二甲雙胍通過COX-2/PGE2/STAT3途徑抑制結(jié)直腸癌的機(jī)制研究*

穆劉凡，黃煌，鄭鵬遠(yuǎn)，米陽(yáng)，劉思濛，梅璐，榮康，南夢(mèng)嬌

（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織2020年公布的數(shù)據(jù)，在世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌在所有惡性腫瘤中發(fā)病率排第3位，而病死率排第2位[1]。2020年結(jié)直腸癌在我國(guó)所有惡性腫瘤中的發(fā)病率排第3位（0.239‰），病死率排第5位（0.12‰）[2]。目前臨床對(duì)結(jié)直腸癌采用以手術(shù)為主的綜合治療，包括化學(xué)治療、放射治療、靶向治療、免疫治療等，但其術(shù)后轉(zhuǎn)移率仍較高。在大多數(shù)情況下，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌仍是一種無法治愈的疾病。也是導(dǎo)致患者死亡的常見原因[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）的過表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)[4]。前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）是COX-2的主要下游催化產(chǎn)物，在結(jié)直腸癌中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其通過刺激前列腺素E2受體信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成[5]。目前已證明在前列腺癌、肺癌和膽管癌中，活化的COX-2/PGE2和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間存在緊密關(guān)系[6-8]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，用于治療2型糖尿病的經(jīng)典口服藥物二甲雙胍（Metformin）具有降低惡性腫瘤發(fā)病率及改善惡性腫瘤患者生存預(yù)后的作用[9]。研究表明，二甲雙胍能夠通過抑制COX2/PGE2/STAT3途徑來抑制前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition,EMT）[10]；通過激活A(yù)MP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）來抑制COX-2的產(chǎn)生，并抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[11]；通過COX2/PGE2/STAT3途徑抑制癌癥干細(xì)胞再繁殖，從而抑制膀胱癌的進(jìn)展[12]。綜上所述，結(jié)直腸癌疾病負(fù)擔(dān)較重，是當(dāng)前腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究旨在探索二甲雙胍是否可以通過COX-2/PGE2/STAT3途徑抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、動(dòng)物及主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞MC38購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物寶藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；28只7周齡無特定病原體級(jí)雄性C57BL/6N小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2020-0008]。在恒壓、恒溫、恒濕條件下喂養(yǎng)，每日光照12 h，使用輻照滅菌維持飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司）喂養(yǎng)。動(dòng)物研究方案已得到鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（倫理編號(hào)：KY2022046）。

CCK-8試劑盒（廣州Biosharp公司，批號(hào)：BS350C），凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，編號(hào)：KGA108），二甲雙胍（上海麥克林生化科技有限公司，編號(hào)：M813341），氧化偶氮甲烷（Azoxymethane,AOM）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：A5486），葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt,DSS）（美國(guó)MP Biomedicals公司，編號(hào)：02160110-CF）。COX-2一抗（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab179800），磷酸化轉(zhuǎn)錄激活因子3一抗（p-signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3）（英國(guó)Abcam公司，編號(hào)：ab76315），STAT3一抗（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab68153），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（武漢Elabscience公司，批號(hào)：E-IR-R212），中國(guó)上海博谷生物科技有限公司，批號(hào)：HEP016）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MC38細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 μL/mL鏈霉素、100 μL/mL青霉素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；SW480細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 μL/mL鏈霉素、100 μL/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞均在37 ℃、5%二氧化碳和高濕度的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。將含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿放置在顯微鏡樣品臺(tái)上，使培養(yǎng)皿位于鏡頭下方。調(diào)節(jié)焦螺旋，使視野清晰度達(dá)到最佳，通過顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞（5×103個(gè)/孔）分別接種到96孔板上，加入100 μL培養(yǎng)基，貼壁后，用不同濃度（0、5、10、20、30和40 mmol/L）的二甲雙胍處理24 h，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。即將CCK-8試劑加入細(xì)胞，并孵育2 h，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值（optical density,OD）。細(xì)胞活力=（ODn-OD0）/（ODc-OD0）×100%（OD0：空白；ODc：未處理對(duì)照；ODn：二甲雙胍處理）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞（2×105個(gè)/孔）分別接種到6孔板上，用20 mmol/L二甲雙胍處理48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞，使用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞。用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，以2 000 r/min離心5 min，加入500 μL的Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC、5 μL Propidium Iodide，混勻，避光孵育10 min，用流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD公司）對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡比例。

