頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析桂枝、白芍及其藥對的揮發(fā)性成分

戴全武，劉 毅，曾格格，田 宇，黃振陽

（湖北中醫(yī)藥大學藥學院/湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065）

中藥桂枝為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）的干燥嫩枝，味辛、甘，性溫，有發(fā)汗解肌、溫經(jīng)筋脈、助陽化氣的功效，本品以生用為主，生品桂枝辛散溫通作用較強［1，2］。中藥白芍來源于毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora）的干燥根，味苦、酸，微寒，有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂汗止陰、平肝止疼的功效［3］。桂枝-白芍藥對最早出現(xiàn)在《傷寒論》的桂枝湯中，是典型的相制藥對，二藥相合，一收一散，相互制約，為臨床常用的調(diào)和營衛(wèi)、溫通止痛藥對［4］。桂枝-白芍藥對是桂枝湯及其類方的功效基礎(chǔ)，常用于營衛(wèi)不和、外感風寒等癥，在臨床治療中應用廣泛，療效顯著［5］。桂枝和白芍均含有大量的揮發(fā)性成分，在臨床上有重要的應用價值［6，7］，使用頂空固相微萃?。℉S-SPME）與氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法（HS-SPME-GC-MS）分析桂枝、白芍配伍前后揮發(fā)性成分的報道較少。HS-SPME 技術(shù)是集樣品的萃取、濃縮、進樣功能于一體的高效前處理方法［8］。因此本研究采用HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法對比分析桂枝、白芍配伍前后的揮發(fā)性成分變化，以期為桂枝-白芍藥對的配伍規(guī)律及其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

桂枝（批號210701）和白芍（批號210901）購于湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學生藥教研室楊紅兵教授鑒定為樟科植物肉桂的干燥嫩枝和毛茛科植物芍藥的干燥根。將桂枝和白芍藥材分別打粉，過四號篩備用。

1.2 儀器

手動固相微萃?。⊿PME）進樣裝置（德國IKA 公司）；ThermoFisher Trace 1310 型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國ThermoFisher 公司）；頂空瓶（15 mL）；65 μm 聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取纖維頭（美國Supelco 公司）；ALC-210.2 型百分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）條件

1）GC 條件。色譜柱：TG-1701MS 毛細管柱；升溫程序：從50 ℃開始，保持2.5 min，以10 ℃/min 升溫至250 ℃；載氣：高純度He（99.999 %）；柱流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃。

2）MS 條件。EI 源；電子能量：70 eV，溫度：250 ℃，采用全掃描模式采集數(shù)據(jù)，掃描質(zhì)量范圍：40～600 amu。

1.4 頂空固相微萃取條件

1.4.1 取樣量 分別精密稱取桂枝-白芍藥對混合粉（質(zhì)量比為1∶1）0.40、0.60、0.80、1.00 g，在60 ℃下平衡10 min，選用65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭萃取15 min，進針后解析3 min，按GC-MS 的條件進樣測定，以色譜出峰總面積為主要指標，以質(zhì)譜鑒定出的化合物種類數(shù)為輔助指標，對樣品取樣量進行優(yōu)化，確定最佳取樣量為0.60 g。

1.4.2 萃取溫度 精密稱取桂枝-白芍藥對混合粉0.60 g，其他條件不變，分別在40、60、80、100、120 ℃條件下對混合樣品進行萃取，按GC-MS 的條件進樣測定和分析，確定最佳萃取溫度為60 ℃。

1.4.3 萃取時間 精密稱取桂枝-白芍藥對混合粉0.60 g，在60 ℃下加熱平衡10 min，其他條件不變，選用65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭分別萃取10、15、20、25、30 min，按GC-MS 的條件進樣測定和分析，確定最佳萃取時間為15 min。

1.4.4 解析時間 精密稱取桂枝-白芍藥對混合粉0.60 g，在60 ℃下加熱平衡10 min，選用65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭萃取25 min，取出，立即插入色譜儀進樣口，分別解析1、2、3、4、5 min，按GC-MS 的條件進樣測定和分析，確定最佳解析時間為3 min。

