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    山桐子性別分子標(biāo)記的通用性驗(yàn)證

    2023-11-07 06:26:44何秀娟王澤瓊袁龍義孫中海邱文明
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年10期
    關(guān)鍵詞:山桐子雄株雌株

    嚴(yán) 莉,仝 鑄,何秀娟,肖 翠,王澤瓊,袁龍義,孫中海,邱文明

    (1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心果樹茶葉研究分中心,武漢 430064;2.長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖北荊州 434025)

    山桐子(Idesia polycarpaMaxim.)是楊柳科(Salicaceae)山桐子屬高大落葉喬木,在中國主要分布在秦嶺、淮河以南,其果實(shí)和種子中富含豐富的油脂,是優(yōu)質(zhì)的木本油料樹種[1,2]。隨著中國木本油料行業(yè)的發(fā)展,山桐子的栽培面積不斷增加,栽培優(yōu)良新品種具有重要意義[3]。山桐子為雌雄異株植物,雌株果實(shí)和種子可用于油料生產(chǎn),雄株在生產(chǎn)上多作為授粉樹,雌株的經(jīng)濟(jì)價(jià)值明顯高于雄株。目前,山桐子的育種工作重點(diǎn)在雌性品種選育方面[4]。生產(chǎn)中,山桐子多用種子繁殖或者無性扦插繁殖[5]。實(shí)生繁殖過程中童期漫長(zhǎng),一般要經(jīng)過4~5 年的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期,才能進(jìn)入生殖成熟期[4,5];而無性繁殖成活率低,操作難度也較大,成本也較高[6]。雌雄異株植物在幼苗期的性別很難區(qū)分,因此,開發(fā)用于山桐子幼苗早期性別鑒定的技術(shù),可以極大程度地節(jié)約育種成本、縮短育種周期,在生產(chǎn)和育種方面具有極其重要的意義[7,8]。

    宋雨[9]利用表型性狀、分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)山桐子的地理分布、遺傳多樣性及種質(zhì)資源鑒定等方面進(jìn)行研究。在表型性狀方面,歲立云等[10]根據(jù)果實(shí)性狀自然變異將陜西省的山桐子劃分為6 種果實(shí)形態(tài)變異類型;張小雪等[11]通過對(duì)不同種源的2 年生山桐子生長(zhǎng)規(guī)律差異的分析,發(fā)現(xiàn)不同種源山桐子之間具有一定的遺傳差異性;李大偉[12]通過對(duì)8 省16個(gè)不同產(chǎn)地山桐子的15 個(gè)表型性狀指標(biāo)的研究,將43 個(gè)山桐子單株分為3 類。在DNA 分子標(biāo)記方面已有一些關(guān)于山桐子植物性別鑒定和遺傳資源多樣性分析的標(biāo)記被報(bào)道。簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性(Inter-simple sequence repeat,ISSR)是基于基因組微衛(wèi)星的分子標(biāo)記,為通用標(biāo)記,該標(biāo)記已在多種植物遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定、遺傳多樣性分析等研究中得到應(yīng)用[13]。王艷梅等[13]以12 個(gè)不同分布區(qū)的山桐子為材料,利用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)山桐子的遺傳差異進(jìn)行分析;代莉等[14]建立了適用于山桐子ISSR-PCR 的反應(yīng)體系;董娜等[15]以毛葉山桐子為材料,利用ISSR 分子標(biāo)記篩選出能夠鑒別毛葉山桐子性別的特異標(biāo)記UBC841。目前關(guān)于UBC841 的準(zhǔn)確性鮮見報(bào)道,該標(biāo)記為雌性特異標(biāo)記,僅在8 份(其中6 份雌株、2 份雄株)毛葉山桐子中表現(xiàn)出特異性,而沒有在更大群體中進(jìn)行驗(yàn)證[15]。因此,本研究選用來自其他群體的山桐子對(duì)該標(biāo)記進(jìn)行通用性驗(yàn)證,以驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence related amplified polymorphism,SRAP)是一種基于PCR(Polymerase chain reaction)的新型分子標(biāo)記技術(shù),該標(biāo)記不需預(yù)知物種基因序列信息,已在多種植物中得到應(yīng)用[16];雷瀚等[17]篩選出2 對(duì)SRAP分子標(biāo)記引物,可以準(zhǔn)確對(duì)滇楊(Populus yunnanensisDode)早期性別進(jìn)行鑒定;嚴(yán)武平等[18]和魏麗麗等[16]分別優(yōu)化了適用于鷓鴣茶[Mallotus oblongifolius(Miq.)Muell. Arg.]和草莓(Fragaria ananassaDuch.)的SRAP-PCR 反應(yīng)體系。在山桐子中,Wang等[19]利用SRAP 分子標(biāo)記篩選得到1 個(gè)與山桐子性別關(guān)聯(lián)的雌性特異標(biāo)記,該標(biāo)記為雌性特異標(biāo)記,其可靠性在原報(bào)道所用52 份(包括30 份雌株、22 份雄株)樣本中均可得到驗(yàn)證,將該雌性特異標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR 標(biāo)記,STZ 標(biāo)記在上述樣本中均表現(xiàn)出特異性,表現(xiàn)出良好的準(zhǔn)確率。目前STZ 標(biāo)記僅在所涉及的材料中進(jìn)行了應(yīng)用驗(yàn)證,且所涉及的山桐子樣品均來自同一地區(qū),并沒有在更大的群體中和更廣泛地域中進(jìn)行檢測(cè),其可靠性和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步檢測(cè)。