1.3 模型復(fù)制

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組 采用完全隨機(jī)法將小鼠分為生理鹽水對(duì)照組（NaCl組）、造模組（AOM + DSS組）、治療組（AOM + DSS + Met組）、二甲雙胍對(duì)照組（Met組），分別有6、8、8和6只。

1.3.2 復(fù)制結(jié)直腸癌小鼠模型 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，于第9周單次腹膜內(nèi)注射AOM（10 mg/kg）；第10周，動(dòng)物飲用水中加入2% DSS，持續(xù)5 d；第11、12周正常飲用水；第13周動(dòng)物飲用水中加入2% DSS，持續(xù)5 d；第14、15周正常飲用水；第16周動(dòng)物飲用水中加入2% DSS；第17、18周正常飲用水；第19周處死小鼠[13]。

1.3.3 干預(yù)措施 在第10周進(jìn)行藥物干預(yù)。NaCl組、AOM + DSS組均用0.9% NaCl溶液300 μL/（d·只）灌胃處理，AOM + DSS + Met組、Met組均用二甲雙胍250 mg/（kg·d·只）灌胃處理，具體干預(yù)措施見圖1。干預(yù)期間小鼠保持基礎(chǔ)飲食。第19周，小鼠空腹12 h后，以4%水合氯醛400 mg/kg腹腔麻醉后，眼球取血，處死小鼠，分離結(jié)腸組織，進(jìn)行下一步研究。

圖1 小鼠模型復(fù)制及處理

1.4 二甲雙胍活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

為觀察二甲雙胍進(jìn)入機(jī)體后能否與機(jī)體的COX-2靶蛋白結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮藥效。筆者以“Metformin”為檢索詞在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索二甲雙胍的分子結(jié)構(gòu)，下載SDF格式的3D Structures，通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)篩選COX-2的最佳蛋白結(jié)構(gòu)，并下載PDB格式文件。借助PyMOL對(duì)核心基因蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行除水、去配體等操作，通過OpenBabel將二甲雙胍的SDF格式轉(zhuǎn)換為mol2格式。運(yùn)行AutoDockTools 1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接，搜集結(jié)合能分值，最后利用PyMOL進(jìn)行可視化分析。

1.5 蘇木精-伊紅染色觀察細(xì)胞形態(tài)

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色操作如下。截取部分結(jié)腸組織，甲醛固定，石蠟包埋，切片。組織切片分別放于二甲苯、無水乙醇中脫蠟、脫苯。從蒸餾水中取出后，放入蘇木精溶液中染色10～30 min；將切片放入1%的鹽酸酒精數(shù)秒至切片變紅即可，流水沖洗使切片返藍(lán)；再次脫水處理；用0.5%伊紅乙醇溶液染色2～5 min；切片脫水透明。將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片，做好標(biāo)記便于后續(xù)觀察。

1.6 免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)腸組織病理變化

截取部分結(jié)腸組織，用福爾馬林固定，石蠟包埋，切片。組織切片分別放于二甲苯、無水乙醇中脫蠟、脫苯；加入檸檬酸鈉抗原修復(fù)15 min。用3%過氧化氫去離子水和山羊血清依次封閉15 min，兔COX-2一抗（1∶500）4 ℃溫育過夜。次日洗去一抗，采用50 μL生物素化二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素依次溫育20 min，二氨基聯(lián)苯胺染色2 min，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min，脫水、透明、中性樹膠封片?？瞻讓?duì)照組使用抗體稀釋液溫育，其余處理相同。

