口腔扁平苔蘚患者血清血管生成素-2水平與叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子陽(yáng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及疾病活動(dòng)度的相關(guān)性分析

王素杰 譚芹 韋淵 王潔 范杰 岳二麗

鄭州市第一人民醫(yī)院口腔科 鄭州 450000

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種發(fā)病率僅次于復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的口腔疾病，患病率為0.1%~4%，多發(fā)生于中年女性[1]。目前，臨床上關(guān)于OLP確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與免疫反應(yīng)、高遺傳易感性及血管生成等因素相關(guān)[2-4]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）主要參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，抑制效應(yīng)性細(xì)胞的增殖；叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/winged helix transcription factor p3，F(xiàn)oxp3）是參與Treg發(fā)育及功能的特異性標(biāo)志物[5]。白楊等[6]研究顯示Foxp3+Treg的表達(dá)異常與OLP的發(fā)生及臨床分型密切相關(guān)。近年來(lái)相關(guān)研究[7]顯示：異常激活的血管生成素（angiopoietin，Ang）信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)在OLP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。血清Ang-2可通過(guò)拮抗內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體（tyrosine kinase receptor 2，Tie2）受體與Ang-1的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)血管生成的轉(zhuǎn)變，可能參與OLP的病情進(jìn)展[8]。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)：OLP患者外周血Ang-2的檢測(cè)水平明顯高于正常人。為了更全面地探索血清Ang-2在OLP中的變化，尋找血清Ang-2水平與臨床體征及疾病活動(dòng)性的相關(guān)性，本研究以O(shè)LP患者為研究對(duì)象，分析血清Ang-2水平與Foxp3+Treg及疾病活動(dòng)性的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取鄭州市第一人民醫(yī)院2019年5月—2022年5月收治的113例不同分型OLP患者為研究對(duì)象，設(shè)為試驗(yàn)組。113例患者根據(jù)OLP分型分為網(wǎng)紋型組（45例），充血型組（36例），糜爛型組（32例）；其中男36例，女77例；年齡35~75歲，平均（47.51±3.92）歲；病程0.51~2.14年，平均（0.78±0.27）年。另選取來(lái)鄭州市第一人民醫(yī)院體檢的健康志愿者76例為對(duì)照組，其中男26例，女50例；年齡32~73歲，平均（47.38±3.81）歲。兩組性別、年齡等的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）觀察組均符合OLP的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型標(biāo)準(zhǔn)[9]，經(jīng)病理及臨床癥狀檢查確診；2）年齡≥18歲；3）能配合完成本研究；4）知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并免疫性疾病或糖尿病者；2）合并心腦血管疾病或感染性疾?。?）合并惡性腫瘤；4）合并有牙周炎或復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍；5）由藥物、金屬等引起的苔蘚樣反應(yīng)；6）近期服用抗炎、免疫抑制劑等藥物者。本研究經(jīng)鄭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2023-zzsyky-005）。

1.2 方法

1.2.1樣本采集 收集所有受試者肘靜脈血4 mL，分裝兩管，一管用于檢測(cè)血清Ang-2水平，另一管（含肝素鈉抗凝）用于檢測(cè)Foxp3+Treg水平。