    本研究利用已知性別的山桐子種質(zhì)資源作為材料,旨在探討UBC841 和STZ 2 個(gè)分子標(biāo)記在山桐子性別鑒定中的通用性,以期為山桐子的早期性別分子鑒定提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試材及取樣

    試驗(yàn)于2020—2022 年進(jìn)行,試料取自湖北省利川市、襄陽市等地,采集已知性別的山桐子資源120份(其中雌株60 份,雄株60 份),選擇樹齡相近、無病蟲害、生長(zhǎng)結(jié)果正常的成齡植株,隨機(jī)采集樹體不同部位枝條上的幼嫩葉片,經(jīng)清水洗凈后晾干,并用液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 基因組DNA 的獲取及檢測(cè)

    采用杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA 快速提取試劑盒提取上述120 份山桐子樣品的DNA,具體提取步驟按照試劑盒說明進(jìn)行,所得DNA 用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)其質(zhì)量及完整性。將總DNA 稀釋至30 ng/μL,保存于-20 ℃?zhèn)溆?。其中離心機(jī)為Eppendorf Centrifuge 5810 R 型,微量紫外分光光度計(jì)為Nano drop 1000 型,所用凝膠成像系統(tǒng)生產(chǎn)商為Bio-Rad Laboratories Inc.,型號(hào)為Gel Doc XR+。

    1.3 標(biāo)記來源

    UBC841 標(biāo)記來源于董娜等[15];STZ 標(biāo)記來源于Wang 等[19],所用引物均為武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成,引物信息具體見表1。

    表1 山桐子性別標(biāo)記引物信息

    1.4 UBC841、STZ 性別分子標(biāo)記反應(yīng)體系的建立

    為分析標(biāo)記UBC841 的有效性,本研究參照董娜等[15]采用的PCR 條件,以24 份山桐子樣品(12 份雌株,12 份雄株)的DNA 為模板,對(duì)引物UBC841 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng),結(jié)果所得產(chǎn)物中有多態(tài)性條帶,均未發(fā)現(xiàn)性別特異條帶。因此,為了更好地驗(yàn)證其通用性,進(jìn)行了體系優(yōu)化試驗(yàn)。選擇2 個(gè)雌株和1 個(gè)雄株樣品作為模板進(jìn)行體系優(yōu)化試驗(yàn),反應(yīng)體系如下:使用25 μL 反應(yīng)體系,2×PCR Mix(預(yù)混TaqDNA Polymerase、Mg2+、dNTPs,指示染料和反應(yīng)Buffer)(武漢吉泰克基因技術(shù)有限公司)12.5 μL,10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL,DNA 模板1.0 μL,ddH2O 10.5 μL;PCR 擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,49.5~56.0 ℃(分別是49.5、51.8、53.5、54.8、55.6、56.0 ℃)退火40 s,72 ℃延伸30 s,32 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸8 min。PCR 采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),以擴(kuò)增條帶多態(tài)性和清晰程度為選擇最佳退火溫度的依據(jù)。

    采用120 份(雌株60 株,雄株60 株)山桐子進(jìn)行STZ 標(biāo)記的通用性驗(yàn)證。引物STZ 的PCR 擴(kuò)增程序如下:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,32 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    1.5 ISSR 引物PCR 擴(kuò)增

    采用“1.4”中反應(yīng)體系,利用26 對(duì)ISSR 引物(表2)進(jìn)行擴(kuò)增,退火溫度根據(jù)引物而不同,擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),所用引物均為武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

    表2 26 對(duì)ISSR 引物信息

    1.6 SRAP 引物PCR 擴(kuò)增

    選取2 份山桐子模板對(duì)隨機(jī)合成的870 對(duì)SRAP 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系同“1.4”,退火溫度根據(jù)引物而不同,擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),所用引物均為武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 UBC841 標(biāo)記在已知性別山桐子樣品中的體系優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果

