大黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移活性和順鉑敏感性的影響及其機(jī)制研究*

王一娜，侯友翔，祖力皮亞木

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 婦科腫瘤放療一病區(qū)，新疆 烏魯木齊 830011）

宮頸癌是全世界女性第4大常見的惡性腫瘤，對(duì)社會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。宮頸癌的治療通常包括手術(shù)、化療和放療，但這些治療策略并不足夠[2]。各種化學(xué)藥物，如貝伐單抗、鹽酸拓?fù)涮婵岛晚樸K是宮頸癌化療的一線藥物，但臨床應(yīng)用時(shí)常出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用和耐藥性，導(dǎo)致患者腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)一步惡化[3]。因此，提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)現(xiàn)有化療藥物的敏感性，對(duì)減少化療藥物的用量及其副作用的發(fā)生具有重要意義。

大黃素是一種從蓼科植物中分離出來的活性成分，具有抗菌、抗炎和抗氧化等作用。早期研究證明大黃素對(duì)許多腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用，如肺癌和胰腺癌等[4]。此外，大黃素對(duì)癌細(xì)胞的抗增殖作用與抑制蛋白質(zhì)酪氨酸激酶相關(guān)蛋白磷酸化有關(guān)[5]。目前，有報(bào)道顯示，大黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有抑制作用，其作用機(jī)制多與抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促進(jìn)凋亡有關(guān)[6]。然而，大黃素能否提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)現(xiàn)有化療藥物（如順鉑）的敏感性仍不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide-3-kinase/ protein kinase B,PI3K/Akt）信號(hào)通路影響細(xì)胞多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成等[7]。臨床研究表明，乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌和肝癌組織中Akt和p-Akt的陽(yáng)性表達(dá)率均較正常組織高[8]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)大黃素能通過調(diào)控Akt通路，抑制肝癌細(xì)胞活性[9]。然而，大黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制作用是否與Akt通路相關(guān)，以及Akt通路是否影響宮頸癌細(xì)胞對(duì)大黃素的敏感性尚未見報(bào)道。因此，本研究開展了大黃素在宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性方面的研究，以期為宮頸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞（廣州泰勒生物科技有限公司），大黃素（廣州云舟生物科技有限公司），Lipofectamine 3000（上海青旗生物科技有限公司），順鉑（美國(guó)MCE公司），AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），Transwell chamber（美國(guó)安捷倫公司），RIPA細(xì)胞蛋白裂解液（上海愛必信生物科技有限公司），胎牛血清（武漢漢恒生物科技有限公司），PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt（美國(guó)Santa Cruz公司），GAPDH抗體（南京金斯瑞生物科技有限公司）。

倒置顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司），多功能酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，在37 ℃和5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)[10-11]將細(xì)胞分為4組：對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液）、順鉑組（順鉑10 μmol/L）、大黃素組（大黃素50 μmol/L）、聯(lián)合組（順鉑10 μmol/L +大黃素50 μmol/L）。培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后按上述分組方法處理細(xì)胞48 h開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，胰酶消化收集細(xì)胞，使用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞并將細(xì)胞按2 000個(gè)/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，按照1.2中分組處理細(xì)胞，置于BME瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)物置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)14 d，使用Image-Pro Plus軟件在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

在室溫下將50 μL基質(zhì)膠添加到上室預(yù)先包被1 h，按不同組別處理細(xì)胞后，將200 μL細(xì)胞懸液接種到上室中，并將500 μL完全培養(yǎng)基添加到下室，孵育24 h，將下部小室中的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，5%結(jié)晶紫染色，棉簽除去上室中未遷移的細(xì)胞，顯微鏡下拍照記錄并計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野中的細(xì)胞數(shù)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將各組細(xì)胞按3 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24、36和48 h后加入20 μL 5% MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h，150 μL二甲基亞砜溶解紫色甲臜晶體，通過多功能酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的光密度（optical density,OD）值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按不同組別處理細(xì)胞48 h后，用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組HeLa細(xì)胞凋亡情況。用不含EDTA的胰酶消化HeLa細(xì)胞，然后將200 μL細(xì)胞懸液與5 μL Annexin V、1 μL PI在室溫下孵育15 min。使用BD LSR Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色細(xì)胞凋亡率。

