瀘州市與廣州市龍眼核不同極性部位體外抗氧化活性的比較研究

陳永鈞，代良敏，代良萍，張 春，王 燕

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東湛江 524001）

龍眼（Dimocarpus longanLour.）為無(wú)患子科龍眼屬植物龍眼的果實(shí)，營(yíng)養(yǎng)豐富并具有壯陽(yáng)益氣、補(bǔ)益心脾、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)智力發(fā)育等功效［1-3］，屬于藥食同源的滋補(bǔ)佳品，同時(shí)也是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。龍眼核為龍眼的種仁，約占果實(shí)干重的75%，其性味澀、平，氣微，味淡而微苦，具有行氣散結(jié)、止血、止瀉、燥濕等功效，臨床上主治疝氣、瘰疬、創(chuàng)傷出血、腋臭、疥癬、濕瘡等病癥［4，5］。龍眼核成分眾多，其中多糖、生物堿、黃酮類和多酚類等多種活性物質(zhì)為其良好的抗氧化、抑菌、降糖、降脂、抗癌等生物活性奠定了基礎(chǔ)［6-13］。

四川省瀘州市是中國(guó)晚熟龍眼的主產(chǎn)區(qū)之一，截至2020 年底，瀘州市龍眼種植面積已達(dá)2.05 萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)15 萬(wàn)t，占全省種植面積和年產(chǎn)量的90%以上［2，14-16］。盡管龍眼的產(chǎn)量高但其利用率很低，其主要被加工成龍眼干、桂圓肉、罐頭、果汁、酒類等產(chǎn)品，而加工過(guò)程產(chǎn)生的大量龍眼核則被當(dāng)作廢棄物處理，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)［17-20］。目前鮮見瀘州市和廣州市龍眼核抗氧化活性比較研究的報(bào)道。因此，鑒于龍眼核的藥用價(jià)值以及抗氧化作用是眾多生理、病理現(xiàn)象研究的基礎(chǔ)，本研究以瀘州市和廣州市兩主產(chǎn)區(qū)的龍眼核為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行抗氧化活性的比較研究，以期為充分利用龍眼核的藥用資源和推動(dòng)當(dāng)?shù)佚堁酆讼嚓P(guān)產(chǎn)品的深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

龍眼核購(gòu)于廣州市荔灣區(qū)（廣州荔灣）、瀘州市江陽(yáng)區(qū)張壩桂圓林（瀘州張壩）、瀘州市黃艤鎮(zhèn)（瀘州黃艤）3 個(gè)產(chǎn)地，均為干燥龍眼果實(shí)，去除果皮和假種皮后獲得種子，干燥，備用。

1.2 試劑

維生素C（VC）、過(guò)硫酸鉀、磷酸氫二鉀、正丁醇、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜（DMSO），成都金山化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），成都潤(rùn)澤本土化工有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），上海阿拉丁試劑有限公司；磷酸二氫鈉，成都市科龍化工試劑廠；石油醚、乙酸乙酯，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 儀器

電子分析天平（ME204 型），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140MBE 型），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；高速多功能粉碎機(jī)（800Y 型），武義海納電器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-1 型），江蘇省金壇市榮華儀器有限公司；超聲波清洗器（SB-100D 型），寧波新芝生物科技股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（YRE-2010Z 型），鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；酶標(biāo)儀（Multiskan GO型），賽默飛世爾科技有限公司。

2 方法

2.1 龍眼核粗提物的制備

將龍眼核置于60 ℃烘干至恒重后粉碎，過(guò)30 目篩，裝袋。稱取龍眼核粉末100 g，置于2 L 的蒸餾燒瓶中，每次加入0.5 L無(wú)水乙醇，于70 ℃回流提取1 h，重復(fù)提取3 次。過(guò)濾并合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。經(jīng)干燥后稱量，得到粗提物的干膏重量。

2.2 硅膠拌樣

按1∶2 的質(zhì)量比稱取龍眼核粗提物與硅膠粉末，于龍眼核粗提物中加入適量無(wú)水乙醇溶解，再將其滴加到盛有硅膠粉末的器皿中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笥?0 ℃水浴上揮干溶劑，最后將其置于真空干燥器中減壓干燥30 h，即得樣品硅膠粉。