    選取山桐子2 份雌性樣品和1 份雄性樣品對(duì)引物UBC841 的擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化,最終得出引物UBC841 在山桐子中的擴(kuò)增最適退火溫度為53.5 ℃。由圖1 可以看出,UBC841 標(biāo)記在所有溫度下均能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶,但均未表現(xiàn)出性別差異;UBC841 標(biāo)記在53.5 ℃退火溫度時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性較高,擴(kuò)增條帶比較清晰,非特異性擴(kuò)增較少,因此確定引物UBC841 的最適退火溫度為53.5 ℃;為驗(yàn)證引物的有效性,繼續(xù)擴(kuò)大樣本檢測(cè),采用優(yōu)化后的最適退火溫度在24 份(12 份雌株,12 份雄株)山桐子樣品中進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果如圖2 所示。UBC841 引物標(biāo)記在24 份山桐子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物中,均在250~300 bp 有多態(tài)性片段出現(xiàn),但都沒有表現(xiàn)出性別特異性。因?yàn)樵摌?biāo)記在所用材料中未表現(xiàn)出良好的性別特異性,所以沒有繼續(xù)擴(kuò)大樣本檢測(cè)。

    圖1 引物UBC841 退火溫度梯度

    圖2 引物UBC841 在24 份山桐子樣品中的驗(yàn)證結(jié)果

    2.2 STZ標(biāo)記在已知性別山桐子樣品中的驗(yàn)證結(jié)果

    利用“1.4”中反應(yīng)體系對(duì)120 份(雌株60 份,雄株60 份)山桐子樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3 所示。在60 份雌株樣品中共有26 份樣品擴(kuò)增出明亮的特異條帶,占比為43.3%,有9 份樣品擴(kuò)增條帶較弱,占比為15%;而在60 份雄性樣品中也擴(kuò)增出特異片段,且與標(biāo)記條帶大小一致,有27 份樣品擴(kuò)增出明亮的條帶,占比為45%,有7 份樣品擴(kuò)增出較暗的條帶,占比為11.7%;在雌雄株中均能擴(kuò)增出特異片段,雌雄株擴(kuò)增出特異片段的比例相近,并沒有在雌株中表現(xiàn)出性別差異,因此沒有性別特異性,而在Wang等[19]報(bào)道中STZ 是雌性特異標(biāo)記,僅出現(xiàn)在雌性樣品中。

    2.3 ISSR 引物擴(kuò)增多態(tài)性

    選取6 份山桐子樣品對(duì)26 對(duì)ISSR 引物進(jìn)行擴(kuò)增,部分引物擴(kuò)增結(jié)果如圖4 所示。26 對(duì)引物共有20 對(duì)引物能夠擴(kuò)增出條帶,引物有效率為76.9%,共擴(kuò)增出176 條條帶,其中引物UBC829 擴(kuò)增條帶數(shù)最多,為13 條;其次是引物UBC812 和UBC864,均擴(kuò)增出12 條條帶;但是該20 對(duì)引物在6 份山桐子樣品中均未表現(xiàn)出性別特異性,因此沒有繼續(xù)擴(kuò)大樣本進(jìn)行檢測(cè)。

    圖4 部分ISSR 引物在6 份山桐子樣品中的擴(kuò)增圖譜

    2.4 SRAP 引物擴(kuò)增多態(tài)性

    經(jīng)過SRAP-PCR 擴(kuò)增篩選,846 對(duì)引物中有792對(duì)引物可擴(kuò)增出清晰的條帶,引物的有效擴(kuò)增率達(dá)91.03%;有231 對(duì)引物能夠擴(kuò)增出多態(tài)性條帶,部分引物擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖5 所示。初步統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,265 對(duì)引物共擴(kuò)增得到1 338 條條帶,其中引物組合me04/em04 條帶數(shù)最多,為15 條,選取6 份模板(雌株3 份,雄株3 份)對(duì)該265 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)大樣本篩選,在雌雄株中均未表現(xiàn)出特異性。

    圖5 部分SRAP 引物在2 份山桐子樣品中的擴(kuò)增圖譜

    3 討論

    山桐子早期性別鑒定對(duì)育種和栽培實(shí)踐有重要意義。山桐子作為雌雄異株植物,其雌株的經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)高于雄株,但由于山桐子的童期較長(zhǎng),且結(jié)實(shí)較晚,幼年期的山桐子雌、雄株在形態(tài)上很難將其區(qū)分,通常需要經(jīng)過3~5 年,在開花期通過雌雄花才能準(zhǔn)確區(qū)分,這給生產(chǎn)帶來極大不便,因此,研究山桐子早期性別分化,在生產(chǎn)上合理配置雌雄個(gè)體,對(duì)提高山桐子產(chǎn)量具有重要意義[8,15]。