1.7 Western blotting檢測(cè)COX-2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)

按照試劑盒說明書的方法制備電泳凝膠，電泳按照110 V、90 min一步法進(jìn)行，結(jié)束后取出凝膠，制作轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)，按300 mA、90 min恒流電轉(zhuǎn)。取出硝酸纖維素膜，置于含5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，分別加入鼠GAPDH抗體（1∶10 000）、兔COX-2抗體（1∶4 000）、兔p-STAT3抗體（1∶10 000）、兔STAT3抗體（1∶1 500），4 ℃溫育過夜。次日回收一抗，充分清洗后二抗室溫孵育1 h，結(jié)束后充分清洗，曝光儀（美國(guó)Bio-RAD公司）曝光拍照分析。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)PGE2表達(dá)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液以及動(dòng)物血清中的PGE2表達(dá)。細(xì)胞：將兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞（2×105細(xì)胞/孔）分別接種到6孔板上，用20 mmol/L二甲雙胍處理24 h，收集培養(yǎng)基，離心取上清。動(dòng)物：收集動(dòng)物眼球血，離心后收取上清液。

1.9 糞便16S rDNA測(cè)序

送檢前在超凈工作臺(tái)內(nèi)將糞便樣本整合，每個(gè)樣本3～5粒糞便，每組樣本分別放入密封袋內(nèi)，置于干冰，避免污染，同時(shí)標(biāo)記樣本類型、組別和編號(hào)，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，作圖使用GraphPad Prism 8.0和Adobe Photoshop軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（P25，P75）表示，比較用單因素方差分析、t檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)或Wilcoxon檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍與COX-2蛋白核心成分有較好的結(jié)合活性

使用AutoDockTools 1.5.6軟件，將二甲雙胍與COX-2蛋白核心成分進(jìn)行分子對(duì)接，判斷二甲雙胍進(jìn)入機(jī)體后能否與COX-2蛋白核心成分穩(wěn)定結(jié)合。軟件的分子對(duì)接結(jié)果是以能量的高低來判斷二甲雙胍與靶蛋白結(jié)合程度。獲得的連接能量為-5.44 kJ/moL。一般認(rèn)為連接能量< -5 kJ/moL表示化合物與靶點(diǎn)之間結(jié)合活性較好。分子對(duì)接結(jié)果表明二甲雙胍與COX-2蛋白核心靶點(diǎn)之間結(jié)合活性較好。見圖2。

圖2 成分-靶點(diǎn)對(duì)接相互作用模式圖

2.2 二甲雙胍可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

使用不同濃度的二甲雙胍分別處理MC38細(xì)胞和SW480細(xì)胞24 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化?？梢钥吹剑S著二甲雙胍濃度的增加，腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見圖3。

圖3 MC38、SW480細(xì)胞添加不同濃度二甲雙胍后的形態(tài) （×40）

CCK-8法結(jié)果表明，隨著二甲雙胍濃度的增加，2種結(jié)直腸癌細(xì)胞活性率受到抑制（見表1）。隨后，筆者又檢測(cè)了二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡情況的影響，MC38細(xì)胞加入0、20 mmol/L二甲雙胍的細(xì)胞凋亡率分別為（4.13±0.26）%、（12.59±0.65）%，SW480細(xì)胞分別為（5.31±2.13）%、（32.76±7.26）%。2種結(jié)直腸癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-36.197和-10.883，均P=0.000），加入20 mmol/L二甲雙胍后結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡率明顯增加。見表1。

表1 兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞不同濃度二甲雙胍影響下細(xì)胞活性率比較 （%，±s）

表1 兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞不同濃度二甲雙胍影響下細(xì)胞活性率比較 （%，±s）

細(xì)胞MC38細(xì)胞SW480細(xì)胞0 mmol/L 100.42±8.26 100.00±3.19 5 mmol/L 82.31±5.79 94.36±3.84 10 mmol/L 77.85±4.85 92.06±2.13 20 mmol/L 73.89±2.46 88.32±4.92 30 mmol/L 70.44±4.00 85.80±3.70 40 mmol/L 68.44±4.53 81.56±3.08

2.3 二甲雙胍可在體外通過COX2/PGE2/STAT3途徑抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

0、5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理MC38細(xì)胞后COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.89±0.19）、（0.59±0.38）、（0.36±0.18）、（0.17±0.04），0、5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理SW480細(xì)胞后COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.01±0.16）、（0.83±0.18）、（0.53±0.14）、（0.44±0.24）。不同濃度二甲雙胍處理MC38、SW480細(xì)胞后COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.460、6.574，P=0.024、0.015）。二甲雙胍干預(yù)可抑制COX-2蛋白的表達(dá)，且隨著濃度的增加，COX-2蛋白表達(dá)呈藥物劑量依賴性減低。見圖4。

