高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中10 種硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量

謝云波，易 鳴，童文羽，曾 智，朱志強(qiáng)，石義付

（湖北省水產(chǎn)科學(xué)研究所，武漢 430071）

硝基咪唑（NMZs）類(lèi)藥物是一類(lèi)合成的人和動(dòng)物常用的廣譜抗菌和抗原蟲(chóng)藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常被用于防治和治療寄生蟲(chóng)感染［1］，常見(jiàn)的有甲硝唑、洛硝噠唑和地美硝唑等。但由于硝基咪唑類(lèi)藥物含有的硝基雜環(huán)具有細(xì)胞誘變性、致癌性和潛在的致畸性，經(jīng)生物體代謝后產(chǎn)生的帶有側(cè)鏈羥甲基化合物具有與原藥相似的毒性，其殘留對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成了直接威脅［2］，許多國(guó)家和地區(qū)已禁止該類(lèi)藥物用于食源性動(dòng)物，中國(guó)也于2002 年將該類(lèi)藥物列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第193 號(hào)）》［3］。

目前水產(chǎn)品中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)包括GB/T 21318—2007《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測(cè)方法》［4］和《動(dòng)物源性食品中4 種硝基咪唑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1025 號(hào)）》［5］，地方標(biāo)準(zhǔn)包括浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的DB33/T 693—2008《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》［6］，其中《動(dòng)物源性食品中4 種硝基咪唑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1025 號(hào)）》［5］僅能檢測(cè)甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、二甲硝唑；DB33/T 693—2008《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》［6］也只能檢測(cè)甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、奧硝唑，且因?yàn)槭且合喾?，靈敏度較低；GB/T 21318—2007《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測(cè)方法》［4］能檢測(cè)甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑、2-甲硝咪唑、4-甲硝咪唑8 種原藥和羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑2 種代謝產(chǎn)物，但該方法前處理操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件和操作人員水平要求較高。而且以上國(guó)家和地方標(biāo)準(zhǔn)都是針對(duì)動(dòng)物源性基質(zhì)，沒(méi)有針對(duì)水產(chǎn)品基質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不佳，回收率不穩(wěn)定的情況。

針對(duì)以上方法的不足，本研究建立了同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中10 種硝基咪唑類(lèi)藥物（表1）含量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，方法靈敏度可達(dá)1 μg/kg，線性范圍為1～150 μg/L，適用于草魚(yú)、加州鱸魚(yú)、克氏原螯蝦，該方法步驟簡(jiǎn)單、靈敏度高，適用于大批量樣品的檢測(cè)。

表1 10 種硝基咪唑類(lèi)藥物的結(jié)構(gòu)和CAS 號(hào)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)樣品均來(lái)自湖北省白沙洲農(nóng)產(chǎn)品大市場(chǎng)，品種有草魚(yú)、加州鱸魚(yú)、克氏原螯蝦。

選用10 種硝基咪唑類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品，其生產(chǎn)批號(hào)、純度、不確定度如表2 所示。

表2 硝基咪唑類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品信息

乙酸乙酯、氨水、正己烷均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司；甲醇、甲酸均為質(zhì)譜純，購(gòu)自美國(guó)默克公司。

1.2 儀器

XPE205 型十萬(wàn)分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；RE52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500B 型超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；U300 型超高效液相色譜串聯(lián)SCIEX QTRAP 4500 質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別稱(chēng)取10 種硝基咪唑類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用少量甲醇溶解，超聲波助溶，置于100 mL 棕色容量瓶中定容，配制成100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏保存，有效期3 個(gè)月。分別量取10 種硝基咪唑類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋成濃度為0.5 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品制備 魚(yú)去鱗，沿背脊取可食肌肉部分，蝦去頭、殼，取可食肌肉部分，切為小塊，絞成肉糜，經(jīng)GB/T 21318—2007《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測(cè)方法》［4］液質(zhì)法檢測(cè)確認(rèn)陰性，待用。

