蘋果內(nèi)生菌Torulaspora delbrueckii強(qiáng)化對(duì)蘋果醋風(fēng)味物質(zhì)合成的影響

宋雪苗，馬世源，李子健，羅惠波，黃 丹,2,*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

蘋果醋作為一種健康風(fēng)味飲品，具有較為廣泛的市場(chǎng)認(rèn)可度。2021年我國(guó)蘋果醋飲料的市場(chǎng)規(guī)模已超50億 元且將持續(xù)增長(zhǎng)。蘋果醋揮發(fā)性香氣成分豐富，對(duì)4 個(gè)品牌市售蘋果醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定到111 種化合物，其中相對(duì)含量較高的是醇類、醛類、酯類和其他雜環(huán)類化合物；而乙酸乙酯、乙酸丙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁基乙酸酯、3-甲基丁酸戊酯、己醛、苯甲醛和2,3-二氫呋喃9 種化合物則是4 種蘋果醋飲料中的共有化合物[1]。蘋果醋的營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中微生物對(duì)糖類等成分的轉(zhuǎn)化和微生物代謝，以及水果天然的香氣等。傳統(tǒng)上，僅使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）參與蘋果醋酒精發(fā)酵。使用單一菌種發(fā)酵易于獲得一致、穩(wěn)定的味道和香氣，但會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品的香氣復(fù)雜性和典型性較少。與S.cerevisiae相比，非釀酒酵母具有改善發(fā)酵制品風(fēng)味的潛力[2-4]。非釀酒酵母種類繁多，包括葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、畢赤酵母（Pichiaspp.）等。Liu Qing等[5]采用熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）和芳香酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)的蘋果醋中水果風(fēng)味和花香味均高于單一培養(yǎng)。另外，Ni Zhenghang等[6]通過(guò)T.delbrueckii與S.cerevisiae共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，醇類、乙酯類和萜烯的含量增加，并使蘋果酒具有濃郁的水果和花香味。然而，關(guān)于T.delbrueckii對(duì)果醋風(fēng)味的影響卻鮮有報(bào)道。

內(nèi)生菌是棲息在植物組織內(nèi)部而不對(duì)植物造成明顯傷害的微生物[7]，一般具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、抵御環(huán)境損傷和提高植物抗病性等功能[2,8-9]。通過(guò)與宿主的長(zhǎng)期共存，這類微生物已經(jīng)發(fā)展出強(qiáng)大的代謝途徑。據(jù)報(bào)道，一些內(nèi)生菌合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物與其宿主產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)類似[10]；Liu Feng等[11]發(fā)現(xiàn)咖啡豆表面的天然內(nèi)生菌在改善咖啡風(fēng)味特征方面具有重要貢獻(xiàn)。然而，在以往研究中，蘋果內(nèi)生菌對(duì)蘋果醋風(fēng)味的影響鮮有報(bào)道。

因此，為更全面地了解蘋果內(nèi)生菌T.delbrueckiiS1對(duì)蘋果醋風(fēng)味品質(zhì)的影響，本研究將實(shí)驗(yàn)室分離自蘋果的內(nèi)生菌T.delbrueckiiS1用于蘋果醋發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定其風(fēng)味成分，并探明T.delbrueckiiS1菌株對(duì)蘋果醋發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)間相互作用的影響。目前，涉及蘋果醋特征風(fēng)味的研究很少，本研究就提高蘋果醋典型性蘋果香、花香和醋香以改善其風(fēng)味品質(zhì)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果（Malus pumilaMill.）；T.delbrueckiiNJSYGA 2021（T.delbrueckiiS1）從蘋果中分離獲得，現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2022046，T.delbrueckiiS1的最適發(fā)酵溫度25 ℃，最適pH 3.5；葡萄酒活性干酵母BV818（S.cerevisiae）（活菌數(shù)1.5×1011CFU/g）湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌（活菌數(shù)2×1010CFU/g）成都曲賦生物科技有限公司。

