LncRNA MRPL39通過海綿吸附miR-130靶向PTEN調(diào)控人肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

范慶浩,鮑獻(xiàn)榮,趙 涵

(金華市人民醫(yī)院 心胸外科,浙江 金華 321000)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要類型,目前尚缺乏持續(xù)有效的治療方案,從分子生物學(xué)層面挖掘新型治療靶標(biāo),將有重要的臨床意義[1]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要的調(diào)控作用[2-3]。研究[4]表明,LncRNA MRPL39可靶向miR-130抑制胃癌細(xì)胞的增殖。前期通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫中NSCLC肺癌組織與正常肺組織的miRNA測序芯片數(shù)據(jù)(ID:200135918),發(fā)現(xiàn)miR-130在NSCLC中表達(dá)下降。Ye等[5]研究也顯示,低表達(dá)miR-130與NSCLC患者不良預(yù)后密切相關(guān)。但miR-130在NSCLC中的上游調(diào)控機(jī)制尚未闡明。故本研究檢測MRPL39和miR-130在NSCLC組織標(biāo)本中的表達(dá)水平,并在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平驗(yàn)證MRPL39對miR-130及NSCLC的影響,擬探究MRPL39在NSCLC中是否可能靶向miR-130促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2021年6月—2021年12月于我院心胸外科首次確診、需手術(shù)切除的NSCLC患者30例,術(shù)中留取癌組織和癌旁組織;患者術(shù)前未接受過其他抗腫瘤治療。其中男13例,女17例;年齡41～72歲,平均(56.37±12.41)歲;病理類型:鱗癌18例,腺癌10例,其他2例;NSCLC分級:Ⅰ級3例,Ⅱ級8例,Ⅲ級13例,Ⅳ級6例。受試患者均知情同意,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 細(xì)胞與動(dòng)物來源 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自美國ATCC細(xì)胞中心;20只BALB/c裸鼠購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所,4～5周齡,體質(zhì)量18～22 g,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2021-0010,于特定無病原體條件下飼養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 以DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)、37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)細(xì)胞,隔天更換培養(yǎng)基,待細(xì)胞生長至80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞分為空白組、sh-NC組、sh-MRPL39組、sh-MRPL39+anti-miR-NC組和sh-MRPL39+anti-miR-130組,根據(jù)脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司)說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,空白組不做轉(zhuǎn)染處理,sh-NC組、sh-MRPL39組、sh-MRPL39+anti-miR-NC組和sh-MRPL39+anti-miR-130組分別將雜序shRNA、sh-MRPL39、sh-MRPL39+無意義小分子陰性對照片段和sh-MRPL39+miR-130抑制劑(由上海吉?jiǎng)P公司合成)轉(zhuǎn)入細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qPCR法檢測組織及細(xì)胞中MRPL39和miR-130表達(dá) 采用Trizol法提取組織及細(xì)胞中總RNA,測定A260/A280值,取合格樣本進(jìn)行cDNA合成和PCR擴(kuò)增,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR Master Mix購自日本TaKaRa公司,PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,共38個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參,2-ΔΔCt法半定量計(jì)算MRPL39和miR-130表達(dá)。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞調(diào)整密度為1×104個(gè)/mL接種96孔板,正常培養(yǎng)24 h后加入CCK-8試劑(上海碧云天公司)20 μL /孔,避光培養(yǎng)4 h,于450 nm處檢測各孔吸光度值(A),計(jì)算細(xì)胞存活率(A樣本孔/A空白孔×100%)。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞調(diào)整密度為2×105個(gè)/mL接種小室上室,其中侵襲實(shí)驗(yàn)中小室上室用基質(zhì)膠包被,遷移實(shí)驗(yàn)不作此操作;下室添加含有20%胎牛血清培養(yǎng)基建立遷移/侵襲模型,培養(yǎng)48 h,拭去上室內(nèi)殘留細(xì)胞和或基質(zhì)膠,固定后用0.1%結(jié)晶紫染色,光鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)(5個(gè)隨機(jī)視野)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證MRPL39與miR-130靶向關(guān)系 通過在線生物學(xué)軟件starBase預(yù)測MRPL39與miR-130的潛在結(jié)合位點(diǎn)信息,委托上海吉?jiǎng)P公司合成野生型MRPL39載體(WT-MRPL39)和突變型MRPL39載體(MUT-MRPL39),分別將上述載體、mimic-NC、miR-130 mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞,最后收集細(xì)胞檢測熒光素酶活性。

