• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    MicroRNA-218、microRNA-193b在宮頸癌組織中的表達(dá)及與化療耐藥性的關(guān)系*

    2023-11-08 11:03:18吳玲姣鄧潔徐瑤彭聰徐蕾
    關(guān)鍵詞:紫杉醇耐藥性宮頸癌

    吳玲姣,鄧潔,徐瑤,彭聰,徐蕾

    (成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 婦科,四川 成都 610500)

    宮頸癌是全球女性癌癥死亡的第四大原因,是目前影響全球女性健康的重要難題[1]。數(shù)據(jù)調(diào)查顯示,全球每年約50萬宮頸癌新發(fā)病例,我國每年宮頸癌新發(fā)病例約12萬,其中4.8萬患者死于宮頸癌[2]。外科手術(shù)切除、輔助放化療等綜合治療是目前臨床治療宮頸癌的常用手段。國內(nèi)外研究已證實化療可顯著改善宮頸癌患者臨床療效,使患者獲得生存收益,但長期使用化療藥物可引起宮頸癌患者出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,降低藥物效價,最終導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、病情進展,影響患者預(yù)后[3-4]。如何有效抑制化療藥物耐藥已成為宮頸癌治療的關(guān)鍵,深入探討宮頸癌患者化療耐藥機制對于尋找宮頸癌治療新手段具有重要意義。

    近期研究發(fā)現(xiàn)化療藥物耐藥性與microRNA(miRNA)調(diào)控的不同耐藥基因表達(dá)的變化密切相關(guān)[5]。miRNA是一類小的非編碼RNA,由19~29個核苷酸組成,通過堿基配對與靶基因結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá),進而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫反應(yīng)逃避及化療抗性等過程[6]。在宮頸癌中,已證實microRNA-218(miR-218)可作為腫瘤抑制因子調(diào)節(jié)與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞進程[7];microRNA-193b(miR-193b)與腫瘤患者抗腫瘤藥物順鉑敏感性密切相關(guān)[8]。目前關(guān)于miR-218、miR-193b在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與化療耐藥性的關(guān)系尚缺乏報道,本研究探討上述問題,以期為宮頸癌新的治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物提供參考。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取2018年1月—2023年1月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的101例行手術(shù)治療的宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《子宮頸癌診斷與治療指南(2021年版)》[9]中宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn);②首次確診且行宮頸癌手術(shù),術(shù)后行化療;③年齡> 18歲。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫缺陷;②重要臟器功能障礙;③伴其他部位惡性腫瘤;④醫(yī)患溝通障礙;⑤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,伴性病、陰道炎等疾??;⑥術(shù)前血栓高度風(fēng)險、術(shù)前行放化療;⑦既往有子宮頸手術(shù)史;⑧伴手術(shù)禁忌證;⑨依從性差、自然失訪。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),患者及家屬簽署知情同意書。

    1.2 方法

    1.2.1 手術(shù)及取材 參照《子宮頸癌診斷與治療指南(2021年版)》[9],患者行手術(shù)治療(包括保留生育功能手術(shù)、不保留生育功能手術(shù)、盆腔廓清術(shù)、腹主動脈±平羌淋巴結(jié)切除分期手術(shù)),切除原發(fā)病灶,術(shù)后行病理檢查確認(rèn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,并給予化療。將距腫瘤組織> 2 cm的組織作為癌旁組織。

    1.2.2 癌組織化療耐藥性測定 將一部分癌組織標(biāo)本消化制成細(xì)胞懸液后行化療藥物敏感性測定,將腫瘤組織剪成糊狀碎塊,消化酶消化,調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個/mL;取單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板(180 μL/孔)中,分別加入藥物終濃度為血漿峰值濃度的紫杉醇(58 mg/L)、順鉑(102 mg/L)、阿霉素(64 mg/L)、5-氟尿嘧啶(82 mg/L)、卡鉑(43 mg/L),設(shè)5種測試濃度(測試藥物的0.125、0.250、0.500、1.000、2.000倍),每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。標(biāo)本在37 ℃、5%二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,添加10μL 噻唑藍(lán)(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,每孔加入100μL鹽酸異丙醇(0.04 N),靜置10 min,用多功能微孔板檢測儀檢測,計算平均值。腫瘤細(xì)胞抑制率=[1-(X-Mi)/(Mo-Mi)]×100%(X、Mo、Mi為熒光強度抑制率),計算出殺傷50%腫瘤細(xì)胞所需藥物濃度(IC50)和IC90,將IC90 > 100%測試藥物濃度、IC50 > 25%測試藥物濃度記為耐藥。