果膠酶（酶活力≥1000 U/g）山東科隆特酶制劑有限公司；蔗糖、檸檬酸（均為食品級(jí)）廣西珍露食品有限公司；乙酸戊酯 Adamas試劑有限公司；甲醇（色譜級(jí)）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；草酸、酒石酸、L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜級(jí)）成都德思特生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純 成都市科隆化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C118C超凈工作臺(tái)、ZWYR-D2403恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；ME20E/02電子天平、FE20K pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；WZS80持式糖量計(jì) 上海物光儀器有限公司；離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf股份公司；BXM-75VD立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；LC-2030C 3D Plus HPLC儀 島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；7890A/5975B GC-MS儀 美國(guó)Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭 美國(guó)Supelco公司；SPME裝置 蘇州安益譜精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果醋發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

參考已有報(bào)道[12-13]并進(jìn)行適當(dāng)修改。將成熟的蘋果去皮、去核，果肉與去離子水按質(zhì)量比1∶1榨汁，加入20 mg/L果膠酶（（37±2）℃，60 min）和56 mg/L K2S2O5，添加蔗糖調(diào)節(jié)果漿的總可溶性固形物含量為15 °Brix，再用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 3.5，以70 ℃巴氏殺菌15 min對(duì)果漿進(jìn)行殺菌。

實(shí)驗(yàn)組以各體積分?jǐn)?shù)6%（106CFU/mL）的接種量同時(shí)接種S.cerevisiae和T.delbrueckiiS1于果漿中，在25 ℃條件下發(fā)酵至乙醇體積分?jǐn)?shù)約6%，再以0.4 g/100 mL接種量接種醋酸菌，醋酸發(fā)酵階段采用8 層紗布密封發(fā)酵瓶，發(fā)酵溫度為31 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵時(shí)間為24 d。對(duì)照組在酒精發(fā)酵階段僅接種體積分?jǐn)?shù)6%S.cerevisiae（106CFU/mL），醋酸發(fā)酵條件與實(shí)驗(yàn)組一致。所有樣品均做3 份生物學(xué)重復(fù)。取樣時(shí)間為酒精發(fā)酵結(jié)束以及醋酸發(fā)酵的3、6、8、10、12、14、16、18、20、22 d和24 d（對(duì)照組A和實(shí)驗(yàn)組H的1～11分別對(duì)應(yīng)3～24 d）。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

總酸含量的測(cè)定：酸堿滴定法（以酒石酸計(jì)）[14]；乙醇體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定：酒精計(jì)法[15]。每份生物學(xué)重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.3 蘋果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

采用HS-SPME-GC-MS法測(cè)定揮發(fā)性物質(zhì)。將5.0 mL蘋果醋加入15 mL頂空瓶中，添加2.0 g氯化鈉，再添加6 μL乙酸戊酯作為內(nèi)標(biāo)。樣品在50 ℃條件下密封平衡15 min，再采用DVB/CAR/PDMS萃取頭于50 ℃條件下頂空吸附40 min，將萃取頭插入GC進(jìn)樣口解吸2 min進(jìn)行分析。每份生物學(xué)重復(fù)分析2 次。

色譜條件：色譜柱：DB-1MS熔斷石英毛細(xì)管（60 m×0.25 mm，0.25 μm）分離；升溫程序：45 ℃保持1 min，再以5 ℃/min升溫至190 ℃，保持25 min，總運(yùn)行時(shí)間為55 min；不分流；載氣（He）流速為1.0 mL/min。質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子化方式為電子電離源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍45～500 u。

定性：通過(guò)檢測(cè)得到香氣成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，將這些數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)以及NIST 05質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行匹配定性，僅報(bào)道Qual≥70的鑒定結(jié)果。定量：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，內(nèi)標(biāo)為乙酸戊酯。各揮發(fā)性成分含量計(jì)算公式如下：

1.3.4 蘋果醋主要有機(jī)酸測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定有機(jī)酸。配制質(zhì)量濃度為300、200、100、50、25 m g/L 的琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液；配制質(zhì)量濃度為200、100、50、20、10、5 mg/L的L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取5 mL樣品6000 r/min離心2 min，上清液稀釋10 倍并用0.22 μm水相濾頭過(guò)濾，樣品通過(guò)ZORBAX SB-C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行分析，進(jìn)樣量為15 μL。流動(dòng)相為甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH 2.5）（5∶95，V/V），流速為0.4 mL/min。柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)計(jì)算代謝物的倍數(shù)變化和P值進(jìn)行兩組之間的統(tǒng)計(jì)分析，如果相關(guān)的P＜0.05，則認(rèn)為結(jié)果的差異顯著。使用Origin（2020版）繪制折線圖，使用R軟件（4.1.3版本）繪制熱圖和箱線圖。由SIMCA 14.1建立正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）模型并計(jì)算投影變量重要性值（variable importance projection，VIP）。共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建使用Gephi（0.9.2版本）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果醋理化指標(biāo)

