基于高效液相色譜法的芹菜11 種酚類化合物分析及應用

白 天，崔新儀，李 寧，程偉霞，張 斌，劉敬波

（天津農學院園藝園林學院，天津 300380）

芹菜（Apium graveolensL.）屬于傘形科，又稱藥芹或旱芹，是中國消費量巨大的蔬菜之一，在世界各地廣泛栽培，資源豐富［1-3］。目前中國芹菜生產中常用的種類有本芹、西芹及西芹與本芹雜交改良型品種［4］。芹菜也可作為藥用植物，其代謝網絡復雜，初級代謝物和次級代謝物類型多樣，且具有廣泛的生物活性和藥理功效?，F(xiàn)代研究表明，芹菜富含酚類物質，主要是類黃酮和酚酸，酚類物質藥理活性主要體現(xiàn)在抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、降血脂、降血壓等方面，芹菜葉酚類物質含量豐富，抗氧化能力顯著高于基部莖與頂端莖［5-7］。

基于高效液相色譜（HPLC）的代謝組學技術對芹菜的化學成分及其質量進行定性和定量鑒別，能夠對多種不同類別代謝物同時進行檢測分析，不僅能夠深入理解植物代謝網絡與代謝調控，還能揭示植物表型與植物生長、發(fā)育及生物多樣性之間的關系［8-10］。任園宇等［11］建立同時測定6 種酚酸化合物的高效液相色譜-質譜串聯(lián)方法，并用于高溫脅迫前后不同品種玉米幼苗酚酸類化合物含量的檢測，表明酚酸化合物含量變化可能與高溫脅迫的敏感性有關。He 等［12］利用高效液相色譜同時測定了桑葉中綠原酸和蘆丁等化合物的含量，建立了桑葉抗氧化能力的可靠指紋圖譜，并用于桑葉質量鑒定。Wei 等［13］基于代謝組學技術對甘草151 種生物活性次級代謝產物進行定量分析，首次揭示了植物次生代謝途徑中的單親遺傳，對甘草和其他藥用植物的生物合成、遺傳和質量控制研究提供參考。Zhang等［14］利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜進行大規(guī)模非目標代謝組學分析，對不同誘導氮水平下的2 個小麥品種生長期進行代謝組學分析，證實了低氮脅迫可增加小麥次級代謝產物含量，揭示了次生代謝物積累是對非生物因素的脅迫反應。以植物代謝物為基礎的組學研究有利于建立基因和代謝產物之間的完整網絡關系，從代謝角度進一步全面闡明植物代謝規(guī)律及其關鍵途徑［15-18］。

本研究基于HPLC 建立11 種酚類化合物的分析方法，進行系統(tǒng)的方法學考察。應用該方法獲取10 種芹菜品種的酚類代謝物特征，結合聚類分析法對芹菜進行綜合評價。為芹菜品種的優(yōu)選和質量的規(guī)范化和標準化提供基礎資料，并為芹菜內在質量的綜合評價和全面控制提供新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 LC-20A 型高效液相色譜儀（PDA 檢測器），島津企業(yè)管理（中國）有限公司；HP 超聲波清洗器，保定圣峰儀器科技有限公司；CAV264C 型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.1.2 標準品 芹菜素（純度≥98%）、阿魏酸（純度≥99.5%）、木犀草素（純度≥98%）、山奈酚（純度≥98%）、槲皮素（純度≥98.5%）均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芹菜苷（純度≥98.9%）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（純度≥98.7%）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司；兒茶素（純度≥98%）購于天津百奧泰科技發(fā)展有限公司；綠原酸（純度≥98%）購于天津晟佰昊生物技術有限公司；咖啡酸（純度≥99%）購于天津索羅門生物科技有限公司；蘆?。兌取?0.5%）購于中國食品藥品檢定研究院；去離子水；乙酸（色譜純）、甲醇（色譜純）均購于天津市康科德科技有限公司；無水乙醇（分析純）購于天津百奧泰科技發(fā)展有限公司。

1.2 標準工作液的配制

分別用色譜級甲醇將芹菜素、阿魏酸、木犀草素、山奈酚、槲皮素、芹菜苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、蘆丁11 種酚類標準品溶解，定容得到0.1 mg/mL 的標準儲備液，再用甲醇將上述儲備液稀釋成試驗所需的不同質量濃度梯度標準工作液，于4 ℃冰箱避光保存。

1.3 樣品前處理

精準稱取新鮮芹菜葉片0.5 g，置于50 mL 離心管內，用乙醇水（體積比為70∶30）溶液10 mL 均質，在60 ℃下超聲波提取1 h，10 000 r/min 離心5 min，取上清液稀釋10 倍，0.22 μm 的微孔濾膜過濾后，樣品進行色譜分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Venusil XBP Cl8（L）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：0.2%乙酸溶液（pH 3.0）；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：（0～10 min，20%～50% B；10～25 min，50%～50% B；25～35 min，50%～90% B；35～45 min，90%～20% B）；流速：0.5 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：240 nm。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

