不同分子質(zhì)量透明質(zhì)酸對(duì)酸乳品質(zhì)的影響

周海棟，唐善虎，李思寧，廖彬旭，馬 源，駱卓伶，王健翔，潘 坤，陳寒霜露

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

透明質(zhì)酸又名玻尿酸（hyaluronic acid，HA），是一種高分子聚合物，由單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成。HA可以分為寡聚HA（分子質(zhì)量＜10 kDa）、低分子質(zhì)量HA（分子質(zhì)量10～250 kDa）、中等分子質(zhì)量HA（分子質(zhì)量250～1000 kDa）和高分子質(zhì)量HA（分子質(zhì)量≥1000 kDa）[1]。HA天然存在于所有生物體中，具有超強(qiáng)的保水能力，能夠與自身質(zhì)量1000 倍的水結(jié)合[2]；在皮膚、結(jié)締組織、關(guān)節(jié)滑膜液、眼睛玻璃體中發(fā)揮細(xì)胞維持、保水、營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)戎匾砉δ躘3]；也可以參與傷口愈合、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)等多個(gè)生物過程[4]。

我國于2021年允許HA添加到乳制品中使用（推薦食用量≤200 mg/d）[5]，國外已有少量HA在食品中應(yīng)用的研究報(bào)道。Zhong Weigang等[6]報(bào)道乳清分離蛋白與HA相互作用時(shí)α-螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著變化；Whan等[7]報(bào)道含HA的開菲爾感官性能優(yōu)于對(duì)照組；Zaj?c等[8]研究發(fā)現(xiàn)添加0.05 g/kg和0.1 g/kg的HA會(huì)導(dǎo)致煙熏香腸的水分外流，從而降低穩(wěn)定性；Sutariya等[9]研究HA對(duì)牛奶流變學(xué)、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和凝乳酶凝膠特性等性質(zhì)的影響。同時(shí)，多項(xiàng)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)以及患者雙盲實(shí)驗(yàn)證明，口服HA在維持皮膚健康、修復(fù)關(guān)節(jié)損傷、調(diào)節(jié)腸道免疫、緩解干眼等方面具有重要作用，可見其安全性較高[10]。

酸乳是人體補(bǔ)充益生菌的最佳載體，可以提高各種營養(yǎng)素的利用率，減少乳糖消化問題[11]；也是目前全世界發(fā)展最快的乳制品品類。隨著社會(huì)對(duì)“美”的追求，全球大多數(shù)消費(fèi)者更傾向于選擇具有美容養(yǎng)顏等功能性的產(chǎn)品。相比注射用HA，口服HA價(jià)格便宜的同時(shí)還可以帶來一定的口欲滿足感，可見HA酸乳消費(fèi)市場的巨大。但是關(guān)于HA在食品中尤其是在發(fā)酵乳制品中的研究較少，需要作進(jìn)一步的深入研究。本研究探討發(fā)酵乳制備過程添加不同分子質(zhì)量HA至鮮牛乳中對(duì)發(fā)酵乳物理化學(xué)性質(zhì)和品質(zhì)影響及變化規(guī)律。旨在探明HA在發(fā)酵乳加工過程中的作用和影響機(jī)制，從而有利于HA利用價(jià)值的挖掘和提高酸乳的品質(zhì)和銷售量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級(jí)高（1280 kDa）、中（350 kDa）、低（180 kDa）分子質(zhì)量HA 華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司；24 h巴氏鮮牛乳 四川新希望乳業(yè)有限公司；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckillsubsp.bulgaricus）混合菌種 河北一然生物科技有限公司；MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基 杭州微生物制劑有限公司。

NaOH、酚酞、乙醇、NaCl（均為分析純）成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PL303分析天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；pH-Star儀 德國Matthaus公司；DISCOVERY HR-1旋轉(zhuǎn)流變儀 美國TA儀器；BCD221TMBA冷凍冰箱 青島海爾股份有限公司；TA-TX Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；TRACE DSQ II型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀美國Thermo公司；MLS-3020高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司；LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀 德國LUM公司。