圖4 MC38、SW480細(xì)胞添加不同濃度二甲雙胍后COX-2蛋白的表達(dá)情況

0、20 mmol/L二甲雙胍處理MC38細(xì)胞后PGE2水平分別為（7.40±0.14）、（6.16±0.07）pg/mL，0、20 mmol/L二甲雙胍處理SW480細(xì)胞后PGE2水平分別為（7.91±0.36）、（3.82±0.10）pg/mL。不同濃度二甲雙胍處理MC38、SW480細(xì)胞后PGE2水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.853、18.778，均P=0.000）。0、5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理MC38細(xì)胞后p-STAT3相對(duì)表達(dá)量分別為（1.17±0.26）、（0.87±0.32）、（0.60±0.33）、（0.51±0.24）pg/mL，0、5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理SW480細(xì)胞后p-STAT3相對(duì)表達(dá)量分別為（1.14±0.19）、（0.78±0.08）、（0.45±0.07）、（0.24±0.11）pg/mL。不同濃度二甲雙胍處理MC38細(xì)胞后p-STAT3相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.164，P=0.086）。不同濃度二甲雙胍處理SW480細(xì)胞后p-STAT3相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.626，P=0.000）。二甲雙胍的干預(yù)可以降低STAT3的磷酸化，且隨著濃度的增加，p-STAT3相對(duì)表達(dá)量逐漸減低，但對(duì)STAT3相對(duì)表達(dá)量無抑制作用（見圖5）。說明二甲雙胍可以通過COX2/PGE2/STAT3途徑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。

圖5 MC38、SW480細(xì)胞添加不同濃度二甲雙胍后p-STAT3、STAT3蛋白的表達(dá)情況

2.4 二甲雙胍干預(yù)可抑制結(jié)直腸癌小鼠的腫瘤生長(zhǎng)、分化

2.4.1 各組小鼠腫瘤數(shù)量、體積及結(jié)腸長(zhǎng)度比較NaCl組和Met組小鼠結(jié)腸外觀無明顯異常，而AOM +DSS組和AOM + DSS + Met組小鼠結(jié)腸腔內(nèi)可看到個(gè)數(shù)及體積不等的腫瘤。見圖6。

圖6 各組小鼠結(jié)腸外觀

各組小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量、腫瘤體積及結(jié)腸長(zhǎng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，AOM + DSS組較NaCl組腫瘤數(shù)量增多、體積增大、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（P<0.05），AOM + DSS + Met組較Nacl組結(jié)腸腫瘤數(shù)量增多、體積增大、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（P<0.05），AOM + DSS + Met組較AOM + DSS組結(jié)腸腫瘤數(shù)量減少、腫瘤體積減小（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量、腫瘤體積及結(jié)腸長(zhǎng)度比較（±s）

表2 各組小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量、腫瘤體積及結(jié)腸長(zhǎng)度比較（±s）

組別NaCl組AOM + DSS組AOM + DSS + Met組Met組F 值P 值腫瘤數(shù)量/個(gè)0.00±0.00 4.25±2.63 2.38±1.60 0.00±0.00 10.083 0.000腫瘤體積/mm 0.00±0.00 4.89±2.62 3.15±1.37 0.00±0.00 14.661 0.000結(jié)腸長(zhǎng)度/mm 88.68±7.27 73.78±8.10 78.67±4.34 86.71±6.73 5.130 0.010

2.4.2 HE染色結(jié)果分析 NaCl組和Met組小鼠結(jié)腸低倍鏡下觀察無異常，高倍鏡下可見成型的腺體規(guī)則排列，腺體厚度無明顯改變，細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞核清晰可見，并可見大量的杯狀細(xì)胞。AOM +DSS組小鼠結(jié)腸低倍鏡下觀察可見到明顯的外生型腫瘤；高倍鏡下，大部分腺體排列紊亂，異型增生明顯。部分異形細(xì)胞成團(tuán)聚集，腺體形狀不可明視。細(xì)胞核異型性明顯，核大深染，邊界不清。與AOM+DSS組比較，AOM+DSS+Met組小鼠結(jié)腸低倍鏡下未見腫瘤生長(zhǎng)，高倍鏡下可見部分腺體排列紊亂，但腺體輪廓大致可見，腺體結(jié)構(gòu)可見。見圖7。