    1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測癌組織、癌旁組織miR-218、miR-193b表達(dá) 宮頸癌組織和癌旁組織在液氮中研碎,勻漿后使用QIACEN RNeasy Mini試劑盒(日本TaKaRa株式會社)分別提取癌及癌旁組織總RNA,分離miRNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng),反應(yīng)體系20 μL,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,93 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,60 ℃拉伸30 s,共40個循環(huán)。內(nèi)參U6,繪制熔解曲線,CT值為基礎(chǔ),2-ΔΔCT法計算miR-218、miR-193b相對表達(dá)量。見表1。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗;計數(shù)資料以構(gòu)成比或率(%)表示,比較用χ2檢驗;繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對表達(dá)量比較

    癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對表達(dá)量比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),癌組織中miR-218相對表達(dá)量低于癌旁組織,miR-193b相對表達(dá)量高于癌旁組織。見表2。

    表2 癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對表達(dá)量比較 (n =101,±s)

    表2 癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對表達(dá)量比較 (n =101,±s)

    組織癌旁組織癌組織t 值P 值miR-218 8.04±1.23 3.82±0.47 20.294 0.000 miR-193b 0.47±0.09 2.01±0.38 38.127 0.000

    2.2 宮頸鱗癌與宮頸腺癌患者常用化療藥物耐藥情況比較

    宮頸癌患者對體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑的耐藥率分別為38.61%(39/101)、46.53%(47/101)、48.51%(49/101)、26.73%(27/101)、40.59%(41/101)。宮頸鱗癌與宮頸腺癌患者對體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑耐藥率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

    表3 宮頸鱗癌與宮頸腺癌患者常用化療藥物耐藥情況 例(%)

    2.3 不同耐藥宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對表達(dá)量比較

    對體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑不同耐藥情況的宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對表達(dá)量比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),耐藥患者癌組織中miR-218相對表達(dá)量均低于敏感患者,miR-193b相對表達(dá)量均高于敏感患者。見表4。

    表4 不同耐藥情況的宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對表達(dá)量比較 (±s)

    表4 不同耐藥情況的宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對表達(dá)量比較 (±s)

    藥物n t 值P 值t 值P 值紫杉醇2.456 0.016 3.002 0.003順鉑4.281 0.000 2.955 0.004阿霉素2.145 0.034 2.559 0.012 5-氟尿嘧啶2.309 0.023 2.278 0.025卡鉑耐藥情況耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感39 62 47 54 49 52 27 74 41 60 miR-218 3.67±0.52 3.91±0.45 3.58±0.57 4.02±0.46 3.69±0.63 3.94±0.54 3.63±0.53 3.89±0.49 3.55±0.58 3.99±0.64 3.523 0.001 miR-193b 2.13±0.35 1.93±0.31 2.09±0.28 1.94±0.23 2.07±0.26 1.95±0.21 2.11±0.33 1.97±0.25 2.16±0.32 1.91±0.22 4.656 0.000

    2.4 癌組織miR-218、miR-193b預(yù)測宮頸癌患者化療耐藥性的價值

    ROC曲線分析結(jié)果顯示,miR-218、miR-193b及兩者聯(lián)合預(yù)測宮頸癌患者化療耐藥性的敏感性分別為74.51%(95% CI:0.601,0.852)、70.59%(95% CI:0.560,0.821)、82.35%(95% CI:0.686,0.911),特異性分別為74.00%(95% CI:0.594,0.849)、78.00%(95%CI:0.637,0.880)、90.00%(95% CI:0.774,0.963),曲線下面積分別為0.754(95% CI:0.661,0.847)、0.743(95% CI:0.643,0.843)、0.890(95% CI:0.824,0.956)。見圖1和表5。