1.3 方法

1.3.1 HA酸乳的制備

酸乳發(fā)酵工藝流程：原料乳預(yù)處理→接種發(fā)酵菌→加入HA→罐裝→攪拌→發(fā)酵→后熟。

本實(shí)驗(yàn)共分10 組，低（180 k D a）、中（350 kDa）、高（1250 kDa）分子質(zhì)量HA分別添加0.006%、0.012%、0.018%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），用于酸乳制備，并設(shè)空白對(duì)照組。以巴氏鮮牛乳為原料，采用1∶1比例混合菌種，0.1%接種量，在42 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3.5 h后，置于4 ℃冰箱后熟24 h，取出后測定指標(biāo)。

1.3.2 活菌數(shù)的檢測

參考劉文俊[12]的方法并稍加修改。稱取5 g酸乳樣品，與45 mL 0.9 g/100 mL生理鹽水混合于無菌均質(zhì)袋中，用無菌均質(zhì)機(jī)進(jìn)行拍打至混合均勻，吸取1 mL混合樣品進(jìn)行梯度稀釋，每一梯度稀釋倍數(shù)均為10 倍；選取10-7進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，吸取1 mL至培養(yǎng)皿中，再加入15～20 mL選擇培養(yǎng)基；培養(yǎng)基凝固后倒置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中嗜熱鏈球菌為MC培養(yǎng)基，保加利亞乳桿菌為MRS培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后，對(duì)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，選擇30～300的菌落數(shù)，分別計(jì)算嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)，單位為CFU/mL。

1.3.3 pH值的測定

酸乳成熟后，采用便攜式pH計(jì)測定酸乳pH值[13]。

1.3.4 酸度的檢測

參照Wang Liang等[14]的方法并稍加修改。取發(fā)酵乳樣品5.0 g，加入5 mL蒸餾水，混合均勻，加入2 滴0.5%酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至淡粉色，1 min內(nèi)不褪色，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，根據(jù)所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積計(jì)算滴定酸度，單位為°T。

1.3.5 持水力的測定

參考Khorshidi等[15]的方法，首先稱量空離心管的質(zhì)量記為m0/g；每個(gè)離心管中稱取10 g左右酸乳，并稱量總質(zhì)量為m1/g；樣品4 ℃、5000 r/min離心30 min，棄上清液后倒置10 min，再稱量總質(zhì)量m/g，持水力按下式計(jì)算：

1.3.6 質(zhì)構(gòu)特性的測定

參照陳一萌等[16]的方法，對(duì)發(fā)酵容器中的酸乳樣品使用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，采用TPA模式分別測定攪拌型酸乳及凝固型酸乳的質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)。測定參數(shù)：測前速率5.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s，測后速率10 mm/s，下壓距離15 mm，負(fù)載類型Auto-10 g，探頭：A/BE-d 40探頭（壓盤直徑40 mm）。

1.3.7 流變學(xué)特性檢測

參照付雪俠等[17]的方法并稍加修改。采用旋轉(zhuǎn)流變儀測定酸乳的流變特性，測定參數(shù)設(shè)置為：測試溫度（25±0.5）℃，保持30 s，頻率掃描在25 ℃環(huán)境下，流變儀掃描應(yīng)變固定為0.1%，頻率范圍0.1～100 rad/s；剪切掃描在25 ℃環(huán)境下，剪切速率范圍1.0～100.0 s-1。

1.3.8 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

參照任然[18]的方法，稍作修改。取酸乳樣品5 mL裝入頂空進(jìn)樣瓶內(nèi)，加入2 g氯化鈉，加蓋密封，樣品預(yù)孵化10 min后用萃取頭吸附30 min，220 ℃解吸3 min，進(jìn)行GC-MS分析。

色譜條件：TR -FFAP色譜柱（30 m ×0.25 m m，025 μ m），載氣99.999%氦氣，流速1.0 mL/min，不分流模式，進(jìn)樣口溫度230 ℃。升溫程序：起始溫度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升到140 ℃，并持續(xù)3 min，再以7 ℃/min升到220 ℃，并保持3 min，解吸時(shí)間2 min。質(zhì)譜條件：電子電離源，70 eV；離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍為33～450 u。

1.3.9 穩(wěn)定性分析

參照趙麗麗[19]的方法并稍加修改。吸取0.5 mL酸乳置于2 mm PC管中，光源波長865 nm，譜線條數(shù)為255 條，時(shí)間間隔為每10 s掃描1 次，轉(zhuǎn)速2500 r/min，溫度25 ℃進(jìn)行檢測。

