基于生物信息學分析鐵死亡調(diào)控基因與牙周炎的關(guān)系

羅曉潔 王德續(xù) 陳曉濤

1.新疆醫(yī)科大學口腔醫(yī)學系 烏魯木齊 830000；

2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科 烏魯木齊 830000

牙周組織發(fā)生的感染性疾病稱為牙周炎（periodontitis），是全球第六大常見疾病[1]，也是一種多因素炎性疾病，牙周組織的破壞為其主要特征，包括軟組織炎癥（牙齦炎癥）和硬組織的破壞（牙槽骨吸收），最終會造成牙齒的喪失[2]。異常免疫炎癥反應、結(jié)締組織破壞以及成骨細胞/破骨細胞分化失衡是促進牙周炎持續(xù)發(fā)展的主要因素，通過了解這些發(fā)病機制，展開抗炎治療是必要的。鐵死亡（ferroptosis）是一種新型的細胞程序性死亡，與細胞壞死、凋亡和自噬的機制有所不同。細胞鐵死亡的發(fā)生與谷胱甘肽（glutathione，GSH）和鐵代謝異常導致有毒脂質(zhì)型活性氧（reactive oxygen species，ROS）的鐵依賴性積累有關(guān)[3]。目前，已證明鐵死亡與炎癥的發(fā)生有密切的關(guān)系[4]，但關(guān)于牙周炎與鐵死亡的研究目前較少，兩者之間作用機制尚未明確。

生物信息學（bioinformatics）通過獲取相關(guān)生物信息，進行加工、存儲、分析和解釋，闡明生物學意義。在分子水平探索鐵死亡與牙周炎微環(huán)境的關(guān)系，對改善牙周炎患者炎癥甚至牙槽骨骨改建可能具有重要意義。本研究經(jīng)生物信息分析發(fā)現(xiàn)鐵死亡調(diào)控基因在牙周炎中存在差異表達，如鐵死亡抑制基因SLC7A11、SLC40A1、FTH等在牙周炎中表達上調(diào)，在牙周炎患者牙齦中的表達量高于健康人群，推測可能是由于牙周炎微環(huán)境下，炎癥細胞鐵死亡被明顯抑制，炎癥因子分泌增加，加重了炎癥反應。本研究借助基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）和R語言探討了鐵死亡調(diào)控基因?qū)ρ乐苎椎挠绊懀瑸檠芯胯F死亡與牙周炎之間的關(guān)系及可能的機制提供理論基礎(chǔ)，以期為牙周炎治療策略的發(fā)展貢獻一份力量。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載GSE16134[5]數(shù)據(jù)集（GPL570，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）。

納入標準：有探診后出血（bleeding on probing，BOP），鄰間探診深度（probing depth，PD）≥4 mm，伴隨附著喪失（attachment loss，AL）≥3 mm為牙周炎位點，沒有BOP，PD<4 mm，AL≤2 mm為健康位點；年齡>13歲，且口內(nèi)留存牙齒超過24顆，至少包含1個符合標準的患病牙間乳頭。該數(shù)據(jù)集納入了120名中度至重度牙周炎受試者。每名患者的6個區(qū)段中至少采集2顆患牙周炎部位的牙齦乳頭數(shù)據(jù)（包括鄰間牙周袋的上皮襯里和下面的結(jié)締組織），并從相鄰健康位點獲取健康的組織樣本。

本試驗共包括310個樣本，其中69個健康樣本和241個牙周炎樣本，51名患者沒有取得健康樣本。從FerrDb數(shù)據(jù)庫中獲取鐵死亡驅(qū)動基因和抑制基因。

1.2 篩選差異基因

通過R軟件（版本4.1.1）進行數(shù)據(jù)分析，在GSE16134中篩選出鐵死亡驅(qū)動基因和抑制基因，共157個鐵死亡調(diào)控基因。將結(jié)果進行標準化處理，以P<0.05，│logFC│>0.2作為差異基因篩選標準，用“l(fā)imma”包[6]篩選出鐵死亡調(diào)控基因在牙周炎樣本存在差異表達的基因，通過R語言中的“pheatmap”包和“Volcano”包[7]將差異分析結(jié)果可視化。