1.3.3 樣品提取 稱(chēng)取5.00 g 樣品，置于50 mL 離心管中，加入15 mL 乙酸乙酯，100 μL 氨水，加蓋后垂直振蕩（500 次/min）1 min，4 000 r/min 離心5 min，分離后取上清液，重復(fù)上述操作1 次，合并2 次上清液，40 ℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾至干。

1.3.4 樣品凈化 向茄形瓶中加入2 mL 正己烷，渦旋1 min，再加1.5 mL 10%甲醇溶液，渦旋1 min，再將全部液體轉(zhuǎn)移至離心管中，4 000 r/min 離心10 s，去除上層正己烷，吸取下層溶液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜待上機(jī)。

1.3.5 色譜條件 進(jìn)樣量：10 μL；色譜柱：島津C18（150 mm×2 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃。流動(dòng)相A：0.2%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.4 mL/min，各組分梯度洗脫程序如表3 所示，同時(shí)為了減少離子源污染，設(shè)定進(jìn)樣開(kāi)始后3.5～7.0 min 流動(dòng)相才進(jìn)入檢測(cè)器。

表3 洗脫程序

1.3.6 儀器質(zhì)譜條件 離子源：ESI；掃描方式：正離子模式；檢測(cè)方式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：5 500 V；霧化氣壓力：0.379 MPa；氣簾氣壓力：0.207 MPa；輔助氣壓力：0.379 MPa；離子源溫度：550 ℃，10 種硝基咪唑藥物的保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、碰撞能量等見(jiàn)表4。

表4 10 種硝基咪唑藥物的保留時(shí)間、選擇監(jiān)測(cè)離子設(shè)定參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理優(yōu)化

水產(chǎn)品中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量的檢測(cè)方法主要使用乙酸乙酯、甲醇、乙腈、二氯甲烷等有機(jī)溶劑作為提取劑，如《動(dòng)物源性食品中4 種硝基咪唑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1025 號(hào)）》［5］使用乙酸乙酯提取，正己烷液液萃取，MCX 固相萃取小柱凈化，HPLC-MS 檢測(cè)，外標(biāo)法定量；方力等［7］用乙酸乙酯提取，經(jīng)正己烷脫脂、50 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）吸附劑吸附凈化，經(jīng)0.22 μm 親水聚四氟乙烯（PTFE）濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)；劉艷萍［8］和王志杰等［9］使用無(wú)水硫酸鈉作為助劑，乙酸乙酯提取，HPLC-MS 檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量；GB/T 21318—2007《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測(cè)方法》［4］使用甲醇-丙酮均質(zhì)或超聲波提取，乙酸乙酯液液萃取，凝膠滲透色譜凈化，再經(jīng)C18 固相萃取小柱凈化，HPLC-MS 檢測(cè)，外標(biāo)法定量；DB33/T 693—2008《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》［6］用乙酸乙酯提取，正己烷液液萃取，MCX 固相萃取小柱凈化，HPLC 紫外檢測(cè)，外標(biāo)法定量。以上方法中，DB33/T 693—2008《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》［6］為液相色譜法，只能檢測(cè)甲硝唑等5 種硝基咪唑，檢測(cè)限僅為2 μg/kg，靈敏度不高；GB/T 21318—2007《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測(cè)方法》［4］和方力等［7］、黎翠玉等［10］的方法提取步驟較繁瑣，實(shí)際操作中出現(xiàn)了提取液易乳化、旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾蒸不干、過(guò)柱困難、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差、樣品回收率低等問(wèn)題；劉艷萍［8］、王志杰等［9］在乙酸乙酯中加入無(wú)水硫酸鈉作為提取助劑，但無(wú)水硫酸鈉容易吸附待測(cè)物質(zhì)，影響提取效率，并且在提取劑濃縮后有鹽結(jié)晶析出，對(duì)后續(xù)的質(zhì)譜檢測(cè)不利。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)二氯甲烷和乙酸乙酯對(duì)硝基咪唑類(lèi)藥物的提取效果較好，但二氯甲烷對(duì)人體毒性較大，不宜采用。由于硝基咪唑類(lèi)藥物是兩性化合物，在弱酸性條件下以質(zhì)子狀態(tài)存在，在弱堿性條件下，以游離分子狀態(tài)存在［11］，因此考慮在提取劑乙酸乙酯中加入氨水。但加入的氨水太多會(huì)降低氯甲硝咪唑、洛硝噠唑的線性范圍［12］。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，每15 mL乙酸乙酯中加入100 μL 氨水能夠?qū)⒙逑鯂}唑、氯甲硝咪唑的線性范圍提高至150 μg/L。由于提取劑乙酸乙酯與水互溶性較差，因此采用離心的方式分離上清中的水與乙酸乙酯。

