κB 信號通路促進IL-6 的合成與分泌，而IL-6作為機體重要的炎癥因子，同時也是Th2 型細胞因子，其大部分生物學功能均需通過激活JAK2-STAT3 信號通路實現(xiàn)。由此推測，Th1/Th2 免疫平衡與JAK2-STAT3 信號通路可能通過某種相互作用，共同參與到感染性早產(chǎn)發(fā)病中，但其具體的作用方式及造成的影響尚不清楚，需進行深入探索。

Th1 主要介導細胞免疫，分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α、TNF-β 等炎癥因子；Th2 主要介導體液免疫，分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10 等抗炎因子〔8〕。Th1、Th2 分泌的多種細胞因子共同構建了復雜的細胞因子網(wǎng)絡，維持著母胎免疫平衡，保證妊娠正常進行。近年來，國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)正常妊娠的母體免疫微環(huán)境表現(xiàn)為“Th2 偏移”現(xiàn)象〔9〕，且Th1/Th2免疫平衡向Th1 方向偏移往往與不良妊娠結局有關。Salek 等〔10〕研究表明在復發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型外周血中同時存在Th1 型細胞因子的明顯高表達及Th2 型細胞因子的明顯低表達；周美茜等〔11〕在胎膜早破產(chǎn)婦單個外周核細胞中也發(fā)現(xiàn)Th1 型細胞因子表達水平較正常妊娠產(chǎn)婦明顯升高，而Th2 型細胞因子表達水平則明顯降低，且發(fā)生胎膜早破的孕周越小，Th1 型細胞因子的高表達越明顯。在本研究中，早產(chǎn)組產(chǎn)婦的外周血清中Th1 型細胞因子IFNγ、TNF-α 表達水平均較正常對照組升高，且伴有感染時，細胞因子高水平表達結果更顯著；同時Th2型細胞因子IL-4 在早產(chǎn)組產(chǎn)婦的外周血清中出現(xiàn)了表達下降現(xiàn)象，且在感染性早產(chǎn)組中下降更明顯。綜上所述，無論早產(chǎn)產(chǎn)婦是否伴有感染，Th1/Th2免疫平衡均向Th1 方向偏移，而當早產(chǎn)產(chǎn)婦伴有感染時，這種偏移更加明顯。具體機制可能是當母體受到外來病原體攻擊時，機體細胞免疫加強，Th1 型細胞活躍，分泌大量IFN-γ、TNF-α 等炎癥因子，誘發(fā)機體過度炎癥反應，同時過度表達的IFN-γ 可抑制Th2 型細胞功能，使IL-4、IL-10 等抗炎因子表達水平降低，進一步加劇了機體炎癥反應的失調(diào)。在Th1 型細胞高表達和Th2 型細胞低表達的共同作用下，Th1/Th2 免疫平衡向Th1 方向嚴重偏移，機體炎癥反應失控，最終引起分娩發(fā)動，從而導致感染性早產(chǎn)的發(fā)生。

值得注意的是，IL-6 作為一種多效應的Th2 型細胞因子，因其能調(diào)控多種炎癥急性期反應蛋白的轉錄，主要效應表現(xiàn)為增強炎癥反應，故被劃分為炎癥因子〔12〕。IL-6 參與正常妊娠的全過程，隨著孕期的延長，IL-6 表達水平逐漸增長。IL-6 在感染性早產(chǎn)中也發(fā)揮著重要作用，當病原體侵犯羊膜腔，機體啟動免疫反應，蛻膜、絨毛膜、羊膜等妊娠組織產(chǎn)生大量的IL-6 等炎癥因子，促進前列腺素的合成與分泌，促使宮頸成熟，誘發(fā)宮縮，導致早產(chǎn)。Gomez-lopez 等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，在合并絨毛膜羊膜炎的早產(chǎn)產(chǎn)婦的羊水中，IL-6 表達水平顯著高于無絨毛膜羊膜炎的產(chǎn)婦，且感染性胎膜早破的產(chǎn)婦血清中IL-6 含量顯著升高，而未合并感染的胎膜早破產(chǎn)婦血清中IL-6 含量無明顯升高。

NF-κB 相關信號通路的激活是引起IL-6 釋放的關鍵因素。NF-κB 是一種免疫反應蛋白，可作為轉錄調(diào)控因子參與機體炎癥應答及調(diào)節(jié)。Catalano等〔13〕研究證實宮內(nèi)感染會通過誘導NF-κB 激活造成炎癥因子與抗炎因子平衡被破壞，從而誘發(fā)早產(chǎn)。在TNF-α 等炎癥因子刺激下，TLR4-NF-κB 信號通路被激活，炎癥調(diào)控因子NF-κB 發(fā)生核轉移，與靶基因啟動子或增強子上的NF-κB 結合序列結合，激活IL-6 等多種促炎因子的相關基因，導致IL-6 等炎癥因子的表達水平升高〔14〕，反之，IL-6 的釋放亦能增強NF-κB 的活化〔15〕。本研究中胎膜組織中NF-κB 表達水平變化趨勢與外周血清中IL-6相同，二者在感染性早產(chǎn)產(chǎn)婦體內(nèi)均出現(xiàn)了顯著高表達，但在非感染性早產(chǎn)產(chǎn)婦體內(nèi)二者表達水平與正常足月分娩產(chǎn)婦差異無統(tǒng)計學意義。該結果進一步證實了在感染性早產(chǎn)產(chǎn)婦體內(nèi)不僅存在Th1/Th2免疫平衡向Th1 方向的病理性偏移，且高表達的Th1 型細胞因子TNF-α 等還通過激活TLR4-NFκB 信號通路進一步促進IL-6 等相關炎癥因子的大量合成分泌，引發(fā)聯(lián)級炎癥反應失控。