    圖1 癌組織中miR-218、miR-193b表達(dá)預(yù)測宮頸癌患者化療耐藥性的ROC曲線

    表5 癌組織中miR-218、miR-193b表達(dá)預(yù)測宮頸癌患者化療耐藥性的效能

    3 討論

    宮頸癌的一線化療藥物多為鉑類化合物、紫杉烷類等,順鉑的作用機制是基于鏈內(nèi)和鏈間DNA交聯(lián)的形成,順鉑可通過抑制DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄,最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡,ABC家族的藥物轉(zhuǎn)運蛋白異常表達(dá)可造成順鉑回流增加,或有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)減少,導(dǎo)致順鉑攝取減少,在細(xì)胞內(nèi)順鉑又可以被含巰基的分子滅活,致使癌細(xì)胞對順鉑敏感性降低;紫杉醇可與β-微管蛋白亞基結(jié)合,從而穩(wěn)定微管并阻斷有絲分裂,細(xì)胞分裂受阻,從而導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡,紫杉醇耐藥性中最重要的因素為ABC家族的藥物轉(zhuǎn)運蛋白的過度表達(dá);此外致密的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的豐富表達(dá)可限制化療藥物滲透到癌組織中;miRNA是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳機制,其耐藥機制的產(chǎn)生均與miRNA調(diào)節(jié)的耐藥基因表達(dá)改變有關(guān)[10]。宮頸癌中miRNA概況的體內(nèi)外研究也表明,與耐藥細(xì)胞系/組織相比,敏感細(xì)胞系/組織中miRNA的特征發(fā)生了明顯變化[11]。miRNA可通過堿基配對與靶基因結(jié)合,轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)多個基因的表達(dá)使靶基因降解或抑制靶基因翻譯,miRNA能夠通過識別目標(biāo)mRNA的3'-非翻譯區(qū)末端的非必要互補序列來與許多基因結(jié)合,控制基因表達(dá)并影響細(xì)胞代謝、增殖、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過程。miRNA作為腫瘤抑制因子或致癌基因,調(diào)節(jié)大量基因和信號通路,可用于預(yù)測宮頸癌患者對化療的反應(yīng),是預(yù)測治療反應(yīng)的合適生物標(biāo)志物。

    本研究結(jié)果顯示,癌組織中miR-218相對表達(dá)量低于癌旁組織,miR-193b相對表達(dá)量高于癌旁組織,說明miR-218、miR-193b表達(dá)與宮頸癌發(fā)生關(guān)系密切。miRNA在許多細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能中起著重要作用,在調(diào)節(jié)包括分化、血管生成和細(xì)胞周期在內(nèi)的多種信號通路和生物過程中起核心作用。因此miRNA表達(dá)的改變與包括癌癥在內(nèi)的大量疾病有關(guān)。在癌細(xì)胞中,miRNA可作為抑癌基因或致癌基因,抑癌miRNA可通過負(fù)調(diào)控癌基因的表達(dá)來抑制腫瘤的發(fā)展,且在癌細(xì)胞中表達(dá)降低;致癌基因在癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并通過抑癌基因的負(fù)調(diào)節(jié)促進腫瘤發(fā)展。