2.3 龍眼核不同極性部位的提取

取適量“2.2”中所得樣品硅膠粉，裝入1 L 的蒸餾燒瓶中，每次加入0.5 L 石油醚進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取3 次直至濾液接近無(wú)色或呈淺黃色。然后向蒸餾燒瓶中依次加入等量乙酸乙酯、正丁醇、無(wú)水乙醇和水進(jìn)行萃取，過(guò)濾并合并濾液，濾液經(jīng)減壓濃縮、干燥后得不同極性部位干浸膏，稱量備用［13］。

2.4 龍眼核不同極性部位的抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.4.1 DPPH 法

1）DPPH 溶液的配制。精密稱取DPPH 2 mg 溶于50 mL 無(wú)水乙醇中，超聲溶解。于4 ℃條件下避光保存并在3.5 h 內(nèi)用畢［21，22］。

2）樣品溶液的配制。分別精密稱取石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無(wú)水乙醇和水提部位的各產(chǎn)地干浸膏3 mg，加適量無(wú)水乙醇溶解并稀釋成濃度為0.30、0.26、0.22、0.18、0.14、0.12、0.08、0.04 mg/mL 的系列溶液［23］。

3）VC 溶液的配制。精密稱取VC 3 mg，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋成濃度為0.30、0.26、0.22、0.18、0.14、0.12、0.08、0.04 mg/mL 的VC 對(duì)照液，備用［24］。

4）試驗(yàn)利用96 孔板進(jìn)行測(cè)定。將試驗(yàn)分為10組，包括8 個(gè)樣品組、1 個(gè)空白組和1 個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。加樣方法如下，樣品組：100 μL 各濃度樣品溶液+100 μL DPPH 溶液；空白組：100 μL 0.3 mg/mL 的樣品溶液+100 μL 無(wú)水乙醇；對(duì)照組：100 μL 無(wú)水乙醇+100 μL DPPH 溶液。避光操作，混勻反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇作參比，于517 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)得吸光度As、Ao和A。以VC 對(duì)照液作陽(yáng)性參照，按式（1）計(jì)算樣品的抗氧化能力［25-27］。

式中，As為樣品組溶液吸光度；Ao為空白組溶液吸光度；A為對(duì)照組溶液吸光度。

2.4.2 ABTS 法

1）PBS 緩沖液的配制。準(zhǔn)確稱取7.16 g 磷酸氫二鈉定容至100 mL，得甲溶液；準(zhǔn)確稱取3.12 g 磷酸二氫鈉定容至100 mL，得乙溶液，取81 mL 甲溶液及19 mL 乙溶液混合均勻，即得pH 7.4 的PBS 緩沖溶液［28，29］。

2）ABTS 工作液的配制。精密稱取ABTS（2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉）粉末30 mg 溶于8 mL去離子水中，另取8.8 mg 的過(guò)硫酸鉀溶于15 mL 去離子水中，兩者混合避光反應(yīng)14～16 h，稀釋后避光備用［30］。

3）樣品溶液的配制。分別精密稱取石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無(wú)水乙醇和水提部位的干浸膏0.2 mg，溶解于10 mL 的DMSO 中，再依次稀釋至適宜濃度。石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取部位的濃度梯度為0.040、0.036、0.032、0.028、0.024、0.020、0.016 mg/mL，無(wú)水乙醇和水提部位的濃度梯度為0.100、0.090、0.080、0.070、0.060、0.050、0.040 mg/mL。

4）試驗(yàn)利用96 孔板進(jìn)行測(cè)定。將試驗(yàn)分為9組，包括7 個(gè)樣品組、1 個(gè)空白組和1 個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。加樣方法如下，樣品組：50 μL 樣品液+150 μL ABTS 工作液；空白組：50 μL PBS 緩沖液+150 μL ABTS工作液；對(duì)照組：50 μL濃度為2.0 mg/mL的樣品液+150 μL 去離子水，混勻反應(yīng)30 min 后，于734 nm 處分別測(cè)吸光度Aj、Ai、A。以PBS 緩沖液為對(duì)照，按式（2）計(jì)算樣品的抗氧化能力［31］。

式中，Aj為樣品組溶液吸光度；Ai為對(duì)照組溶液吸光度；A為空白組溶液吸光度。

2.4.3 數(shù)據(jù)處理 各產(chǎn)地的龍眼核均按相同的方法進(jìn)行操作，各試驗(yàn)重復(fù)3 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示。采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析與樣本均值間差異的顯著性比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 龍眼核干膏重量