    已報(bào)道的有關(guān)植物性別鑒定的方法有很多,包括形態(tài)學(xué)[20]、生理生化[21]、同工酶[22]等,這些方法大都是對(duì)已成熟個(gè)體性別差異的研究。植物個(gè)體性別分化會(huì)受到多種因素的影響,因此上述方法用于早期性別鑒定時(shí),結(jié)果可靠性往往較差[23]。DNA 分子標(biāo)記受發(fā)育階段及外界環(huán)境的影響小,鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性高,因此被廣泛應(yīng)用于雌雄異株植物的早期性別鑒定中[8,23]。目前被報(bào)道的分子標(biāo)記中,應(yīng)用到山桐子中的主要有SSR、ISSR、SRAP 和SCAR等[5,15,19];李娜等[5]基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的SSR 分子標(biāo)記可將4 個(gè)不同地區(qū)的山桐子進(jìn)行區(qū)分;王艷梅等[13]、代莉等[14]和董娜等[15]分別利用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)山桐子的遺傳差異進(jìn)行分析,優(yōu)化了適用于山桐子的體系,篩選出了能夠鑒別山桐子性別的特異標(biāo)記;Wang 等[19]利用SRAP 分子標(biāo)記開發(fā)了可以鑒別山桐子雌雄株的特異標(biāo)記,并將此標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR 分子標(biāo)記,該標(biāo)記為雌性特異標(biāo)記。ISSR分子標(biāo)記為通用性分子標(biāo)記,無需預(yù)先知道物種基因組的序列[15];目前ISSR 已廣泛應(yīng)用于美洲黑楊(Populus deltoidsMarshall)的新無性系材料鑒定、紅橘(Citrus reticulataBlanco)種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、番茄(Lycopersicon esculentumMiller)種質(zhì)資源遺傳多樣性分析等方面[24-26]。董娜等[15]在ISSR 分子標(biāo)記開發(fā)過程中,所選用材料是毛葉山桐子,采用優(yōu)化后的體系對(duì)100 條引物進(jìn)行檢測(cè),最終在100 對(duì)引物中發(fā)現(xiàn)引物UBC841 能夠在雌株中擴(kuò)增出特異性條帶并且可以穩(wěn)定存在,該條帶大小為250~300 bp;本研究在對(duì)UBC841 標(biāo)記引物進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證時(shí),先對(duì)其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,后為驗(yàn)證引物有效性在24 份山桐子樣品中進(jìn)行擴(kuò)大樣本驗(yàn)證,結(jié)果顯示,該引物在250~300 bp 有多態(tài)性片段出現(xiàn),但是在雌雄株中并沒有表現(xiàn)出性別特異性,因此沒有繼續(xù)擴(kuò)大樣本進(jìn)行檢測(cè)。此外,對(duì)該擴(kuò)增片段進(jìn)行回收測(cè)序,共獲得10 條不同的序列,因此該引物不宜用于山桐子雌雄株的早期鑒定。

    SRAP 分子標(biāo)記根據(jù)基因外顯子和啟動(dòng)子中堿基特征,設(shè)計(jì)獨(dú)特的雙引物來擴(kuò)增開放閱讀框架(ORFs)的特定區(qū)域,與ISSR 分子標(biāo)記相同,SRAP標(biāo)記不需要事先獲取被檢測(cè)物種的基因組序列,具有簡(jiǎn)單、高效的特點(diǎn)[16,18,27]。目前SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在滇楊(Populus yunnanensisDode)[17]、獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)[28]、蘋果(Malus domesticaMill.)[29]、草莓[16]等植物中均有應(yīng)用。山桐子STZ 標(biāo)記就是利用SRAP擴(kuò)增到的210 bp雌株特異片段轉(zhuǎn)化而來[19]。但是本研究在驗(yàn)證該標(biāo)記的通用性時(shí),雌株中有35份樣品有該特異條帶,雄株中有34 份樣品有該條帶,并未表現(xiàn)性別特異性。推測(cè)可能是使用的山桐子樣本太少,獲得的差異片段并不與性別連鎖[19]。

    本研究除檢驗(yàn)UBC841 和STZ 分子標(biāo)記的通用性外,還分析了大量的ISSR 和SRAP 分子標(biāo)記引物,但未篩選出山桐子性別特異標(biāo)記。隨著中國木本油料行業(yè)的快速發(fā)展,急需開發(fā)可靠的分子標(biāo)記進(jìn)行山桐子早期性別鑒定。下一步,除了嘗試其他新的分子標(biāo)記技術(shù)外,更需加強(qiáng)山桐子性別分化分子機(jī)制的研究,探明其性別分化、形成的機(jī)理,開發(fā)簡(jiǎn)單、高效、可靠的性別鑒定方法,節(jié)約育種成本,加快育種進(jìn)度,更好地支撐產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

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