2.4.3 二甲雙胍降低結(jié)直腸癌小鼠結(jié)腸組織COX-2、PGE2及p-STAT3相對(duì)表達(dá)量 NaCl組、AOM + DSS組、AOM + DSS + Met組、Met組小鼠COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.40±0.10）、（1.00±0.03）、（0.55±0.18）、（0.14±0.02），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.404，P=0.000）。AOM + DSS組COX-2蛋白的表達(dá)較NaCl組和Met組高。AOM + DSS + Met組COX-2蛋白的表達(dá)較AOM + DSS組低，但仍高于Nacl組和Met組。見圖8。

圖8 各組小鼠結(jié)腸組織COX-2蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，AOM + DSS組COX-2高表達(dá)，用二甲雙胍處理后，AOM + DSS + Met組COX-2表達(dá)降低，NaCl組和Met組幾乎不表達(dá)。見圖9。

圖9 各組小鼠結(jié)腸COX-2蛋白免疫組織化學(xué)染色

NaCl組、AOM + DSS組、AOM + DSS + Met組、Met組小鼠PGE2蛋白水平分別為（1.00±0.53）、（11.16±1.18）、（5.53±1.22）、（0.29±0.10）pg/mL，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=119.555，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AOM + DSS +Met組PGE2蛋白水平較AOM + DSS組低，但高于NaCl組和Met組（P<0.05）。

NaCl組、AOM + DSS組、AOM + DSS + Met組、Met組小鼠STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.03±0.19）、（1.03±0.13）、（0.78±0.18）、（1.15±0.74），經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.301，P=0.079）。NaCl組、AOM + DSS組、AOM + DSS + Met組、Met組小鼠p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.20±0.22）、（1.06±0.09）、（0.59±0.21）、（0.06±0.05），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.535，P=0.000）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，AOM + DSS組p-STAT3表達(dá)量較NaCl組、Met組高，較AOM + DSS組低（P<0.05）。而各組小鼠STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量無明顯差異。結(jié)果表明，二甲雙胍的干預(yù)可以降低STAT3的磷酸化，而對(duì)STAT3總蛋白的表達(dá)沒有抑制作用。見圖10。

圖10 各組小鼠結(jié)腸組織p-STAT3、STAT3蛋白的表達(dá)

2.5 結(jié)直腸癌小鼠腸道菌群16S rDNA高通量測(cè)序

2.5.1 高通序質(zhì)量評(píng)價(jià) 共收集到25個(gè)樣本，其中NaCl組6個(gè)，AOM+DSS組5個(gè)，AOM+DSS+Met組8個(gè)，Met組6個(gè)。共獲得967 272條優(yōu)化序列，序列平均長(zhǎng)度為418 bp，共得到11門15綱42目73科159屬256種660個(gè)操作分類單元。Sobs指數(shù)升高代表菌群豐度增加，多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）表示菌群多樣性。Shannon指數(shù)稀釋曲線趨向平坦，達(dá)到平臺(tái)期，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，該測(cè)序深度可覆蓋全部物種?？梢苑从硺颖局薪^大多數(shù)的微生物多樣性信息。見圖11。

圖11 各樣本多樣性指數(shù)稀釋曲線

2.5.2 屬水平PCoA多樣性分析及指數(shù)組間差異性檢驗(yàn) 不同顏色或形狀的點(diǎn)代表不同分組的樣本，兩樣本點(diǎn)越接近，表明兩樣本組成越相似?？梢钥闯觯趯偎缴?，NaCl組與Met組物種組成基本一致，而NaCl組，AOM+DSS組，AOM + DSS + Met組之間的物種組成均有所差異。見圖12。

圖12 屬水平PCoA多樣性分析

NaCl組Sobs指數(shù)為354.00（313.75，386.25），AOM+DSS組Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)分別為284.00（237.50，306.00）、3.765（3.357，3.908），AOM+DSS+Met組分別為365.50（348.50，382.25）、4.048（3.941，4.215）。NaCl組與AOM + DSS組Sobs指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.191，P=0.028），AOM+DSS組較NaCl組低。AOM + DSS組與AOM+DSS+Met組Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.739和-2.373，P=0.006和0.018），AOM+DSS+Met組較AOM+DSS組高（P<0.05）。表明二甲雙胍治療會(huì)使菌群豐度以及多樣性增加。