綜合單因素考察［9］結(jié)果，確定最佳的萃取條件：取樣量0.60 g，萃取溫度60 ℃，萃取時間15 min，解析時間3 min。單味藥與桂枝-白芍藥對的試驗條件一致。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，并運用Mainlib 譜庫對所出峰的質(zhì)譜圖進行檢索，以鑒定各組分。使用SPSS 26.0 軟件對桂枝、白芍及其藥對的揮發(fā)性成分進行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果與分析

依照上述條件通過HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法分析桂枝、白芍及其藥對的揮發(fā)性成分，通過氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀得到總離子流圖（圖1、圖2、圖3）。用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，并運用Mainlib譜庫對所出峰的質(zhì)譜圖進行檢索，初步鑒別出87 個成分，具體信息見表1。

表1 桂枝、白芍及其藥對的揮發(fā)性成分

圖1 桂枝的總離子流

圖2 白芍的總離子流

圖3 桂枝-白芍藥對的總離子流

2.1 桂枝、白芍及其藥對的定量分析

由圖1、圖2、圖3、表1 可知，桂枝出峰83 個，鑒定出47 個成分，相對含量為96.91%；白芍出峰86個，鑒定出49 個成分，相對含量為90.58%；桂枝-白芍藥對出峰81 個，鑒定出54 個成分，相對含量為94.57%。

桂枝的總揮發(fā)性成分中相對含量最高的是反式-肉桂醛（37.23%），其次是α-依蘭油烯（7.43%）、鄰甲氧基肉桂醛（7.14%）、α-蒎烯（7.00%）等。白芍總揮發(fā)性成分中相對含量最高的是γ-馬欖烯（17.23%），其次是α-姜黃烯（10.76%）、β-石竹烯（9.05%）、丹皮酚（7.82%）等。桂枝-白芍藥對總揮發(fā)性成分中相對含量最高的是反式-肉桂醛（21.33%），其次是鄰甲氧基肉桂醛（6.92%）、α-雪松烯（6.79%）、肉桂醛（5.35%）等。

2.2 桂枝、白芍及其藥對的揮發(fā)性成分種類和相對含量分析

從桂枝、白芍及其藥對中鑒別出的化學成分可以分為醛類、酯類、烯類、酮類、醚類、酚類、醇類、酸類，具體信息見表2。桂枝、白芍及其藥對中均是烯類成分最多。桂枝中醛類、烯類的相對含量較高，分別為48.52%、44.62%；白芍中烯類的相對含量最高，分別為71.72%；桂枝-白芍藥對中醛類、烯類的相對含量較高，分別為41.10%、44.22%。

表2 桂枝、白芍及其藥對揮發(fā)性成分數(shù)量和相對含量

2.3 桂枝、白芍及其藥對共有成分和特有成分分析

桂枝、白芍及其藥對有13 個共有成分，包括δ-欖香烯、β-石竹烯、γ-依蘭油烯、α-姜黃烯等，且相對含量有所差異。桂枝-白芍藥對和桂枝有38 個共有成分，包括反式-肉桂醛、肉桂醛、α-蒎烯等。桂枝-白芍藥對和白芍有23 個共有成分，包括γ-馬欖烯、伯克希哈拉德烯、α-律草烯等。桂枝-白芍藥對有6 個特有成分（2.49%），包括長葉松烯（0.61%）、反式-β-金合歡烯（0.98%）、反式乙酸戊烯酯（0.28%）等。桂枝有7 個特有成分（10.32%），包括α-依蘭油烯（7.43%）、去氫白菖烯（2.16%）、（+）-苜蓿烯（0.25%）等。白芍有24 個特有成分（24.33%），包括（+）-β-芹子烯（6.01%）、大根香葉烯B（2.53%）、β-倍半水芹烯（2.17%）等。