1.8 蛋白印跡法檢測細(xì)胞和組織中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物和第10號(hào)染色體丟失的磷酸酶基因(PTEN)表達(dá) 添加細(xì)胞裂解液提取組織和細(xì)胞中總蛋白,水浴變性后,各組取50 μg蛋白進(jìn)行電泳,設(shè)置90 V、50 min跑濃縮膠,110 V、30 min跑分離膠,轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h,再分別加入E鈣黏素(E-cadherin)、N鈣黏素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、PTEN和β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology公司),稀釋比為1∶1 000,4 ℃孵育過夜,再加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記蛋白二抗(上海碧云天公司)37 ℃下孵育1 h,最后添加化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光顯影。利用Image J軟件測定條帶灰度值,以β-actin標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算目的蛋白的相對蛋白表達(dá)量。

1.9 構(gòu)建裸鼠成瘤模型 將20只BALB/c裸鼠隨機(jī)分為sh-NC組和sh-MRPL39組,分別取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞于裸鼠后腿皮下種植,每天觀察裸鼠及腫瘤生長情況,待肉眼可見瘤體后,30 d時(shí)終止觀察,斷頭處死裸鼠,分離瘤體,測量其長、短徑及體質(zhì)量,計(jì)算體積(短徑2×長徑/2)。

2 結(jié)果

2.1 MRPL39和miR-130在組織樣本及細(xì)胞中的表達(dá) 與癌旁組織比較,肺癌組織中MRPL39水平升高,miR-130水平降低;差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。sh-MRPL39組細(xì)胞中MRPL39水平(0.34±0.09)低于空白組(1.00±0.14)和sh-NC組(1.06±0.18),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.834,P<0.001);空白組和sh-NC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 MRPL39和miR-130在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 低表達(dá)MRPL39對細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 與sh-NC組比較,sh-MRPL39組細(xì)胞的存活率降低,遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但空白組和sh-NC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 低表達(dá)MRPL39對細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

2.3 低表達(dá)MRPL39對細(xì)胞中EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響 與sh-NC組和空白組比較,sh-MRPL39組細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)升高,N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.084、7.270、22.520,均P<0.01);但空白組和sh-NC組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的表達(dá)

2.4 低表達(dá)MRPL39對裸鼠移植瘤的影響 與sh-NC組比較,sh-MRPL39組移植瘤中MRPL39的表達(dá)、體積和體質(zhì)量均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 低表達(dá)MRPL39對裸鼠移植瘤MRPL39表達(dá)、體積和重量的影響

2.5 MRPL39與miR-130的靶向關(guān)系 如圖2顯示,MRPL39與miR-130存在互補(bǔ)序列;與其他3組比較,miR-130 mimic+WT-MRPL39組細(xì)胞熒光素酶相對活性(0.52±0.11)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.757,P<0.001)。sh-MRPL39組、sh-MRPL39+anti-miR-NC組細(xì)胞中miR-130的表達(dá)水平(1.63±0.18、1.58±0.15)均高于sh-NC組(1.00±0.14)和sh-MRPL39+anti-miR-130組(1.24±0.21),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.911,P<0.001)。

圖2 MRPL39與miR-130的靶向結(jié)合位點(diǎn)