硝基咪唑類(lèi)藥物的凈化一般有液液萃取法和固相萃取法（SPE）2 種方式。液液萃取法凈化操作相對(duì)簡(jiǎn)單，費(fèi)用也較低，但凈化效果不如固相萃取法。固相萃取法操作步驟繁瑣，回收率受操作水平和固相萃取小柱質(zhì)量影響較大且串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的強(qiáng)抗干擾能力使其對(duì)樣品的前處理凈化依賴(lài)性很低。綜上，本研究選擇加入正己烷進(jìn)行液液萃取凈化。

2.2 儀器方法的優(yōu)化

在水相中加入一定比例的甲酸能促進(jìn)離子化［12］，考察了不同含量的甲酸水溶液（0.10%、0.15%、0.20%、0.30%）對(duì)10 種目標(biāo)化合物的分離效果，結(jié)果表明，0.10%、0.15%甲酸水溶液的分離效果均不如0.20%甲酸水溶液的分離效果，0.30%甲酸水溶液與0.20%甲酸水溶液的分離效果差別不大，為保護(hù)儀器，最后選擇0.20%甲酸水溶液。流動(dòng)相中加入甲醇會(huì)導(dǎo)致10 種硝基咪唑類(lèi)藥物出現(xiàn)不同程度的峰型變寬，靈敏度下降。選擇0.20%甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相，各目標(biāo)化合物峰形尖銳對(duì)稱(chēng)，效果最好。

2.3 結(jié)果分析

按“1.3”項(xiàng)方法處理加標(biāo)后的樣品，10 種硝基咪唑類(lèi)藥物加標(biāo)樣品的離子流見(jiàn)圖1，加標(biāo)濃度均為10.0 μg/kg；陰性樣品的離子流見(jiàn)圖2，線性方程、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）見(jiàn)表5；分別按5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μg/kg 5 個(gè)加標(biāo)濃度添加，每個(gè)水平測(cè)定4 次，回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見(jiàn)表6。結(jié)果表明，方法檢出限為0.04～0.30 μg/kg，定量限為0.50～1.00 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1～150 μg/L，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.998 00，回收率為73.0%～116.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%～9.53%。

圖1 加標(biāo)樣品的離子流

圖2 陰性樣品離子流

表5 10 種硝基咪唑藥物的線性方程、檢出限與定量下限

表6 方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本研究建立的方法對(duì)湖北省市售的4 批次共210 個(gè)水產(chǎn)品中10 種硝基咪唑類(lèi)藥物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 種硝基咪唑類(lèi)藥物在4 批次水產(chǎn)品中均未檢出。

3 小結(jié)

本研究建立了同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中10 種硝基咪唑類(lèi)藥物殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1～150 μg/L，相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.998 00，在草魚(yú)、加州鱸魚(yú)、克氏原螯蝦基質(zhì)中分別添加5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μg/kg 硝基瞇唑藥物，回收率為73.0%～116.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%～9.53%。該方法步驟簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適合于大批量樣品的檢測(cè)。