1.3 樞紐基因的功能富集和通路分析

為了找出差異基因主要的功能和其所在通路，使用“clusterprofile”包進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析以及京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，以P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（protein-protein interaction network，PPⅠ）

使用STRⅠNG 和Cytoscape （http://cytoscape.org/）完成PPⅠ網(wǎng)絡的構(gòu)建，并通過MCODE進行聚類分析，將相互關(guān)聯(lián)評分最高的一組確定為關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選

矯正并標準化GSE16134數(shù)據(jù)集，共篩選出與鐵死亡相關(guān)的調(diào)控基因50個，其中包括24個炎癥中表達上調(diào)的基因和26個表達下調(diào)的基因。為了使篩選出的調(diào)控基因分布情況可視化，繪制了熱圖（圖1A）和火山圖（圖1B）展示鐵死亡調(diào)控基因在炎癥樣本和健康樣本中的差異表達。

圖1 鐵死亡調(diào)控基因在炎癥樣本和健康樣本中的差異表達Fig 1 Differential expression of iron death regulatory genes in inflammatory and healthy samples

2.2 差異表達基因功能分析和通路分析

基于GO對差異表達基因進行功能分析，將本研究篩選得到的50個差異表達基因分別從生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞成分（cell component，CC）3個層面進行功能注釋，經(jīng)顯著性富集（P<0.05）分析后，將每個層面前10個顯著富集的條目列出（圖2），從圖中可以看出：差異基因主要涉及氧化應激這一生物過程，氧化應激增加以及抗氧化能力的下降與牙周組織的炎癥反應息息相關(guān)。這可以證明這些差異基因，如花生四烯酸-5-脂加氧酶（recombinant arachidonate-5-lipoxygenase，ALOX5）、溶質(zhì)載體家族7成員11（recombinant solute carrier family 7, member 11，SLC7A11）、Toll樣受體4（Toll-likereceptor 4，TLR4）、人紅細胞衍生核因子2樣蛋白2（recombinant nuclear factor, erythroid derived 2 like protein 2，NFE2L2）等，與牙周炎的發(fā)生有關(guān)（表1）。

表1 差異表達基因結(jié)果Tab 1 Results of differentially expressed genes

圖2 差異表達基因GO分析結(jié)果Fig 2 GO analysis results of differentially expressed genes

對牙周炎中存在差異表達的鐵死亡調(diào)控基因進行KEGG通路分析，顯著富集的前20個通路如圖3所示。由圖3可知：差異基因主要涉及鐵死亡、免疫應答和自噬等過程（表2），鐵死亡通路上主要包括重肽鐵蛋白（ferritin heavy chain，F(xiàn)TH1）、SLC7A11、?；o酶A （acyl-CoA synthetase 4，ACSL4）、溶質(zhì)載體家族40 成員1 （recombinant solute carrier family 40, member 1，SLC40A1）等。通過KEGG官網(wǎng)得到差異基因在鐵死亡中的通路圖，明確差異基因在鐵死亡通路上的作用。

表2 差異表達基因通路分析結(jié)果Tab 2 Pathway analysis results of differentially expressed genes

圖3 差異表達基因KEGG通路分析結(jié)果Fig 3 KEGG pathway analysis results of differentially expressed genes

2.3 構(gòu)建PPⅠ網(wǎng)絡以及確定關(guān)鍵基因

利用STRⅠNG 和Cytoscape （http://cytoscape.org/） 構(gòu)建PPⅠ網(wǎng)絡（圖4），通過Cytoscape 的MCODE插件進行聚類分析，共篩出3個模塊，選取相關(guān)性得分最高的模塊作為關(guān)鍵基因（圖5、6）。這些關(guān)鍵基因主要參與氧化應激、自噬和鐵代謝反應，例如，半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalytic，GCLC）、SLC7A11與GSH的合成有關(guān)，70 kDa熱休克蛋白5（recombinant heat shock 70 kDa protein 5，HSPA5）與谷胱甘肽過氧化物酶4 （glutathione peroxidases 4，GPX4）結(jié)合，能防止GPX4蛋白降解和隨后的脂質(zhì)過氧化；自噬啟動蛋白（autophagy-related protein 1 homolog，ULK1）作為被發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)的基因，在自噬通路中起著關(guān)鍵作用；FTH1參與了鐵蛋白（transferrin，TF）的合成。