如圖1所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩組蘋果醋的乙醇體積分?jǐn)?shù)均呈不斷下降的趨勢(shì)，相反地，總酸含量則先迅速增加而后小輻波動(dòng)，總酸含量趨于穩(wěn)定標(biāo)志著醋酸發(fā)酵結(jié)束。酒精發(fā)酵結(jié)束至醋酸發(fā)酵的第10天，兩組蘋果醋中乙醇體積分?jǐn)?shù)的波動(dòng)明顯，這可能是酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行導(dǎo)致；酒精發(fā)酵結(jié)束至醋酸發(fā)酵的第6天，兩組蘋果醋的總酸含量均大幅增加，這可能是因?yàn)榇姿峋龠M(jìn)了醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酸類。醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蘋果醋的乙醇體積分?jǐn)?shù)十分接近，實(shí)驗(yàn)組的總酸含量比對(duì)照組高。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)和總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間變化情況Fig.1 Changes in ethanol and total acid contents during apple vinegar fermentation

2.2 T. delbrueckii S1菌株對(duì)蘋果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)合成的影響

以S.cerevisiae參與酒精發(fā)酵為對(duì)照組，T.delbrueckiiS1與S.cerevisiae混合發(fā)酵為實(shí)驗(yàn)組，再分別接種醋酸菌進(jìn)行蘋果醋醋酸發(fā)酵。通過(guò)HS-SPME-GC-MS法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蘋果醋發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，分別鑒定出46 種和50 種主要揮發(fā)性物質(zhì)，包括17 種醇、17 種酯、5 種醛、1 種酮、5 種酸、4 種酚和6 種其他物質(zhì)。風(fēng)味Heatmap圖可以直觀反映蘋果醋發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化和差異。如圖2所示，蘋果醋酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)照組中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量多于實(shí)驗(yàn)組。2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、乙酸、癸酸和月桂酸乙酯為對(duì)照組的獨(dú)有物質(zhì)；乙酸苯乙酯、正己醇、3-乙氧基丙醇、己酸和異丁酸乙酯則僅在實(shí)驗(yàn)組中檢出。

圖2 蘋果醋酒精發(fā)酵結(jié)束揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類熱圖Fig.2 Clustering heatmap of volatile aroma components in apple vinegar at the end of alcoholic fermentation

分別對(duì)兩組蘋果醋醋酸發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性代謝物進(jìn)行聚類，如圖3所示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均可分為兩個(gè)階段，但兩者的階段性差異不大。說(shuō)明T.delbrueckiiS1對(duì)蘋果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)合成的階段性無(wú)明顯影響。

隨著蘋果醋醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，兩組蘋果醋中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量總體上均逐漸增加。其中，2,3-丁二醇、乙醛、苯乙醇、異丁醇、3-羥基-2-丁酮等物質(zhì)在醋酸發(fā)酵初期的含量較高，隨著發(fā)酵的進(jìn)行迅速減少再緩慢增加至發(fā)酵結(jié)束。這是由于醇類、醛類和酮類等物質(zhì)常作為合成酸類、酯類和其他化合物的前體物質(zhì)，例如苯乙醇含量的減少可能是在乙酸存在的條件下，苯乙醇與乙酸合成了乙酸苯乙酯[16]。醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)，丙酸苯乙酯和N,N-二甲基丙酰胺僅在實(shí)驗(yàn)組中檢出，辛酸、癸酸、辛酸乙酯和月桂酸乙酯等僅存在于對(duì)照組中。辛酸乙酯呈白蘭地酒香味，月桂酸乙酯帶有月桂油香氣；丙酸苯乙酯呈似香甜紅玫瑰香氣并帶有水果底香及似濃厚的甜的蜂蜜和草莓風(fēng)味。結(jié)果表明，T.delbrueckiiS1菌株參與發(fā)酵對(duì)蘋果醋水果樣揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的合成具有重要作用。