1.2.2血清Ang-2、Foxp3+Treg 水平檢測(cè) 血清Ang-2水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，具體操作：將獲取的血液樣本置于離心機(jī)中，離心，獲取血清，將血清置于全自動(dòng)生化分析儀（濟(jì)南程騰生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：BK-200）中進(jìn)行檢測(cè)。Foxp3+Treg水平的檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀（青島佳鼎分析儀器有限公司，型號(hào)：DxP Athena）檢測(cè)，從獲得的全血樣本中取100 μL，CD4-FTTC、抗人CD25-APC均加入20 μL，混勻，孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻，孵育10 min，置于離心機(jī)中，離心，留取沉淀物；加入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）2 mL，離心5 min，留沉淀物；重復(fù)上一步驟，加入事先配制好的固定/破膜工作液，孵育40 min（避光），加入FBS 2 mL，離心5 min，留沉淀物；重復(fù)上一步驟，加入Foxp3-PE，孵育40 min（避光），加入FBS 2 mL，離心5 min，留沉淀物；重復(fù)上一步驟；加入FBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 臨床體征評(píng)分、OLP 網(wǎng)紋-萎縮-糜爛（reticular-atrophic-erosive，RAE）病損評(píng)分、疾病活動(dòng)評(píng)分 評(píng)估臨床體征評(píng)分[10]采用六級(jí)評(píng)分法：0 分為無(wú)病損，正常黏膜；1分為輕微白色條紋，無(wú)充血、萎縮或糜爛面；2分為白色條紋伴充血或萎縮面<1 cm2；3分為白色條紋伴充血或萎縮面≥1 cm2；4 分為白色條紋伴糜爛面<1 cm2；5 分為白色條紋伴糜爛面≥1 cm2。采用RAE 病損評(píng)分[11]評(píng)估病損程度。糜爛型評(píng)分：0 分為無(wú)糜爛病損，1 分為糜爛面<1 cm2，2分為糜爛面1~3 cm2，3分為糜爛面>3 cm2；充血萎縮型評(píng)分：0分為無(wú)病損，1分為充血萎縮面<1 cm2，2 分為充血萎縮面1~3 cm2，3 分為充血萎縮面>3 cm2；網(wǎng)紋型評(píng)分：0 分為無(wú)白色條紋，1 分為有條紋或丘疹?？偡譃椴p分布在舌、頰、牙齦、口底、唇等位置之和。采用OLP網(wǎng)紋-糜爛-潰瘍（reticulum-erosion-ulcer，REU）疾病活動(dòng)評(píng)分[12]評(píng)估患者的疾病活動(dòng)程度，根據(jù)患者口腔各部位的白紋區(qū)、充血紅斑區(qū)、糜爛潰瘍區(qū)的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。白紋區(qū)評(píng)分：0分為無(wú)白色條紋，1分為有白色條紋或角化丘疹；充血紅斑區(qū)評(píng)分：0 分為無(wú)病損，1 分為病損面積<1 cm2，2 分為病損面積1~3 cm2，3 分為病損面積>3 cm2；糜爛潰瘍區(qū)評(píng)分：0分為無(wú)病損，1分為病損面積<1 cm2，2 分為病損面積1~3 cm2，3 分為病損面積>3 cm2?？偡?∑白紋區(qū)+∑（充血紅斑區(qū)×1.5）+∑（糜爛潰瘍區(qū)×2.0）。

1.3 觀察指標(biāo)

比較不同分型OLP患者與對(duì)照組患者血清Ang-2、Foxp3+Treg水平，對(duì)比不同分型OLP患者臨床體征評(píng)分、RAE病損評(píng)分、疾病活動(dòng)評(píng)分，血清Ang-2水平與Foxp3+Treg及各評(píng)分的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較采用方差分析；采用Pearson相關(guān)性分析明確血清Ang-2水平與Foxp3+Treg及各評(píng)分的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血清Ang-2、Foxp3+Treg水平比較

不同分型OLP患者血清Ang-2、Foxp3+Treg水平均高于對(duì)照組（P<0.05）；糜爛型組和充血型組患者血清Ang-2、Foxp3+Treg水平均高于網(wǎng)紋型組（P<0.05）；糜爛型組患者血清Ang-2、Foxp3+Treg水平均高于充血型組（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血清Ang-2、Foxp3+Treg水平比較Tab 1 Comparison of serum Ang-2 and Foxp3+Treg levels

2.2 各評(píng)分水平比較

糜爛型組和充血型組患者臨床體征評(píng)分、RAE病損評(píng)分、疾病活動(dòng)評(píng)分均高于網(wǎng)紋型組（P<0.05），與充血型組患者相比，糜爛型組患者上述指標(biāo)水平更高（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各評(píng)分水平比較Tab 2 Comparison of each score level

2.3 血清Ang-2 水平與Foxp3+Treg、臨床體征評(píng)

分、病損RAE評(píng)分、疾病活動(dòng)評(píng)分的相關(guān)性O(shè)LP患者血清Ang-2水平與Foxp3+Treg、臨床體征評(píng)分、病損RAE評(píng)分、疾病活動(dòng)評(píng)分均呈正相關(guān)（P<0.001），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 血清Ang-2 水平與Foxp3+Treg、臨床體征評(píng)分、RAE病損評(píng)分、疾病活動(dòng)評(píng)分的相關(guān)性Tab 3 Correlation between serum Ang-2 level and Foxp3+ Treg, clinical sign score, RAE score and disease activity score