    本研究結(jié)果顯示,101例宮頸癌患者行體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑的耐藥率分別為38.61%、46.53%、48.51%、26.73%和40.59%,提示宮頸癌患者化療耐藥風(fēng)險較高。越來越多的證據(jù)指出,miRNA在包括宮頸癌、卵巢癌在內(nèi)的各種癌癥的耐藥性方面發(fā)揮著重要作用。耐藥患者癌組織中miR-218相對表達(dá)量低于敏感患者,miR-193b相對表達(dá)量高于敏感患者,提示miR-218、miR-193b表達(dá)與宮頸癌患者化療耐藥有關(guān)。miR-218作為一種抑癌基因,上調(diào)miR-218表達(dá)可通過靶向下調(diào)蛋白磷酸酶甲酯e1、cyclin E2/smc4、磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶1進而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-218通過靶向Glut1k可增加膀胱癌對順鉑的敏感性[12];miR-218-5p通過prkce/Mdr1軸調(diào)控膽囊癌對吉西他濱的敏感性[13];miR-218通過調(diào)控ppp2r5a/Wnt信號通路促進口腔癌順鉑耐藥[14];miR-218-5p靶向EGln3抑制肺腺癌增殖、遷移和侵襲[15]。筆者推測miR-218可能通過多種信號通路途徑調(diào)節(jié)宮頸癌患者基因和信號通路,進而介導(dǎo)化療藥物耐藥性。GRABOWSKA等[16]研究顯示,膠質(zhì)母細(xì)胞腫瘤中miR-218的減少影響細(xì)胞外基質(zhì)組成和細(xì)胞生物力特征,細(xì)胞外基質(zhì)及膠質(zhì)母腫瘤細(xì)胞剛性的變化可促進腫瘤細(xì)胞侵襲。CRUZ-de la ROSA等[11]研究顯示,miR-218-5p/Runx2軸正向調(diào)節(jié)增殖與宮頸癌的不良預(yù)后相關(guān)。吳雄健等[17]研究顯示,上調(diào)miR-218/Nedd9軸可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。王旭等[18]研究指出,miR-218-5p可靶向血管內(nèi)皮生長因子A基因促進宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡并抑制遷移。李正雄等[19]研究顯示,長鏈非編碼RNA鐵蛋白重鏈1假基因3靶向miR-218促使其表達(dá)下調(diào),可降低人肺癌順鉑耐藥細(xì)胞對順鉑的化療敏感性。

    Polo樣激酶1是細(xì)胞周期進程和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,miR-193b-5p可通過靶向Polo 樣激酶1 mRNA的3'-端非編碼區(qū),抑制Polo樣激酶1表達(dá),miR-193b-5p過表達(dá)可通過抑制Polo樣激酶1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,HapMap細(xì)胞系中,miR-193b過表達(dá)會增加卡鉑和順鉑的耐藥性[20]。Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在癌細(xì)胞獲得性化療耐藥性中起關(guān)鍵作用,髓樣細(xì)胞白血病-1是抗凋亡Bcl-2家族蛋白的重要成員,在預(yù)后不良的人類癌細(xì)胞中過表達(dá),miR-193b可通過下調(diào)髓樣細(xì)胞白血病-1來調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞對多柔比星的耐藥性[21];筆者推測miR-193b可能通過調(diào)節(jié)宮頸癌患者基因和信號通路表達(dá),進而介導(dǎo)化療藥物耐藥性,但具體作用機制仍需后期進一步探討。陳晨晨等[22]研究指出,miR-193b的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲能力密切相關(guān),且miR-193b可通過靶向于Mcl-1增強紫杉醇對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的殺傷效力。杜文霞等[23]研究指出,miR-193b在宮頸癌組織中呈高表達(dá),沉默miR-193b可增加HeLa細(xì)胞對順鉑的敏感性,作用機制可能與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路有關(guān)。miR-193b的表達(dá)與腫瘤直徑以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性有關(guān)[24];外泌體miR-193b-3p通過靶向Zbtb7a促進精原細(xì)胞瘤中的順鉑敏感性[8]。ROC曲線結(jié)果顯示,miR-218聯(lián)合miR-193b預(yù)測宮頸癌患者化療耐藥性的敏感性、特異性、曲線下面積最高,提示miR-218聯(lián)合miR-193b預(yù)測宮頸癌患者化療耐藥性效能良好。

    綜上所述,宮頸癌組織中miR-218表達(dá)低于癌旁組織、miR-193b表達(dá)高于癌旁組織,miR-218、miR-193b的表達(dá)水平與宮頸癌患者化療耐藥性有關(guān),兩者聯(lián)合預(yù)測宮頸癌患者化療耐藥性效能良好。后期仍需更多臨床與基礎(chǔ)研究進一步驗證本研究結(jié)論。