2.5.3 各組物種門水平、屬水平群落豐度比較 各組放線菌門、變形菌門、髕骨細(xì)菌門、內(nèi)臟臭氣桿菌屬、普雷沃菌屬、雙歧桿菌屬、糞厭氧棒桿菌屬、埃希氏-志賀氏菌屬群落豐度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NaCl組與AOM + DSS組放線菌門、普雷沃菌屬群落豐度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NaCl組與AOM + DSS + Met組變形菌門、糞厭氧棒桿菌屬、內(nèi)臟臭氣桿菌屬、埃希氏-志賀氏菌屬群落豐度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AOM + DSS組與AOM + DSS + Met組變形菌門、放線菌門、糞厭氧棒桿菌屬、埃希氏-志賀氏菌屬、普雷沃菌屬群落豐度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NaCl組與Met組放線菌門、髕骨細(xì)菌門、變形菌門、雙歧桿菌屬群落豐度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 各組物種門水平、屬水平群落豐度比較 M（P25，P75）

3 討論

在全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率逐年上升。預(yù)計(jì)到2030年全球發(fā)病率將增加60%[14]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并且給社會(huì)帶來極大的疾病負(fù)擔(dān)。目前臨床對(duì)于結(jié)直腸癌多采用以手術(shù)為主的治療，但術(shù)后轉(zhuǎn)移率高。結(jié)直腸癌目前已成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題，研究者也在積極探討有效的治療方法及藥物。本研究結(jié)果證實(shí)了二甲雙胍在體內(nèi)和體外均可以抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和分化，并闡明了這種抑制作用是通過COX-2/PGE2/STAT3途徑來實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果首先證實(shí)了二甲雙胍與COX-2具有較高的結(jié)合活性。然后使用不同濃度的二甲雙胍分別對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系MC38和人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480進(jìn)行處理，結(jié)果表明，二甲雙胍可以抑制兩種結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，二甲雙胍還可以抑制兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞系COX-2、PGE2以及p-STAT3的表達(dá)。接下來，筆者使用AOM和DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌的小鼠模型，二甲雙胍干預(yù)后進(jìn)行取材分析，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍也可以減少腫瘤的數(shù)量以及體積。同樣，筆者檢測(cè)了小鼠結(jié)腸中COX-2、PGE2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)情況，與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，二甲雙胍也可以抑制小鼠結(jié)腸組織中COX-2、PGE2以及p-STAT3的表達(dá)，但不影響STAT3蛋白的含量。

有臨床研究表明，二甲雙胍也可降低直腸癌新輔助同步放化療患者中癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[15]。而其對(duì)于結(jié)直腸癌的抑制作用可能是通過以下機(jī)制發(fā)生的：二甲雙胍可以通過AMPK和胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子途徑靶向作用于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[16-17]；SABER等[18]證明二甲雙胍與5-氨基水楊酸組合可抑制炎性介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、COX-2等，滅活核因子κB和STAT3進(jìn)一步降低基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，減少結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；二甲雙胍可以使細(xì)胞周期停滯[19]。而本研究闡明了二甲雙胍抑制結(jié)直腸癌的新途徑：二甲雙胍可以通過COX-2/PGE2/STAT3信號(hào)通路來抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。COX-2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGE2的一種限速酶，PGE2作為COX-2的下游產(chǎn)物，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，促進(jìn)血管生成，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)表明，在結(jié)直腸腫瘤中，COX-2/PGE2與STAT3關(guān)系密切[20]。p-STAT3蛋白變構(gòu)后可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和轉(zhuǎn)移等[21]。并且有研究者發(fā)現(xiàn)，PGE2抑制劑如非甾體抗炎藥可通過抑制COX-2/PGE2途徑降低結(jié)直腸癌的發(fā)生[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍也可以通過COX-2/PGE2通路抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)，這種作用是通過抑制STAT3的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。而已有的研究表明，在前列腺癌[10]、膀胱癌[12]中，二甲雙胍均可以抑制COX-2/PGE2/STAT3信號(hào)通路來抑制腫瘤的遷移和侵襲，這與本研究結(jié)果是一致的，提示這可能是二甲雙胍發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。結(jié)直腸癌主要包括三種來源：散發(fā)性、遺傳性、與結(jié)腸炎相關(guān)，其中85%～90%的散發(fā)性結(jié)直腸癌均來源于腺瘤-腺癌途徑[23]。從腺瘤發(fā)展到腺癌需要數(shù)年的時(shí)間，除了生活方式的干預(yù)，化學(xué)預(yù)防也是一個(gè)重要手段。本研究結(jié)果表明，使用二甲雙胍干預(yù)的小鼠模型，結(jié)直腸癌生長(zhǎng)的數(shù)量、體積以及細(xì)胞異型性均顯著低于實(shí)驗(yàn)組。而HIGURASHI等[24]研究也表明，口服二甲雙胍（250 mg/d）的結(jié)腸息肉量和腺瘤發(fā)生的概率明顯低于安慰劑組（38.0% vs 56.6%，30.6%vs 51.6%）。且二甲雙胍價(jià)格低廉、易獲得、副作用小，是很有潛力的化學(xué)預(yù)防藥物。