各產(chǎn)地龍眼核經(jīng)不同極性的溶劑提取，所得干燥浸膏的質(zhì)量如表1 所示。各極性部位干膏質(zhì)量的大小除瀘州張壩產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)為正丁醇＞乙酸乙酯＞無(wú)水乙醇＞石油醚＞去離子水外，其余兩地表現(xiàn)為正丁醇＞乙酸乙酯＞無(wú)水乙醇＞去離子水＞石油醚，3 個(gè)產(chǎn)地較為一致。

表1 各極性部位干膏質(zhì)量（n=3） （單位：g）

3.2 DPPH 法測(cè)定龍眼核不同極性提取物的抗氧化作用

由圖1 可知，以VC 作為陽(yáng)性對(duì)照，各產(chǎn)地龍眼核的不同極性部位均表現(xiàn)出一定程度的DPPH 自由基的清除能力，且在0.04～0.30 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)，DPPH 自由基清除率均隨著濃度的增加逐漸上升并趨于平衡。不同產(chǎn)地的龍眼核，其極性部位清除DPPH 自由基的能力亦有所差異。

廣州市荔灣龍眼核各極性部位的DPPH 自由基清除水平大小表現(xiàn)為乙酸乙酯＞水＞正丁醇≈無(wú)水乙醇＞石油醚。其中，乙酸乙酯部位的清除能力最強(qiáng)，其IC50為0.021 mg/mL（表2），當(dāng)濃度為0.18 mg/mL時(shí)，其清除率可達(dá)91.9%。相反，石油醚部位的清除能力最弱，當(dāng)濃度為0.30 mg/mL 時(shí)，清除率僅為21.9%。瀘州張壩龍眼核各極性部位DPPH 自由基清除率高低表現(xiàn)為乙酸乙酯＞石油醚≈無(wú)水乙醇≈正丁醇＞水。其中，乙酸乙酯部位的清除能力依然最強(qiáng)，其IC50為0.022 mg/mL（表2），當(dāng)濃度為0.14 mg/mL時(shí)，其清除率可達(dá)90.7%。此外，水部位的清除能力最弱，但當(dāng)濃度為0.30 mg/mL時(shí)，清除率亦可達(dá)85.5%。

表2 DPPH 法測(cè)得龍眼核不同極性部位的IC50（單位：mg/mL）

瀘州黃艤龍眼核各極性部位DPPH 自由基清除率高低表現(xiàn)為水＞乙酸乙酯＞石油醚＞正丁醇＞無(wú)水乙醇。其中，水部位的清除能力最強(qiáng)，其IC50為0.029 mg/mL（表2），當(dāng)濃度為0.112 5 mg/mL 時(shí)，其清除率可達(dá)93.2%。此外，無(wú)水乙醇部位的清除能力最弱，但當(dāng)濃度為0.30 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)92.6%。

由表2 可以看出，瀘州張壩龍眼核在石油醚、正丁醇和無(wú)水乙醇提取部位的抗氧化活性強(qiáng)于廣州荔灣產(chǎn)區(qū)。各產(chǎn)地龍眼核乙酸乙酯提取部位均有較好的抗氧化活性，瀘州張壩與廣州荔灣的結(jié)果相近。

3.3 ABTS+·法測(cè)定龍眼核不同極性提取物的抗氧化作用

由圖2 可以看出，除石油醚部位外，其余極性部位在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)對(duì)ABTS+自由基的清除率均隨著濃度的增加呈上升趨勢(shì)。此外。還可以看出，不同產(chǎn)地的龍眼核各極性部位清除ABTS+自由基的能力同樣有差異。

圖2 龍眼核不同極性部位的ABTS+自由基清除率

廣州荔灣龍眼核各極性部位的ABTS+自由基清除率高低表現(xiàn)為石油醚＞乙酸乙酯＞正丁醇＞水＞無(wú)水乙醇（圖2A、圖2B）。其中，石油醚部位的清除能力最強(qiáng)，在其濃度范圍內(nèi)ABTS+自由基清除率最低可達(dá)89.84%，而無(wú)水乙醇部位的清除能力最弱，當(dāng)濃度為0.04 mg/mL 時(shí)，清除率僅為17.56%，其IC50為0.068 mg/mL（表3）。