1.3.10 感官評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)10 位食品專業(yè)人員品嘗，從產(chǎn)品的色澤、口感、風(fēng)味、組織狀態(tài)和雜質(zhì)5 方面進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[20]見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 HA對(duì)酸乳菌落總數(shù)的影響

如圖1A所示，相比空白對(duì)照組，低分子質(zhì)量HA（350 kDa）和高分子質(zhì)量HA（1280 kDa）的添加能夠顯著增加酸乳中保加利亞乳桿菌的數(shù)量（P＜0.05）；添加0.006%和0.012%的中分子質(zhì)量HA（350 kDa）顯著減少了酸乳中保加利亞乳桿菌數(shù)量（P＜0.05）；且在相同HA添加量下，中分子質(zhì)量HA抑制保加利亞乳桿菌的繁殖能力比低分子質(zhì)量HA和高分子質(zhì)量HA更強(qiáng)（P＜0.05）。如圖1B所示，相比空白對(duì)照組，在HA分子質(zhì)量相同時(shí)，添加0.006%低分子質(zhì)量HA可以顯著抑制嗜熱鏈球菌的生長繁殖（P＜0.05），添加0.006%和0.012%的中分子質(zhì)量HA可以顯著抑制嗜熱鏈球菌的生長繁殖，而添加0.006%和0.012%的高分子質(zhì)量HA后嗜熱鏈球菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；其余組未見顯著影響（P＞0.05）；在同等添加量下，高分子質(zhì)量HA酸乳中嗜熱鏈球菌的數(shù)量顯著高于低分子質(zhì)量HA和中分子質(zhì)量HA（P＜0.05）?？梢?，在酸乳發(fā)酵過程中，HA對(duì)酸乳發(fā)酵菌的影響因其分子質(zhì)量和添加量的不同而不同，其中，中分子質(zhì)量HA的抑菌效果更為明顯。這可能是因?yàn)槭葻徭溓蚓捅＜永麃喨闂U菌會(huì)合成HA酶，將HA降解為多糖，為自身的生長繁殖提供營養(yǎng)[21]；其中高分子質(zhì)量HA結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定[22]，只有少量HA被降解利用，表現(xiàn)為促進(jìn)兩種發(fā)酵菌的生長繁殖；而低分子質(zhì)量HA則被嗜熱鏈球菌合成的HA酶降解，并在生長繁殖過程中產(chǎn)生大量有機(jī)酸和酚類物質(zhì)，從而抑制自身的生長繁殖。

2.2 HA對(duì)酸乳pH值的影響

pH值可以評(píng)價(jià)酸乳發(fā)酵菌產(chǎn)酸水平，酸乳中的發(fā)酵菌會(huì)將乳糖分解為大量的乳酸和一些有機(jī)酸，導(dǎo)致酸乳pH值下降[23]。如圖2所示，相比空白對(duì)照組，低分子質(zhì)量HA和高分子質(zhì)量HA對(duì)酸乳pH值的影響不顯著（P＞0.05），而中分子質(zhì)量HA的3 種添加量均使酸乳pH值顯著升高（P＜0.05）；在HA添加量相同的情況下，中分子質(zhì)量HA酸乳樣品的pH值顯著高于低分子質(zhì)量HA或高分子質(zhì)量HA酸乳樣品（P＜0.05）。這是因?yàn)镠A會(huì)被發(fā)酵菌產(chǎn)生的HA酶裂解并吸收，因不同分子質(zhì)量HA結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的不同[32]，在發(fā)酵菌生長過程中產(chǎn)生不同量的有機(jī)酸，導(dǎo)致發(fā)酵乳pH值發(fā)生變化，這與趙巖巖等[24]報(bào)道結(jié)果類似。