2.3 T. delbrueckii S1強(qiáng)化對(duì)差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

T.delbrueckiiS1菌株強(qiáng)化前后蘋果醋中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類的差異見(jiàn)圖4a。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為41 種，對(duì)照組的獨(dú)有揮發(fā)性物質(zhì)（9 種）多于實(shí)驗(yàn)組（5 種）。這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類具有明顯差異，而差異代謝物主要集中在對(duì)照組。另外，兩組蘋果醋醋酸發(fā)酵階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成差異見(jiàn)圖4b。醋酸發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，兩組樣品聚集在一起；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩組樣品呈明顯的分離趨勢(shì)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣品分布分別趨向于第1象限和第2象限；至醋酸發(fā)酵第22天，兩組樣品徹底分開(kāi)。這說(shuō)明醋酸發(fā)酵前中期兩組蘋果醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成相似，隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，其揮發(fā)性物質(zhì)組成逐漸呈現(xiàn)出明顯的差異。通過(guò)排列檢驗(yàn)對(duì)200 個(gè)排列的響應(yīng)驗(yàn)證了OPLSDA模型的正確性，如圖4c所示，所有R2和Q2值均低于原始值，藍(lán)色回歸線與垂直軸的交點(diǎn)小于零[17]。

圖4 蘋果醋醋酸發(fā)酵階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Venn圖（a）、OPLS-DA（b）、排列測(cè)試圖（c）及基于OPLS-DA的VIP值（d）Fig.4 Venn diagram (a),OPLS-DA plot (b),permutation test plot (c) and VIP values from OPLS-DA model (d) of volatile flavor substances during the acetic acid fermentation stage of apple vinegar

通過(guò)計(jì)算基于OPLS-DA的VIP值，明確了兩組蘋果醋的21 種差異代謝物（VIP＞1，P＜0.05），如圖4d所示。3-乙氧基丙醇、苯甲醇、癸酸、乙酸苯乙酯、正辛酸、苯甲醛、正丙醇、月桂酸乙酯、苯乙醇、2,3-丁二醇、己酸、正己酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、正丁醇、2,4-二叔丁基苯酚、辛酸乙酯、異丁醇、丙酸苯乙酯、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)和癸酸乙酯是兩組蘋果醋的差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其中，3-乙氧基丙醇、乙酸苯乙酯、2,3-丁二醇、苯乙醇、丙酸苯乙酯、苯甲醇和苯甲醛在實(shí)驗(yàn)組中的含量更高，對(duì)實(shí)驗(yàn)組蘋果醋的特征風(fēng)味具有重要影響。乙酸苯乙酯帶有似蘋果樣果香、玫瑰花香及蜂蜜樣底香[18]；苯甲醇賦予發(fā)酵產(chǎn)品花香和果香[19]；苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅(jiān)果香[19]。苯乙醇是在厭氧過(guò)程中通過(guò)酵母的代謝反應(yīng)由L-苯丙氨酸衍生而來(lái)[20]，其帶有柔和、愉快且持久的玫瑰香氣及微苦后甜的桃子味[21]并有助于醋味的形成[22-23]。同時(shí)，造成對(duì)照組蘋果醋風(fēng)味區(qū)別于實(shí)驗(yàn)組的揮發(fā)性物質(zhì)包括癸酸、正辛酸、正丙醇、己酸、正己酸乙酯、月桂酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、辛酸乙酯、異丁醇、正丁醇、癸酸乙酯及多種酚類物質(zhì)。正丙醇具有令人愉悅的甜味[20]，正己酸乙酯帶水果香，癸酸乙酯具有似玫瑰香、微弱果香及明顯的脂肪臭味[24]?？梢?jiàn)T.delbrueckiiS1強(qiáng)化發(fā)酵有助于增強(qiáng)蘋果醋的典型性蘋果香和花香。