    猜你喜歡
    紫杉醇耐藥性宮頸癌
    長絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    中老年女性的宮頸癌預(yù)防
    嬰幼兒感染中的耐藥菌分布及耐藥性分析
    WHO:HIV耐藥性危機升級,普及耐藥性檢測意義重大
    紫杉醇脂質(zhì)體與紫杉醇不同途徑灌注治療兔舌癌的療效研究
    脂質(zhì)體紫杉醇周療方案與普通紫杉醇治療乳腺癌的療效及不良反應(yīng)比較
    Hepsin及HMGB-1在宮頸癌組織中的表達(dá)與侵襲性相關(guān)性分析
    E-cadherin、Ezrin在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義
    食管疾病(2015年3期)2015-12-05 01:45:07
    護理干預(yù)對預(yù)防紫杉醇過敏反應(yīng)療效觀察
    紫杉醇新劑型的研究進展
    亚洲欧美激情综合另类| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品日韩av在线免费观看 | 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲第一电影网av| 一区二区三区精品91| 日韩欧美三级三区| 99国产精品一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 午夜福利,免费看| 又紧又爽又黄一区二区| 日日夜夜操网爽| 校园春色视频在线观看| 女警被强在线播放| 51午夜福利影视在线观看| av视频免费观看在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久亚洲精品不卡| 日韩国内少妇激情av| 国产精品 欧美亚洲| 一夜夜www| av在线播放免费不卡| 亚洲电影在线观看av| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品1区2区在线观看.| 精品不卡国产一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 俄罗斯特黄特色一大片| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精华一区二区三区| 久久香蕉激情| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人啪精品午夜网站| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲熟妇熟女久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产成人精品久久二区二区免费| 怎么达到女性高潮| 国产1区2区3区精品| 超碰成人久久| 香蕉久久夜色| 女性被躁到高潮视频| 国产精品野战在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产麻豆成人av免费视频| 免费高清在线观看日韩| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲电影在线观看av| 日韩国内少妇激情av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久青草综合色| 欧美中文综合在线视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 精品国产乱码久久久久久男人| 嫩草影院精品99| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲片人在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 天天一区二区日本电影三级 | 国产乱人伦免费视频| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久香蕉激情| 中国美女看黄片| 亚洲七黄色美女视频| 午夜福利免费观看在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 88av欧美| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久精品成人免费网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产男靠女视频免费网站| 久久香蕉精品热| 又紧又爽又黄一区二区| 在线观看www视频免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 老司机福利观看| 女警被强在线播放| cao死你这个sao货| 88av欧美| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美黑人精品巨大| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 国产精品野战在线观看| svipshipincom国产片| 大码成人一级视频| 成人亚洲精品av一区二区| av福利片在线| 久久九九热精品免费| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 两个人免费观看高清视频| 精品久久久精品久久久| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美日韩乱码在线| 国产一区二区在线av高清观看| 久热这里只有精品99| 乱人伦中国视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 老司机在亚洲福利影院| 欧美最黄视频在线播放免费| 国内精品久久久久精免费| 国产av一区在线观看免费| 高清在线国产一区| 久久影院123| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲人成电影免费在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日韩欧美免费精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女| www.999成人在线观看| 国产不卡一卡二| 国产av在哪里看| 久久久国产欧美日韩av| 男人舔女人的私密视频| 12—13女人毛片做爰片一| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 不卡一级毛片| 国产视频一区二区在线看| 一区二区三区激情视频| 成年版毛片免费区| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品久久电影中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 免费在线观看黄色视频的| 夜夜爽天天搞| 狠狠狠狠99中文字幕| 一个人免费在线观看的高清视频| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品免费一区二区三区在线| 丰满的人妻完整版| 欧美黑人精品巨大| av欧美777| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲国产看品久久| 日韩免费av在线播放| 超碰成人久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 在线观看舔阴道视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲成人久久性| 中文字幕久久专区| 欧美色视频一区免费| 国产私拍福利视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| а√天堂www在线а√下载| 一区二区三区高清视频在线| 黄色a级毛片大全视频| 日韩高清综合在线| 亚洲av第一区精品v没综合| av超薄肉色丝袜交足视频| 日韩av在线大香蕉| 男女之事视频高清在线观看| cao死你这个sao货| 电影成人av| 18美女黄网站色大片免费观看| 午夜福利视频1000在线观看 | 久久午夜亚洲精品久久| 日本a在线网址| 99国产精品一区二区蜜桃av| a在线观看视频网站| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩av在线大香蕉| 日本a在线网址| 久9热在线精品视频| 在线观看日韩欧美| 久久这里只有精品19| 中文字幕色久视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 可以在线观看的亚洲视频| 