圖4 KEGG鐵死亡通路中部分差異基因的主要作用Fig 4 Main roles of some differential genes in KEGG iron death pathway

圖5 Cytoscape構(gòu)建差異表達基因的PPⅠ網(wǎng)絡Fig 5 PPⅠ network of differentially expressed genes constructed by Cytoscape

圖6 通過Cytoscape中的ECODE插件獲取到的15個關(guān)鍵基因Fig 6 15 key genes obtained through the ECODE plugin in Cytoscape

3 討論

牙周炎是以牙周軟組織慢性炎癥、牙周膜喪失和牙槽骨吸收為特征的最常見的口腔疾病之一[2]。牙菌斑在牙周炎的發(fā)展中起致病作用，其他因素在牙周炎患者患病后的發(fā)展中起著同等甚至更重要的作用[8]。自由基清除的動態(tài)平衡失調(diào)會造成牙周組織損傷[9]，牙周炎患者的齦溝液中氧化應激標志物水平與PD、BOP以及AL呈正相關(guān)，牙周治療后機體氧化應激水平得到改善[10]。鐵死亡作為目前國內(nèi)外的研究熱點，其發(fā)生與氧化應激有著密切的關(guān)系，在炎性疾病發(fā)展過程中的作用正在逐步被揭示[4]。因此，筆者推測鐵死亡可能通過氧化應激反應參與了牙周炎發(fā)生發(fā)展的過程。

細胞鐵死亡的發(fā)生主要與GSH以及鐵代謝密切相關(guān)的ROS積累有關(guān)[11]。據(jù)功能分析結(jié)果顯示：參與氧化應激反應是差異基因的主要作用，與牙周炎進展是由氧化應激促進相符的。據(jù)KEGG通路圖顯示：差異基因主要在鐵死亡通路中的Xc-系統(tǒng)（system Xc-）通路和鐵代謝通路上發(fā)揮作用。本研究重點關(guān)注了在鐵死亡通路上的基因兼PPⅠ圖中的關(guān)鍵基因，包括：FTH1、SLC7A11、細胞色素b-245 β 鏈 （cytochrome b-245 beta chain，CYBB）、GCLC、微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3A（microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A， MAP1LC3A）。 分析結(jié)果顯示： FTH1、SLC7A11、GCLC、CYBB在牙周炎牙齦組織中表達上調(diào)，MAP1LC3A在牙周炎組織中表達下調(diào)。

SLC7A11由SLC7A11 mRNA編碼，通過組成Xc-系統(tǒng)，介導胞外胱氨酸與胞內(nèi)谷氨酸的交換，消耗還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），經(jīng)GCLC編碼合成谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL），促進GPX4的主要底物GSH生成[12-13]。GPX4能降低細胞內(nèi)ROS的水平，抑制細胞發(fā)生鐵死亡[14]。CYBB是促炎基因，其編碼的GP91PHOX能與P22PHOX組成NADPH，負責產(chǎn)生超氧化物和ROS[15-16]。筆者分析：牙周炎組織中，SLC7A11、GCLC在炎癥牙齦組織中表達上調(diào)，可能是由于炎癥細胞鐵死亡被抑制，增加了炎癥因子的分泌，從而加重了炎癥反應。炎癥細胞CYBB基因表達上調(diào)，這與其促炎功能相符。