3 討論

OLP是發(fā)生于口腔黏膜的慢性炎癥疾病，表現(xiàn)為刺激痛，粗糙不適，由小丘疹連成的樹(shù)枝狀、網(wǎng)狀、線狀白色條紋，潰瘍、充血及糜爛等癥狀，具有反復(fù)發(fā)作、遷延難愈等特點(diǎn)[13]。相關(guān)研究[14]顯示：OLP的糜爛病損區(qū)域若經(jīng)久不愈，不僅影響患者的口腔功能，還可導(dǎo)致局部纖維增生，甚至可能引起惡性病變，嚴(yán)重影響患者的日常生活和工作。目前，多數(shù)學(xué)者[15]認(rèn)為免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是OLP發(fā)生的主要病理機(jī)制，亦有學(xué)者[16]認(rèn)為血管生成的調(diào)控失調(diào)是影響OLP發(fā)生發(fā)展的潛在標(biāo)志。病理狀態(tài)下炎癥可誘導(dǎo)病損區(qū)域局部血管的生成，而不斷新生的毛細(xì)血管可促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移，產(chǎn)生惡性循環(huán)，不利于炎癥部位恢復(fù)[17]。這表明OLP炎癥反應(yīng)過(guò)程中伴隨著血管的異常增生，但近年來(lái)臨床上關(guān)于OLP血管生成的調(diào)控及其與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性研究還較少。

Ang-2作為Ang家族中的一員，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，儲(chǔ)存在Weibel-Palade小體，當(dāng)機(jī)體受到炎癥刺激時(shí)可被大量釋放，與細(xì)胞膜上酪氨酸激酶受體Tie2結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[18]。此外，Ang-2可誘導(dǎo)血管滲漏并可增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)分子信號(hào)傳導(dǎo)的敏感性，且對(duì)骨髓細(xì)胞具有旁分泌作用，導(dǎo)致單核細(xì)胞遷移以及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的上/下細(xì)胞因子調(diào)節(jié)[19]。Wu等[20]研究顯示：Ang-2表達(dá)異常在炎癥性自身免疫性疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Bessar等[8]認(rèn)為：Ang-2參與OLP的發(fā)生與發(fā)展，可用于評(píng)估OLP患者疾病的嚴(yán)重程度。Foxp3+Treg是反映機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)程度的有效標(biāo)志物，在OLP病情進(jìn)展中起著主要作用。本研究首先觀察了健康志愿者與不同分型OLP患者血清Ang-2、Foxp3+Treg的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：不同分型OLP患者血清Ang-2、Foxp3+Treg表達(dá)水平均高于對(duì)照組；糜爛型和充血型患者的表達(dá)水平均高于網(wǎng)紋型，而糜爛型患者的表達(dá)水平高于充血型。該結(jié)果表明OLP患者血清Ang-2與Foxp3+Treg水平均表現(xiàn)異常升高，提示OLP患者血管生成及免疫炎癥反應(yīng)均存在異常。

本研究對(duì)各分型OLP患者的臨床體征評(píng)分、病損RAE評(píng)分、疾病活動(dòng)評(píng)分進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示：糜爛型和充血型患者的臨床體征評(píng)分、RAE病損評(píng)分、疾病活動(dòng)評(píng)分均高于網(wǎng)紋型，與充血型患者相比，糜爛型患者的上述指標(biāo)水平更高。這表明充血型、糜爛型患者病情更為嚴(yán)重。為進(jìn)一步探究OLP患者血清Ang-2水平對(duì)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)程度及疾病進(jìn)展的影響，本研究采用Pearson相關(guān)性分析明確血清Ang-2水平與Foxp3+Treg及各評(píng)分的相關(guān)性，結(jié)果顯示：OLP患者血清Ang-2水平與Foxp3+Treg、臨床體征評(píng)分、RAE病損評(píng)分、疾病活動(dòng)評(píng)分均呈正相關(guān)。這表明血清Ang-2水平異常升高可促進(jìn)OLP患者血管及T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)失控，從而加重患者疾病免疫炎癥反應(yīng)程度，促進(jìn)新生血管的形成，導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步發(fā)展。分析原因，Ang-2可能通過(guò)刺激Tie2的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-10，抑制T細(xì)胞的增殖，增加CD4+T 細(xì)胞與CD8+T 細(xì)胞的比例，促進(jìn)CD4+CD25（high）Foxp3+Treg的擴(kuò)增，從而加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)，促使患者病情發(fā)展。

綜上所述，血清Ang-2水平在OLP患者體內(nèi)存在異常升高的表現(xiàn)，且其升高程度與患者Foxp3+Treg水平、臨床體征、病損程度及疾病活動(dòng)程度呈正相關(guān)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。