2.4 T. delbrueckii S1對(duì)蘋果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響

基于共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分別構(gòu)建對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組揮發(fā)性物質(zhì)網(wǎng)絡(luò)以認(rèn)識(shí)T.delbrueckiiS1對(duì)蘋果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)伴生關(guān)系的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)模型的拓?fù)湎禂?shù)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)共有30 個(gè)節(jié)點(diǎn)和130 條邊，模塊化為0.173；實(shí)驗(yàn)組共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)共有25 個(gè)節(jié)點(diǎn)和154 條邊，模塊化為0.033。實(shí)驗(yàn)組網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)數(shù)目較對(duì)照組少，邊數(shù)卻明顯比對(duì)照組多，這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組揮發(fā)性物質(zhì)之間的聯(lián)系更強(qiáng)、更復(fù)雜。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的模塊化是指網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)構(gòu)成內(nèi)部聯(lián)系較強(qiáng)，而與外部聯(lián)系較弱的部分，模塊化越低說(shuō)明物質(zhì)之間相互作用的傳遞性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組的模塊化系數(shù)（0.033）低于對(duì)照組（0.173），這可能是由于內(nèi)生菌T.delbrueckiiS1產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與S.cerevisiae及醋酸菌產(chǎn)生的物質(zhì)間的相互作用導(dǎo)致。結(jié)果表明，T.delbrueckiiS1強(qiáng)化增加了揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性。

為進(jìn)一步研究共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的作用及貢獻(xiàn)，計(jì)算了網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的拓?fù)湫再|(zhì)，見(jiàn)表1。節(jié)點(diǎn)的中心性是指經(jīng)過(guò)該節(jié)點(diǎn)的最短路徑數(shù)量，介數(shù)中心性的提出為衡量節(jié)點(diǎn)中心性提供了標(biāo)準(zhǔn)[25]。正辛酸、苯酚、琥珀酸二乙酯、苯乙醇和苯乙酸乙酯等在對(duì)照組中的介數(shù)中心性較高，而正丁醇和乙醛在實(shí)驗(yàn)組中較高。節(jié)點(diǎn)的介數(shù)中心性越大，該節(jié)點(diǎn)在保持整個(gè)網(wǎng)絡(luò)緊密連接中的作用越重要?？梢?jiàn)，正辛酸、苯酚等物質(zhì)在對(duì)照組揮發(fā)性物質(zhì)相互作用的傳遞及網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性方面起重要作用。在實(shí)驗(yàn)組中，乙醛與乙酸苯乙酯、苯乙醇等屬于一個(gè)模塊，正丁醇與乙酸等屬于同一模塊，這說(shuō)明乙醛和正丁醇對(duì)實(shí)驗(yàn)組特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要作用。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的重要節(jié)點(diǎn)明顯不同，這可能也是兩組蘋果醋風(fēng)味顯著不同的原因。