腸道由豐富多樣的微生物群落組成，統(tǒng)稱為“腸道微生態(tài)”[25]。腸道微生態(tài)組成的改變被認(rèn)為是一種生態(tài)失調(diào)，與許多人類疾病有關(guān)，包括腫瘤[26]。結(jié)直腸癌的已知危險(xiǎn)因素，如飲食習(xí)慣、吸煙、肥胖等[27-28]，可以改變腸道微生態(tài)的組成。因此，研究者推測(cè)，某些結(jié)腸微生物或原籍菌的改變可能產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的微環(huán)境。有證據(jù)表明，二甲雙胍會(huì)引起人類腸道微生物群（如腸道細(xì)菌豐度降低）和腸道代謝組（如丁酸鹽產(chǎn)生增加）的顯著變化[29-30]。而其是否能夠通過改變腸道菌群來抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，還需進(jìn)一步闡明。因此，本研究16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示，AOM+DSS組的群落豐度減少，而經(jīng)過二甲雙胍治療后，群落豐度有所增加。在成人中，正常腸道菌群的主要細(xì)菌門是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，前2個(gè)在健康成人中普遍存在[31]；而主要的細(xì)菌屬是厭氧菌屬，如擬桿菌屬、真桿菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌屬和糞桿菌屬。大多數(shù)厚壁菌門是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可以水解腸道中的碳水化合物和蛋白質(zhì)。擬桿菌門主要有助于多糖吸收和蛋白質(zhì)合成的類固醇、多糖和膽汁酸，其成員可以將腸道中的多糖分解為短鏈脂肪酸，從而增加腸黏膜的通透性并促進(jìn)炎癥，兩者相輔相成，促進(jìn)宿主體內(nèi)能量的吸收。本研究結(jié)果中，在門水平上，與NaCl組相比，AOM+DSS組的小鼠放線菌門平均相對(duì)豐度明顯下降，而與AOM+DSS組相比，AOM+DSS+Met組的小鼠變形菌門、放線菌門的平均相對(duì)群落豐度增加，表明二甲雙胍可以改善腸道菌群，使之趨向正?；６∷崴缶且环N來自轉(zhuǎn)基因的益生菌，通過在腸道中發(fā)酵纖維來產(chǎn)生丁酸鹽。而有文獻(xiàn)指出，丁酸鹽處理可以顯著降低小膠質(zhì)細(xì)胞COX-2水平[32]。本研究尚未發(fā)現(xiàn)二甲雙胍與丁酸梭菌的關(guān)系，在后續(xù)研究中筆者將進(jìn)一步展開探索。

綜上所述，二甲雙胍可以通過COX-2/PGE2/STAT3途徑抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡；另外，二甲雙胍可以促使結(jié)直腸癌模型小鼠的腸道菌群向正常菌群改變。雖然其臨床有效性、安全性還有待進(jìn)一步探討，但基于以上研究成果，二甲雙胍有望成為一種新型的預(yù)防、輔助治療結(jié)直腸癌的藥物。