表3 ABTS+·法測(cè)得龍眼核不同極性部位的IC50（單位：mg/mL）

瀘州張壩龍眼核各極性部位ABTS+自由基清除率高低表現(xiàn)為石油醚＞乙酸乙酯＞正丁醇＞無(wú)水乙醇＞水（圖2C、圖2D）。瀘州張壩龍眼核石油醚部位的清除能力最強(qiáng)，在其濃度范圍內(nèi)ABTS+自由基清除率最低可達(dá)93.51%，而水部位的清除能力最弱，當(dāng)濃度為0.040 mg/mL 時(shí)，幾乎無(wú)抗氧化作用。

瀘州黃艤龍眼核各極性部位ABTS+自由基清除率高低順序同張壩龍眼核，即石油醚＞乙酸乙酯＞正丁醇＞無(wú)水乙醇＞水（圖2E、圖2F）。其中，石油醚部位的清除能力雖最強(qiáng)，但其最高清除率未超過(guò)65%，其余極性部位的清除率則更低。

整體而言，瀘州張壩和廣州荔灣產(chǎn)地的龍眼核清除ABTS+自由基的能力高于瀘州黃艤，且各產(chǎn)地龍眼核中石油醚部位的清除能力最強(qiáng)、乙酸乙酯部位次之。

4 討論

試驗(yàn)采用5 種不同極性的溶劑對(duì)3 個(gè)主產(chǎn)地龍眼核的醇提物進(jìn)行萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中2 個(gè)主產(chǎn)地干膏質(zhì)量的大小均表現(xiàn)為正丁醇＞乙酸乙酯＞無(wú)水乙醇＞水＞石油醚，推測(cè)其原因可能與溶劑極性不同所溶解成分的總量不同有關(guān)，上述5 種溶劑中正丁醇極性較適中，其溶解成分的總量最多，隨著溶劑極性的增大或減小能夠溶解的成分總量有所減少，故而石油醚和去離子水的干膏質(zhì)量最小。

本試驗(yàn)通過(guò)DPPH 法和ABTS+·法，對(duì)比考察了3 個(gè)產(chǎn)地的龍眼核不同極性部位的體外抗氧化作用。從整體上看，①不同產(chǎn)地間的比較：張壩的龍眼核清除DPPH 自由基的能力在石油醚、正丁醇和無(wú)水乙醇提取部位強(qiáng)于廣州荔灣產(chǎn)區(qū)。張壩和荔灣兩地龍眼核清除ABTS+自由基的能力則整體高于黃艤，其原因極可能與不同產(chǎn)地龍眼核中抗氧化活性成分的種類和含量不同有關(guān)，從而進(jìn)一步導(dǎo)致不同產(chǎn)地間和同一產(chǎn)地內(nèi)龍眼核不同極性部位的抗氧化作用不同。②不同極性部位間的比較：各極性部位中以乙酸乙酯部位清除DPPH 自由基的能力最強(qiáng)，而石油醚部位清除ABTS+自由基的能力則最強(qiáng)、乙酸乙酯部位次之，總體而言乙酸乙酯部位的抗氧化活性非常突出，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［21，32］相一致，該文獻(xiàn)指出龍眼核中的酚類抗氧化物質(zhì)主要為小分子化合物，極性較小，易溶于乙酸乙酯有機(jī)溶劑，導(dǎo)致乙酸乙酯部分總酚含量最高。③不同自由基間的比較：同產(chǎn)地、同極性部位對(duì)2 種自由基表現(xiàn)出不同的清除能力，總體表現(xiàn)為對(duì)ABTS＋自由基的清除能力強(qiáng)于對(duì)DPPH 自由基的清除能力，這可能與龍眼核抗氧化活性成分對(duì)不同自由基的敏感性及作用機(jī)理差異有關(guān)［21］。

5 小結(jié)

本研究結(jié)果表明，瀘州張壩產(chǎn)地的龍眼核在體外抗氧化能力方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，雖擁有豐富的資源，但其藥用價(jià)值并未得到充分利用，本研究結(jié)果可為當(dāng)?shù)佚堁酆擞行镔|(zhì)的考察和相關(guān)藥物的開發(fā)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。