2.4 桂枝、白芍及其藥對的揮發(fā)性成分PCA

由表1 可知，桂枝、白芍及其藥對的揮發(fā)性成分相對含量數(shù)據(jù)離散，因此采用主成分分析把離散的數(shù)據(jù)標準化處理，對桂枝、白芍及其藥對揮發(fā)性成分的相似性和差異性進行評價。采用SPSS 26.0 軟件對3 組樣品的87 種揮發(fā)性成分相對含量進行主成分分析（PCA）［9］。由表3 可知，前2 個主成分的初始特征值均大于1.000，前2 個主成分的累計貢獻率達97.026%，可以反映樣品揮發(fā)性成分相對含量的整體信息，因此選取前2 個主成分進行進一步分析，結(jié)果見表4。綜合得分越高，主成分占該組總揮發(fā)性成分相對含量的比例越高。單味藥與桂枝-白芍藥對的綜合得分有所差異，其中桂枝-白芍藥對的綜合得分最高，表明桂枝-白芍藥對配伍后主成分相對含量更高，治療作用更強。

表3 主成分的初始特征值、方差及累積貢獻率

表4 桂枝、白芍及其藥對揮發(fā)性成分主成分得分和綜合得分

3 小結(jié)與討論

本研究采用HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法對桂枝、白芍及其藥對配伍前后的揮發(fā)性成分進行對比分析，分別鑒定出47、49、54 個揮發(fā)性成分，相對含量分別為96.91%、90.58%、94.57%。桂枝-白芍藥對和桂枝有38 個共有成分，桂枝-白芍藥對和白芍有23個共有成分，桂枝-白芍藥對有6 個特有成分，桂枝-白芍藥對的大部揮發(fā)性成分來源于桂枝。

桂枝-白芍藥對中有6 個新增的揮發(fā)性成分，分別是反式乙酸戊烯酯、反式-β-金合歡烯、長葉松烯、3-異丙基-4a，5-二甲基-1，2，3，4，4a，5，6，7-八氫萘-1-醇、4（15），5，10（14）-大根香葉三烯-1-醇、石竹-4（12），8（13）-二烯-5β-醇；單味藥有33 個成分未在桂枝-白芍藥對中檢出，包括α-依蘭油烯、（+）-苜蓿烯、β-倍半水芹烯等。桂枝-白芍藥對中有16 種來源于單味藥，其揮發(fā)性成分的相對含量有一定上升，如反式-α-沒藥烯、桉油烯醇、愈創(chuàng)蘭油烴、（4E）-1-甲基-4-（6-甲基庚-5-烯-2-亞基）環(huán)己烯等，桂枝揮發(fā)性成分中相對含量較高的反式-肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛、α-蒎烯等在桂枝-白芍藥對中相對含量均有明顯下降，白芍揮發(fā)性成分中相對含量較高的γ-馬欖烯、α-姜黃烯、β-石竹烯等在桂枝-白芍藥對中相對含量也有所下降。桂枝-白芍藥對中相對含量增加的桉油烯醇具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用［10］，愈創(chuàng)蘭油烴有抗菌、消腫、鎮(zhèn)痛作用［11］，桂枝-白芍藥對中新增加的成分藥理作用研究較少。反式-肉桂醛是桂枝鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、通血脈作用的主要成分之一，桂枝生品辛散能力強［12-14］，配伍后，反式-肉桂醛等主要揮發(fā)性成分相對含量的降低能夠抑制桂枝過強的辛散能力。桂枝、白芍配伍前后的揮發(fā)性成分數(shù)量和相對含量都發(fā)生了較大變化，表明桂枝、白芍配伍后桂枝-白芍藥對中的揮發(fā)性成分不只是單味藥成分的簡單相加，可能是中藥的揮發(fā)性成分在高溫萃取過程中發(fā)生了水解、氧化、還原、脫羧、聚合等反應，導致成分轉(zhuǎn)變［15］，具體原因有待進一步探究。

頂空固相微萃取技術(shù)具有待測物質(zhì)用量少、無損傷等優(yōu)點，適用于分析低沸點的萜類、醛酮類和小極性的烴類化合物，常與GC-MS 聯(lián)用分析中藥材的揮發(fā)性成分［14，16］，與溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法相比具有操作簡便、耗費時間短、揮發(fā)性成分損失少、成本低等優(yōu)點［17-19］。本研究應用HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法對桂枝、白芍配伍前后的揮發(fā)性成分進行檢測及鑒定，對配伍前后揮發(fā)性成分的變化進行探究，為桂枝-白芍藥對的配伍規(guī)律及其應用提供一定的理論依據(jù)。