近年來，感染性早產(chǎn)發(fā)病機制的相關研究多聚焦于母胎界面免疫微環(huán)境及相關分子信號通路，包括JAK-STAT、TLR4-NF-κB 以及環(huán)氧合酶2 等多條信號通路。母胎界面主要由胎膜、蛻膜及子宮組成，一旦母胎界面微環(huán)境免疫平衡失調(diào)，產(chǎn)生過度炎癥，將直接引發(fā)宮頸軟化、宮縮發(fā)動及胎膜早破等系列反應，最終導致早產(chǎn)發(fā)生。JAK2-STAT3 信號傳導通路作為近年來被廣泛研究的、最典型的炎癥相關信號通路之一，在母胎界面免疫調(diào)節(jié)及正常妊娠的維持中至關重要。JAK2-STAT3 信號通路由JAK 相關受體、JAK、STAT 三部分組成，JAK 是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，其本質(zhì)為蛋白質(zhì)，其中JAK2 廣泛存在于機體各種組織細胞中，主要作用是介導配體和受體間信號傳導；STAT3 是STAT 蛋白家族中的一員，與JAK2 共同形成了JAK2-STAT3 信號轉導通路〔16〕。JAK2-STAT3 信號通路的正常激活在維持正常妊娠中不可缺少，Hiraoka等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)孕鼠的子宮上皮細胞及基質(zhì)細胞中均存在STAT3 的高表達，且通過不同的途徑協(xié)同控制子宮的容受性和胚胎著床過程，而敲除STAT3 基因的小鼠會表現(xiàn)出胚胎著床失敗；Nakamura 等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)當孕鼠體內(nèi)STAT3 的活性與傳導受到抑制，將出現(xiàn)胚胎吸收現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)在感染性早產(chǎn)組的胎膜組織中，STAT3 表達水平顯著高于非感染性早產(chǎn)組和正常對照組，且非感染性早產(chǎn)組的STAT3 表達水平較正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，即感染性早產(chǎn)產(chǎn)婦母胎界面存在JAK2-STAT3 信號轉導通路的異常激活。STAT3 表達水平變化趨勢與IL-6、NF-κB 一致。

本研究發(fā)現(xiàn)：在感染性早產(chǎn)組中，產(chǎn)婦機體內(nèi)Th1/Th2 免疫平衡表現(xiàn)為向Th1 方向的病理性偏移，外周血清中IL-6、TNF-α 及胎膜組織中NFκB、STAT3 表達水平異常升高；然而，在非感染性早產(chǎn)組中，產(chǎn)婦體內(nèi)Th1/Th2 免疫平衡雖也表現(xiàn)為向Th1 方向的病理性偏移和TNF-α 的高表達，但IL-6、NF-κB、STAT3 表達水平較正常對照組差異無統(tǒng)計學意義。由此可見，Th1/Th2 免疫平衡可通過TNF-α、NF-κB、IL-6、JAK2-STAT3 信號傳導從而介導JAK2-STAT3 信號通路參與感染性早產(chǎn)的發(fā)生，這種信號轉導僅在感染性早產(chǎn)中被發(fā)現(xiàn)。機制可能是發(fā)生感染時，宿主的巨噬細胞和妊娠組織的淋巴細胞被激活，Th1/Th2 免疫平衡向Th1 方向發(fā)生偏移，TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8 等促炎因子和前列腺素E2 和F2，以及基質(zhì)金屬蛋白酶合成增加，高表達的IFN-γ 抑制了Th2 細胞功能，導致Th2 型細胞因子IL-4 表達明顯降低，進一步加劇了Th1/Th2 免疫平衡向Th1 方向偏移，使機體免疫平衡失調(diào)加重。大量分泌的TNF-α 通過激活TLR4-NF-κB 信號通路促進IL-6 的過量分泌〔14〕，在過量IL-6 的刺激下，JAK2-STAT3 信號通路信號延長，活化的JAK2-STAT3 通路可促使CD4+T 淋巴細胞表達維甲酸相關孤核受體-γt，進而使之分化為Th17 細胞，Th17 細胞可促進其他炎癥細胞釋放IL-6、TNF-α 等炎癥因子，進一步放大炎癥反應〔19〕，機體免疫平衡失調(diào)及過度炎癥反應最終導致感染性早產(chǎn)的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在感染性早產(chǎn)組中，產(chǎn)婦體內(nèi)Th1/Th2 免疫平衡可通過TNF-α、NF-κB、IL-6、JAK2-STAT3 信號傳導從而介導JAK2-STAT3 信號通路參與感染性早產(chǎn)的發(fā)生，但由于本研究納入的樣本量相對較少，且未在非感染性早產(chǎn)組中發(fā)現(xiàn)該信號轉導現(xiàn)象，需進一步探究出現(xiàn)該差異的原因。