1.7 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將HeLa細(xì)胞按5×104個(gè)細(xì)胞/孔接種在24孔板中，直至細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁，然后用200 μL移液槍吸頭劃出一個(gè)粗細(xì)均勻的劃痕。磷酸鹽緩沖液洗去分離的細(xì)胞，加入新鮮無血清培養(yǎng)基，并按照不同組別處理細(xì)胞。24 h后使用顯微鏡在100倍下隨機(jī)選擇區(qū)域進(jìn)行拍照，采用Image J軟件計(jì)算遷移面積。

1.8 Western blotting檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

采用RIPA裂解緩沖液從細(xì)胞中提取蛋白，BCA試劑盒定量，10% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜。室溫下用5%脫脂牛奶在TBST中封閉細(xì)胞膜1 h，并在4 ℃條件下加入一抗過夜。TBST洗滌膜3次，加入二抗在室溫下孵育1 h，依次進(jìn)行孵育、沖洗、顯影、定影，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素聯(lián)合順鉑抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖

對(duì)照組、順鉑組、大黃素組、聯(lián)合組細(xì)胞集落形成數(shù)分別為（286.56±12.68）、（109.77±9.21）、（116.55±8.89）、（56.67±5.98）個(gè)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.896，P=0.002）。與對(duì)照組比較，大黃素組和順鉑組宮頸癌細(xì)胞集落形成數(shù)減少（P<0.05）；與對(duì)照組、大黃素組、順鉑組比較，聯(lián)合組的宮頸癌細(xì)胞集落形成數(shù)減少（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞集落 （結(jié)晶紫染色×200）

對(duì)照組、順鉑組、大黃素組、聯(lián)合組細(xì)胞24、36和72 h的OD值比較，經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=396.000，P=0.000）；②各組細(xì)胞OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=158.500，P=0.000），聯(lián)合組OD值低于對(duì)照組、大黃素組、順鉑組（P<0.05）；③各組細(xì)胞OD值的變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.100，P=0.000）。大黃素能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，并能提高順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制作用。見表1和圖2。

表1 各組宮頸癌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)OD值的變化 （±s）

表1 各組宮頸癌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)OD值的變化 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與大黃素組比較，P <0.05；③與順鉑組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組順鉑組大黃素組聯(lián)合組24 h 0.61±0.03 0.39±0.07 0.36±0.08 0.28±0.03①②③36 h 1.03±0.06 0.67±0.02①0.69±0.03①0.43±0.06①②③48 h 1.78±0.11 0.81±0.06①0.78±0.02①0.52±0.01①②③

圖2 各組宮頸癌細(xì)胞OD值的變化趨勢(shì)

2.2 大黃素聯(lián)合順鉑抑制宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

對(duì)照組、順鉑組、大黃素組、聯(lián)合組細(xì)胞侵襲數(shù)和遷移率比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.783和19.236，P=0.001和0.003）。與對(duì)照組比較，大黃素組、順鉑組細(xì)胞侵襲數(shù)和遷移率均減少（P<0.05）；與對(duì)照組、大黃素組、順鉑組比較，聯(lián)合組細(xì)胞侵襲數(shù)和遷移率均減少（P<0.05）。大黃素能抑制宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并提高順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制作用。見表2和圖3、4。

表2 各組宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力比較 （±s）

表2 各組宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與大黃素組比較，P <0.05；③與順鉑組比較，P <0.05。

細(xì)胞遷移率/%81.33±13.51 43.89±7.38①46.93±10.12①21.35±8.66①②③19.236 0.003組別對(duì)照組順鉑組大黃素組聯(lián)合組F 值P 值細(xì)胞侵襲數(shù)/（個(gè)/HP）122.87±11.82 71.23±12.82①67.21±15.33①28.36±7.25①②③32.783 0.001