99精品久久久久人妻精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 中文字幕色久视频| 99久久精品国产亚洲精品| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲精品国产一区二区精华液| av片东京热男人的天堂| 视频在线观看一区二区三区| 女警被强在线播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产精品爽爽va在线观看网站 | 国产一卡二卡三卡精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 99国产综合亚洲精品| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲成av人片免费观看| www.www免费av| 一级作爱视频免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 两性夫妻黄色片| 可以免费在线观看a视频的电影网站| bbb黄色大片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 黄片小视频在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 一二三四在线观看免费中文在| 级片在线观看| 99香蕉大伊视频| 制服丝袜大香蕉在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 自线自在国产av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 正在播放国产对白刺激| 久99久视频精品免费| 18禁美女被吸乳视频| 黄片小视频在线播放| 午夜福利欧美成人| 日本五十路高清| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲,欧美精品.| 91成年电影在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久久国产成人免费| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 91老司机精品| 欧美日韩精品网址| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产一区二区激情短视频| 成人免费观看视频高清| 91av网站免费观看| 国产麻豆成人av免费视频| 中文字幕色久视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 丰满的人妻完整版| 91精品三级在线观看| 变态另类丝袜制服| 久久久国产精品麻豆| 免费看十八禁软件| 在线观看免费日韩欧美大片| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜久久久久精精品| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 91精品三级在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 一级毛片精品| 亚洲成人久久性| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 青草久久国产| 怎么达到女性高潮| 欧美亚洲日本最大视频资源| 90打野战视频偷拍视频| 在线观看日韩欧美| 国内精品久久久久精免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 88av欧美| 日韩高清综合在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 在线观看舔阴道视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 午夜福利一区二区在线看| 黄片大片在线免费观看| 午夜福利成人在线免费观看| 91精品国产国语对白视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 无遮挡黄片免费观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 在线观看午夜福利视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久久久久久久中文| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 嫩草影院精品99| 婷婷丁香在线五月| 9热在线视频观看99| 国产精品久久久久久精品电影 | 淫秽高清视频在线观看| 久9热在线精品视频| 一级毛片精品| 悠悠久久av| 精品一品国产午夜福利视频| 91成年电影在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 91老司机精品| 日本黄色视频三级网站网址| 搡老岳熟女国产| 嫩草影院精品99| 99精品久久久久人妻精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久久久九九精品影院| 午夜久久久在线观看| 天天一区二区日本电影三级 | 青草久久国产| 久久人妻av系列| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 精品欧美一区二区三区在线| 黄色a级毛片大全视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产成人影院久久av| 中出人妻视频一区二区| 不卡av一区二区三区| 国产99白浆流出| 婷婷六月久久综合丁香| 大陆偷拍与自拍| 老司机午夜十八禁免费视频| 看免费av毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美在线一区亚洲| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 亚洲中文字幕日韩| 波多野结衣高清无吗| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 18禁美女被吸乳视频| 日韩高清综合在线| 99久久精品国产亚洲精品| 一级毛片精品| 精品福利观看| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品,欧美在线| 欧美成人性av电影在线观看| 午夜精品在线福利| 国产精品亚洲av一区麻豆| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲av美国av| 亚洲精华国产精华精| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费观看人在逋| 欧美中文日本在线观看视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲最大成人中文| 国产99白浆流出| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 最近最新免费中文字幕在线| 大码成人一级视频| 欧美乱色亚洲激情| 久久久国产欧美日韩av| 久久久国产精品麻豆| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 少妇熟女aⅴ在线视频| 在线视频色国产色| 一夜夜www| 国产精品亚洲av一区麻豆| 热re99久久国产66热| 黄色女人牲交| 亚洲av电影在线进入| 麻豆国产av国片精品| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美精品亚洲一区二区| 日本五十路高清| 免费av毛片视频| 欧美在线一区亚洲| 亚洲免费av在线视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲久久久国产精品| 久久这里只有精品19| 黑人欧美特级aaaaaa片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产av一区二区精品久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美最黄视频在线播放免费| 成人永久免费在线观看视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 99在线人妻在线中文字幕| www.www免费av| 91大片在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 男人操女人黄网站| 天堂影院成人在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 