2.6 MRPL39靶向miR-130對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 如表4所示,sh-MRPL39組和sh-MRPL39+anti-miR-NC組的細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù),差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而sh-MRPL39+anti-miR-130組均高于sh-MRPL39+anti-miR-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 MRPL39靶向miR-130對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.7 MRPL39靶向miR-130對細(xì)胞中EMT標(biāo)志物和PTEN表達(dá)的影響 如表5所示:與sh-MRPL39+anti-miR-NC組比較, sh-MRPL39組的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PTEN的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);sh-MRPL39+anti-miR-130組E-cadherin表達(dá)降低,N-cadherin、Vimentin和PTEN表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 MRPL39靶向miR-130對細(xì)胞中EMT標(biāo)志物和PTEN表達(dá)的影響

3 討論

手術(shù)切除是NSCLC的主要治療手段,對于無法行手術(shù)治療者,放化療等治療雖可局部緩解病情,但整體效果不佳[6]。LncRNAs可參與多種生物學(xué)功能,如染色體重構(gòu)、干細(xì)胞重編程、免疫調(diào)節(jié)等,在多種癌癥中存在失調(diào)表達(dá)[7-8]。MRPL39定位于人21號(hào)染色體,大小為1 725 bp,最早被Li等[9]發(fā)現(xiàn)存在于胃癌組織中,其表達(dá)較癌旁正常胃組織低。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),MRPL39在胃癌細(xì)胞中可直接作用于miR-130,可能是一種新型胃癌生物學(xué)標(biāo)志物[5]。但MRPL39的生物學(xué)效應(yīng)尚未完全顯現(xiàn),其是否參與了NSCLC的生物學(xué)過程仍不清楚。

本研究結(jié)果顯示,相較于癌旁組織,NSCLC患者肺癌組織樣本中MRPL39表達(dá)明顯上調(diào),提示MRPL39在NSCLC中可能發(fā)揮促癌作用。進(jìn)一步研究以明確MRPL39對肺癌細(xì)胞功能的影響,發(fā)現(xiàn)敲低MRPL39可抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。EMT是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞癌變的重要病理機(jī)制,在此過程中,上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞,導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)惡性生物學(xué)行為[10]。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin均是EMT中的標(biāo)志蛋白,其中E-cadherin可參與細(xì)胞間黏附,維持細(xì)胞間連接,阻止細(xì)胞活動(dòng)侵襲與轉(zhuǎn)移擴(kuò)散;N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物,其表達(dá)增加表明細(xì)胞呈現(xiàn)EMT,遷移與侵襲能力增強(qiáng)[11]。本研究中,敲低MRPL39表達(dá)后,細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增加,N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低,進(jìn)一步表明敲低MRPL39可抑制細(xì)胞EMT,實(shí)現(xiàn)對NSCLC的抑制作用。同時(shí),裸鼠成瘤模型結(jié)果也表明,敲低MRPL39可抑制瘤體生長。

本研究利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證,MRPL39與miR-130存在靶向關(guān)系,敲低MRPL39表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞中miR-130表達(dá)。miR-130在肝癌[12]、乳腺癌[13]等多種癌癥中存在異常表達(dá),并與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),miR-130在NSCLC組織中表達(dá)異常降低,干擾miR-130表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)沉默MRPL39對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移和PTEN表達(dá)的抑制作用。研究[9]表明,miR-130與PTEN在NSCLC中存在靶向調(diào)控作用,miR-130可解除PTEN對肺癌細(xì)胞生長的刺激作用。提示MRPL39可能通過海綿吸附miR-130靶向調(diào)控PTEN,影響A549細(xì)胞增殖、遷移與侵襲過程。

綜上所述,LncRNA MRPL39在NSCLC組織中高表達(dá),LncRNA MRPL39/miR-130/PTEN軸可能參與調(diào)控A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究有望為LncRNA的靶向治療提供新靶點(diǎn),抑制MRPL39表達(dá)可能對NSCLC有治療效果,但未來還需要更多的研究數(shù)據(jù)作支撐。