圖3 各組宮頸癌細(xì)胞侵襲能力 （結(jié)晶紫染色×200）

圖4 各組宮頸癌細(xì)胞劃痕試驗(yàn) （×100）

2.3 大黃素聯(lián)合順鉑促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡

對(duì)照組、順鉑組、大黃素組、聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率分別為（5.31±0.51）%、（11.19±1.12）%、（12.13±1.09）%、（23.85±2.35）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.872，P=0.036）。與對(duì)照組比較，大黃素組和順鉑組宮頸癌細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與對(duì)照組、大黃素組、順鉑組比較，聯(lián)合組宮頸癌細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。大黃素能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，并提高順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的促凋亡作用。見圖5。

圖5 各組宮頸癌細(xì)胞流式細(xì)胞圖

2.4 大黃素聯(lián)合順鉑抑制宮頸癌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路激活

對(duì)照組、順鉑組、大黃素組、聯(lián)合組PI3K/Akt磷酸化水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.113和9.273，P=0.021和0.017）。與對(duì)照組比較，大黃素組和順鉑組PI3K/Akt信號(hào)通路被抑制，PI3K和Akt蛋白磷酸化水平均降低（P<0.05）；與對(duì)照組、大黃素組、順鉑組比較，聯(lián)合組PI3K和Akt蛋白磷酸化水平均降低（P<0.05）。大黃素能抑制宮頸癌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路激活，大黃素聯(lián)合順鉑后對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制作用增強(qiáng)。見表3和圖6。

表3 各組細(xì)胞PI3K和Akt蛋白磷酸化水平比較 （±s）

表3 各組細(xì)胞PI3K和Akt蛋白磷酸化水平比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與大黃素組比較，P <0.05；③與順鉑組比較，P <0.05。

p-Akt/Akt 0.83±0.05 0.39±0.08①0.41±0.02①0.22±0.06①②③9.273 0.017組別對(duì)照組順鉑組大黃素組聯(lián)合組F 值P 值p-PI3K/PI3K 0.62±0.02 0.33±0.03①0.31±0.02①0.16±0.01①②③8.113 0.021

圖6 各組宮頸癌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

目前，宮頸癌的預(yù)防和治療仍面臨巨大挑戰(zhàn)，宮頸癌患者預(yù)后不良的主要原因包括腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[12]?；瘜W(xué)藥物通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，治療多種腫瘤。作為鉑類化療藥物之一，順鉑化療方案被廣泛用于晚期宮頸癌的治療，其可以通過誘導(dǎo)DNA損傷、細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。然而，由于患者對(duì)化療藥物的敏感性低，甚至產(chǎn)生耐藥，仍有較高的發(fā)病率[14]。因此，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，并尋找可能影響宮頸癌療效的靶點(diǎn)對(duì)宮頸癌的診療至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明，大黃素可以調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，并能提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

蒽醌類為具有抗腫瘤潛力的化合物。大黃素是一種蒽醌，存在于許多植物的根部和樹皮中。其是各種中草藥的活性成分，包括大黃、何首烏、蘆薈和決明子[15]。據(jù)報(bào)道，大黃素具有抗腫瘤、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抗增殖的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠破壞分裂紡錘體，在被檢細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)中，高爾基體中存在大量分散的池泡，證明其組織紊亂。此外，大黃素還能誘導(dǎo)Phalloidin標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲的降解，以及在細(xì)胞質(zhì)中形成聚集物[16-17]。本研究結(jié)果表明，大黃素處理后，宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力降低，細(xì)胞凋亡率增加，并且宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑更加敏感。調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖、生存、死亡和代謝非常重要，該通路的失衡與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[18]。因此，探索PI3K/Akt信號(hào)通路的靶向調(diào)節(jié)劑具有很大的潛力。大量PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑候選藥物正在開發(fā)中，有些已被應(yīng)用于治療癌癥患者。但是PI3K/Akt信號(hào)通路仍然對(duì)治療有抵抗力[19]。最新研究表明，大黃素可調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路，使肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感性增加。另外研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路，改善免疫性血小板減少癥的間質(zhì)干細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果表明，大黃素可以抑制宮頸癌細(xì)胞系PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而干預(yù)宮頸癌細(xì)胞的發(fā)展。

綜上所述，大黃素可以調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，并能提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，其作用可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。