鐵是人體必需的營養(yǎng)元素，作為催化劑參與氧化還原反應[17]。細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的維持主要依靠TF/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFR）系統(tǒng)攝取細胞外鐵，以及膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）介導的鐵的輸出[18-19]。FTH1參與TF合成，TF降解產(chǎn)生大量ROS導致細胞鐵死亡[20]。臨床研究[21]發(fā)現(xiàn)：TF/核受體共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）復合體介導的TF降解，促進了人牙周膜成纖維細胞中ROS的生成，導致人牙周膜成纖維細胞鐵死亡，揭示了鐵死亡在牙周炎的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要的作用。MAP1LC3A作為自噬體標志物和自噬通量的衡量指標，可能涉及選擇性自噬降解TF，即TF吞噬，并將鐵釋放到細胞中以激活鐵死亡[22]。據(jù)本實驗的分析結(jié)果顯示：牙周炎組FTH表達量上調(diào)，NCOA4的表達下調(diào)。牙周炎屬于低氧性炎性疾病，Ni等[23]的研究發(fā)現(xiàn)：缺氧抑制了NCOA4介導的TF吞噬，使破骨細胞免于鐵死亡。因此，缺氧條件下FTH的表達會增加，F(xiàn)TH的降解受到抑制。這與本實驗的分析結(jié)果一致。由此大膽推測：牙周炎低氧環(huán)境下破骨細胞鐵死亡被抑制，進而促進了牙槽骨的吸收。而MAP1LC3在牙周炎中的作用目前未見相關(guān)報道，可能通過與其他基因共同作用，參與了牙周炎的發(fā)生發(fā)展。

牙槽骨對于牙周炎患者的預后以及患牙的保留至關(guān)重要。由此作為啟發(fā)，筆者關(guān)注了上述基因?qū)ρ啦酃堑挠绊?。Jin等[24]的研究顯示：下調(diào)SLC7A11在體外能顯著增強間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）的成骨分化能力，促進體內(nèi)骨的形成；并且，SLC7A11的抑制劑Sulfasalazine（SAS）能有效地提高成骨潛能。筆者還發(fā)現(xiàn)GSH在破骨細胞炎性骨破壞機制中起著重要作用。GSH一直被認為是一種破骨細胞生成抑制劑，通過降低細胞內(nèi)ROS的生成，抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的激活，進而抑制介導破骨細胞分化的RANKL-RANK信號通路[25]。但有研究[26]發(fā)現(xiàn)：在小鼠骨髓巨噬細胞（bone marrow-derived macrophage，BMM）分化為破骨細胞過程中，GSH能促進破骨細胞形成。被注射脂多糖的小鼠顱骨經(jīng)GSH處理后，溶骨性病變面積增加了5倍，GSH加速了破骨細胞形成和炎癥性骨破壞，是破骨細胞炎癥性骨破壞機制中的重要分子[27]。牙周炎主要是通過刺激靜止的破骨細胞前體分化為破骨細胞，加重骨吸收[28]。而Agidigbi等[29]的實驗顯示：GSH在炎癥條件下，有助于破骨細胞前體（RAW264.70）向破骨細胞分化和骨破壞。骨骼對全身鐵水平的波動特別敏感，缺鐵和超負荷都與低骨礦物質(zhì)密度和脆弱性有關(guān)，而牙槽骨作為全身骨改建最活躍的部位，鐵代謝異?？赡軙绊懷啦酃堑母慕╗30]。以上研究表明：SLC7A11、GSH和鐵代謝異常對調(diào)節(jié)炎癥和牙槽骨的破壞可能存在著潛在作用，需后期經(jīng)實驗進一步驗證。

總之，鐵死亡與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在牙周炎發(fā)病過程中，鐵死亡的作用正在逐漸被揭示?；谏镄畔W方法分析鐵死亡調(diào)控基因在牙周炎軟組織樣本和健康軟組織樣本中表達的差異，對關(guān)鍵差異基因進行分析，尋找鐵死亡調(diào)控基因與牙周炎之間的關(guān)聯(lián)以及主要作用的通路。本研究僅基于數(shù)據(jù)分析，后續(xù)仍需結(jié)合分子生物學實驗來確認鐵死亡調(diào)控基因中與牙周炎相關(guān)的關(guān)鍵基因及其在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的具體作用。本研究旨在豐富牙周炎致病作用機制，為治療和早期干預牙周炎提供新的思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。