此物有八面人人有两片| АⅤ资源中文在线天堂| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品野战在线观看| 日韩免费av在线播放| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国内精品久久久久久久电影| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 国产伦人伦偷精品视频| 国产区一区二久久| 黄色毛片三级朝国网站| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 制服诱惑二区| 久久 成人 亚洲| ponron亚洲| 色综合站精品国产| 国产熟女午夜一区二区三区| 美国免费a级毛片| 一区二区日韩欧美中文字幕| 99riav亚洲国产免费| 啦啦啦韩国在线观看视频| 韩国精品一区二区三区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品欧美一区二区三区在线| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 男女下面插进去视频免费观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩国内少妇激情av| 在线永久观看黄色视频| 久久久久九九精品影院| 免费观看精品视频网站| 18禁观看日本| 成人亚洲精品一区在线观看| 很黄的视频免费| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 精品人妻在线不人妻| 禁无遮挡网站| 黄色毛片三级朝国网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 999精品在线视频| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美中文综合在线视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久这里只有精品19| xxx96com| 不卡av一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 一区二区三区精品91| 桃色一区二区三区在线观看| 色综合婷婷激情| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 成年版毛片免费区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 满18在线观看网站| 狂野欧美激情性xxxx| 午夜两性在线视频| 宅男免费午夜| 久久香蕉激情| 美国免费a级毛片| 国产欧美日韩一区二区三| 99香蕉大伊视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产激情久久老熟女| 自线自在国产av| 午夜免费激情av| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩视频一区二区在线观看| 久久人妻av系列| 一进一出好大好爽视频| 久久草成人影院| 老汉色∧v一级毛片| 69av精品久久久久久| 日韩三级视频一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 成人精品一区二区免费| 少妇 在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 国产国语露脸激情在线看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| av视频免费观看在线观看| 操美女的视频在线观看| 一本大道久久a久久精品| 亚洲专区国产一区二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲av第一区精品v没综合| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 韩国精品一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲av美国av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 日韩欧美国产在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 在线免费观看的www视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 欧美色视频一区免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产高清videossex| 精品高清国产在线一区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 少妇粗大呻吟视频| 涩涩av久久男人的天堂| 一区二区日韩欧美中文字幕| 在线观看免费午夜福利视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久这里只有精品19| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品久久久久久精品电影 | 日本免费一区二区三区高清不卡 | 高清黄色对白视频在线免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产成人系列免费观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲第一电影网av| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲七黄色美女视频| 国产成人啪精品午夜网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品,欧美在线| 久久香蕉激情| 国产成人免费无遮挡视频| 丝袜在线中文字幕| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 精品人妻1区二区| 国产精品 国内视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲少妇的诱惑av| tocl精华| 99国产精品99久久久久| 日本欧美视频一区| 午夜福利在线观看吧| 国产成人啪精品午夜网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 色综合婷婷激情| 国产三级在线视频| 两个人视频免费观看高清| 中文字幕精品免费在线观看视频| 露出奶头的视频| 色综合婷婷激情| 啦啦啦 在线观看视频| 怎么达到女性高潮| 国产私拍福利视频在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99国产精品一区二区三区| 在线视频色国产色| 亚洲人成电影观看| 美国免费a级毛片| 国产91精品成人一区二区三区| 国产色视频综合| 精品不卡国产一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 级片在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 亚洲九九香蕉| 正在播放国产对白刺激| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲五月婷婷丁香| 国产成+人综合+亚洲专区| 制服丝袜大香蕉在线| 色尼玛亚洲综合影院| 国产欧美日韩一区二区三| 热99re8久久精品国产| 亚洲精品国产区一区二| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 中文字幕最新亚洲高清| 在线观看免费视频网站a站| 国产成人av教育| 欧美一区二区精品小视频在线| 香蕉丝袜av| 一本综合久久免费| 免费高清视频大片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美中文日本在线观看视频| 身体一侧抽搐| 制服诱惑二区| 岛国在线观看网站| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 男人舔女人的私密视频| 女警被强在线播放| 亚洲电影在线观看av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 午夜日韩欧美国产| 国产乱人伦免费视频| 色综合站精品国产| 国产精品野战在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 国产av一区在线观看免费| 国产野战对白在线观看| 夜夜爽天天搞|