采用PDA 檢測器在波長190～800 nm 范圍內對11 種酚類化合物進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)多數(shù)化合物的最大吸收波長為240～290 nm，而波長240 nm 下各化合物均有較強的紫外吸收峰，認為該波長可以兼顧各組分的檢測，因此選擇240 nm 為檢測波長。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 選擇合適的色譜柱是分析方法的關鍵。C18 色譜柱是實驗室經常使用的色譜柱，因此本研究優(yōu)先選擇C18 色譜柱。但是即使同樣是C18 色譜填料，因為鍵合技術、硅羥基封尾基團的不同，色譜柱的選擇性也有很大的差別。在色譜條件相同的情況下，比較了Venusil XBP Cl8（L）（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）3 種色譜柱對11 種酚類化合物的分離效果。結果表明，在相同的梯度洗脫下，Agilent TCC18 柱對槲皮素、木犀草素、山奈酚和芹菜素出現(xiàn)嚴重的拖尾，保留時間過長，分離效果不佳；Agilent Eclipse XDB-C18 柱對蘆丁、芹菜苷、山奈酚、芹菜素分離度不夠，并且槲皮素在該柱上保留過強；Venusil XBP Cl8（L）柱對11 種酚類化合物能很好地分離，響應值高。因此本研究選用Venusil XBP Cl8（L）色譜柱作為分離色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇 按照“1.4”項下色譜條件進行分析，對甲醇-水、甲醇-0.2%乙酸、乙腈-0.2%乙酸3 種流動相體系進行考察，在甲醇-水流動相條件下，兒茶素與雜質無法分離；乙腈-0.2%乙酸流動相條件下，11 種酚類化合物分離效果不佳。因此選擇甲醇-0.2%乙酸溶液作為本研究的流動相。

2.2.3 梯度洗脫條件的優(yōu)化 按照“1.4”項下色譜條件進行分析，考查了4 種梯度洗脫條件對11 種酚類化合物的分離效果，在李幼林等［19］的研究基礎上，基于樣品中的雜質干擾因素，將梯度洗脫時間延長，并將流動相B 濃度從40%降低至20%，另外，通過降低10～25 min 內流動相B 的濃度來達到對阿魏酸、蘆丁、芹菜苷和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的分離（表1）。結果表明，方法4 對11 種酚類化合物均獲得較好的分離和檢測效果，響應值高。因此，試驗選用方法4 進行梯度洗脫。

表1 色譜分離流動相梯度

由圖1 可知，11 種酚類化合物與其他雜質分離，各化合物的峰形良好，分離度高，因此本方法適合芹菜中11 種酚類化合物的測定。

圖1 11 種酚類化合物的高效液相色譜圖

2.3 標準曲線、線性范圍、相關系數(shù)及檢出限

配制混合標準溶液，以各分析物的峰面積（y）和相應的質量濃度（x，μg/mL）繪制標準曲線，得到線性回歸方程。結果表明，各目標物在0.5～10.0 μg/mL范圍內11 種酚類化合物的線性關系良好，相關系數(shù)（R2）均≥0.990（表2）。以信噪比（S/N）為3 時對應的對照品濃度作為檢出限（LOD），S/N 為10 時對應的對照品濃度作為定量限（LOQ）。結果表明，11 種酚類化合物的檢出限為0.07～0.29 mg/kg，定量限為0.20～0.84 mg/kg。

表2 11 種酚類化合物的回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 回收率和精密度

在測定樣品前，先測定樣品的本底值，添加標樣樣品的測定值扣除本底值的結果用于計算回收率。在0.5 g 芹菜葉樣品中分別按0.2、0.4、1.0 mg/kg 3 個濃度添加混合標準溶液，每個水平平行測定3 次。由表3 可知，11 種酚類化合物的平均加標回收率為71.90%～134.00%，相對標準偏差（RSD）為0.30%～4.00%（n=3）。說明該方法具有良好的準確度和精密度，可用于芹菜酚類活性成分的檢測。

表3 11 種酚類化合物的平均加標回收率和相對標準偏差

2.5 標準溶液的穩(wěn)定性

取相同質量濃度的11 種酚類標準品混合溶液，室溫條件下分別于第0、4、8、12、16、20、24 h 進行測定，進樣量20 μL，在“1.4”項色譜條件下進行分析，計算各成分峰面積的相對標準偏差。結果表明，11種酚類化合物精密度的相對標準偏差均小于3.00%，各成分穩(wěn)定性良好。

2.6 實際樣品測定

采用上述方法對市場售賣的10 種芹菜樣品進行測定，結果如表4 所示。在四季香芹中芹菜苷和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量較高，分別為44.525、57.879 mg/kg；在津星西芹中綠原酸含量最高，為107.119 mg/kg；在天雙西芹、四季香芹中阿魏酸含量差異明顯。

表4 不同芹菜葉樣品中11 種酚類化合物的含量（單位：mg/kg）

2.7 數(shù)據(jù)分析

聚類分析是將樣品按照品質特性相似度逐漸聚合在一起，最終按照類別的綜合性質將多個品種聚合，從而完成聚類分析的過程［20］。采用SPSS 23.0 軟件，使用組間連接法進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖2所示?；诖紊x物含量的不同將芹菜樣品分為3 類，第1 類為津青實芹一號、天津實心芹、金于夏芹和天雙西芹，第2 類為津抗法拉利、津耘芹二號、津星西芹、玉香1 號和白翠香實芹，第3 類為四季香芹。結果表明，10 種芹菜都含有重要影響的代謝產物，酚類組分存在相似性，但存在品種間的差異。通過HPLC 結合聚類分析可為芹菜質量評價及鑒定提供依據(jù)，能夠提供更多的代謝物信息，對芹菜中酚類物質的開發(fā)提供技術支撐，為研究芹菜次生代謝產物積累規(guī)律提供有效手段。

圖2 基于HPLC 的芹菜樣品的聚類分析

3 小結

本研究成功建立了一種同時測定芹菜中11 種酚類化合物含量的方法，該方法操作簡便，靈敏度高，準確度、精密度和重現(xiàn)性好，為闡述芹菜的藥效物質基礎提供了新的思路。結合聚類分析較全面地反映了芹菜酚類活性成分的化學信息，可用于評估芹菜指標成分含量與品種之間的相關性，為營養(yǎng)功能成分作用機制研究提供新方法。