2.5 T. delbrueckii S1強(qiáng)化對(duì)蘋果醋有機(jī)酸合成的影響

采用HPLC法測(cè)定了7 種有機(jī)酸，分別為L(zhǎng)-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸和草酸。以色譜峰面積對(duì)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果表明7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合系數(shù)均在0.9997～0.9999之間，說(shuō)明該方法可以對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。兩種蘋果醋共檢測(cè)出5 種有機(jī)酸，如圖6所示，對(duì)照組中L-蘋果酸含量隨發(fā)酵進(jìn)行先迅速減少然后趨于平穩(wěn)，實(shí)驗(yàn)組中L-蘋果酸則呈不斷增加的趨勢(shì)；發(fā)酵結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組中L-蘋果酸含量顯著高于對(duì)照組。L-蘋果酸是生物體代謝過(guò)程中的重要有機(jī)酸，其在線粒體產(chǎn)生能量物質(zhì)ATP的過(guò)程中起重要作用。研究表明，L-蘋果酸可以縮小心肌梗死面積，抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而部分保留動(dòng)物心臟功能并增加心肌損傷后的抗氧化活性[26]。兩組蘋果醋中L-乳酸含量的變化與L-蘋果酸相反；發(fā)酵結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中L-乳酸的含量顯著高于對(duì)照組。Kobayashi等[27]發(fā)現(xiàn)L-乳酸在糖尿病海馬功能障礙中具有重要作用，即側(cè)腦室注射L-乳酸可減輕糖尿病小鼠的認(rèn)知功能障礙。在整個(gè)醋酸發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)照組中的琥珀酸含量幾乎均高于實(shí)驗(yàn)組；發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)照組中琥珀酸的含量顯著高于實(shí)驗(yàn)組。已有報(bào)道顯示，與S.cerevisiae相比，非釀酒酵母產(chǎn)生琥珀酸的能力更弱[28]；而B(niǎo)enito[29]通過(guò)研究也發(fā)現(xiàn)，T.delbrueckii比S.cerevisiae更利于產(chǎn)生琥珀酸，但這都是基于單一菌種發(fā)酵而言。當(dāng)T.delbrueckiiS1菌株強(qiáng)化發(fā)酵時(shí)則可能因其與S.cerevisiae及醋酸菌的相互作用而降低產(chǎn)琥珀酸的能力；另一方面，琥珀酸是由丙酮酸通過(guò)蘋果酸、富馬酸和一些氨基酸的分解形成的代謝物，它很容易與其他分子反應(yīng)形成酯[30]。特別地，實(shí)驗(yàn)組中乙酸含量顯著高于對(duì)照組，乙酸是醋酸風(fēng)味的主要來(lái)源，在一定范圍內(nèi)乙酸含量越高，醋的特性越明顯；乙酸通過(guò)激活MAPK途徑可誘導(dǎo)血糖降低[31-32]。在整個(gè)醋酸發(fā)酵過(guò)程中，兩組蘋果醋中L-蘋果酸、L-乳酸、琥珀酸和乙酸的含量幾乎均呈現(xiàn)出顯著差異；而檸檬酸隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸減少且未呈現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組中較多的L-蘋果酸可調(diào)和乙酸的酸味和刺激性，提高蘋果醋酸味的平和性[22]。

圖6 蘋果醋醋酸發(fā)酵階段有機(jī)酸箱線圖Fig.6 Box plot of organic acids during acetic acid fermentation of apple vinegar

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS及HPLC技術(shù)分別測(cè)定蘋果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和有機(jī)酸，分析蘋果內(nèi)生菌T.delbrueckiiS1對(duì)蘋果醋風(fēng)味品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，兩組蘋果醋的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在種類和含量上均有差異，而蘋果內(nèi)生菌T.delbrueckiiS1對(duì)其合成的階段性無(wú)明顯影響。Venn圖結(jié)果表明，對(duì)照組的獨(dú)有揮發(fā)性物質(zhì)比實(shí)驗(yàn)組多，即差異代謝物多集中在對(duì)照組?；贠PLSDA的VIP值（P＜0.05，VIP＞1）進(jìn)一步篩選到苯甲醇、癸酸、乙酸苯乙酯、正辛酸、苯甲醛、月桂酸乙酯、苯乙醇、正丙醇、己酸、正己酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、辛酸乙酯、丙酸苯乙酯和癸酸乙酯等21種香氣物質(zhì)在兩組蘋果醋中的含量差異達(dá)到顯著水平。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)組中更加突出的乙酸苯乙酯、苯乙醇、苯甲醛、苯甲醇等具有典型性蘋果香等果香和花香；在對(duì)照組中較為突出的辛酸乙酯、己酸乙酯和月桂酸乙酯等具酒香、果香及精油香氣?；诠铂F(xiàn)網(wǎng)絡(luò)對(duì)兩組蘋果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)網(wǎng)絡(luò)及揮發(fā)性物質(zhì)之間的伴生關(guān)系和相互作用進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)T.delbrueckiiS1強(qiáng)化發(fā)酵會(huì)增加揮發(fā)性代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系和復(fù)雜性，并且揮發(fā)性代謝物之間的相互作用導(dǎo)致其伴生關(guān)系發(fā)生變化。另外，箱線圖表明實(shí)驗(yàn)組中L-蘋果酸、L-乳酸和乙酸含量顯著高于對(duì)照組。本研究探討了蘋果內(nèi)生菌T.delbrueckiiS1對(duì)蘋果醋風(fēng)味物質(zhì)合成的影響，T.delbrueckiiS1與S.cerevisiae之間的底物競(jìng)爭(zhēng)、細(xì)胞接觸機(jī)制及香氣化合物間的協(xié)同作用對(duì)風(fēng)味物質(zhì)合成的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。