圖2 HA對(duì)酸乳pH值的影響Fig.2 Effect of HA on the pH of yogurt

2.3 HA對(duì)酸乳可滴定酸度的影響

如圖3所示，相比空白對(duì)照組，添加0.012%的低分子質(zhì)量和高分子質(zhì)量HA可以顯著提高酸乳樣品的滴定酸度（P＜0.05），而添加0.006%的中分子質(zhì)量HA會(huì)顯著降低酸乳樣品的滴定酸度（P＜0.05），其余各組變化均不顯著（P＞0.05）；在HA添加量相同時(shí)，低分子質(zhì)量HA和高分子質(zhì)量HA酸乳樣品的滴定酸度顯著高于中分子質(zhì)量HA（P＜0.05），這與酸乳pH值的變化吻合。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是中分子質(zhì)量HA在發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)生大量的酸類物質(zhì)，抑制了保加利亞乳桿菌的生長繁殖，導(dǎo)致發(fā)酵乳滴定酸度降低；而低分子質(zhì)量HA和高分子質(zhì)量HA則在酸乳發(fā)酵過程中促進(jìn)了保加利亞乳桿菌的生長繁殖，保加利亞乳桿菌是酸乳酸化過程中主要的產(chǎn)酸菌[25]，在酸化時(shí)造成酸乳的滴定酸度增加。

圖3 HA對(duì)酸乳可滴定酸度的影響Fig.3 Effect of HA on titratable acidity of yogurt

2.4 HA對(duì)酸乳持水力的影響

持水力可以從側(cè)面反映發(fā)酵乳的質(zhì)地[26]。如圖4所示，相比空白對(duì)照組，在發(fā)酵時(shí)加入HA能夠顯著提高酸乳持水力（P＜0.05）；在同等添加量下，中分子質(zhì)量HA和高分子質(zhì)量HA對(duì)酸乳持水力的提升顯著高于低分子質(zhì)量HA（P＜0.05）。在酸乳中加入HA后，持水性明顯增強(qiáng)，主要原因可能是HA具有優(yōu)越的結(jié)合水能力，使酸乳的組織狀態(tài)得到優(yōu)化和改良[27]；同時(shí)，HA的加入可能會(huì)加強(qiáng)酸乳中酪蛋白凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)[28]，從而使酸乳持水力增大。

圖4 HA對(duì)酸乳持水力的影響Fig.4 Effect of HA on water holding capacity of yogurt

2.5 HA對(duì)酸乳質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)是客觀評(píng)價(jià)酸乳物理特性和感官質(zhì)量的重要指標(biāo)[29]。HA由于羧酸基團(tuán)帶有天然的負(fù)電荷，能夠結(jié)合大量水分子，在水溶液中混合時(shí)會(huì)形成高黏性凝膠[30]，從而影響酸乳質(zhì)構(gòu)。分別對(duì)凝固型和攪拌型酸乳進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。對(duì)于攪拌型酸乳（表2），在發(fā)酵時(shí)加入HA后，添加0.006%低分子質(zhì)量HA酸乳的硬度、黏稠度、黏聚力（絕對(duì)值，下同）、黏性指數(shù)（絕對(duì)值，下同）均較空白對(duì)照組高，其他組別均接近或低于空白對(duì)照組；其中，中分子質(zhì)量HA對(duì)酸乳質(zhì)構(gòu)的影響程度大于另外兩種分子質(zhì)量，且各質(zhì)構(gòu)指標(biāo)數(shù)值整體隨著添加量的增加而增大；而低分子質(zhì)量HA和高分子質(zhì)量HA酸乳樣品的各項(xiàng)質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)會(huì)隨著添加量的增加逐漸降低。對(duì)于凝固型酸乳（表2），在發(fā)酵時(shí)加入HA后，除0.018%低分子質(zhì)量酸乳的黏性指數(shù)外，其余質(zhì)構(gòu)指標(biāo)數(shù)值均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05）；且中分子質(zhì)量HA對(duì)發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的影響幅度比其他兩種分子質(zhì)量更大，這與攪拌型酸乳的數(shù)據(jù)變化一致。上述差異表明HA的加入可以降低酸乳的彈性，增加酸乳的爽滑性以及細(xì)膩度[31]；且降低程度與HA的分子質(zhì)量以及添加量相關(guān)。酸乳添加HA后發(fā)生這種變化的原因可能是HA作為多糖，其分子具有較強(qiáng)的親水性，可以吸收大量水分，提高蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的剛性[32]。另有研究認(rèn)為酸乳的質(zhì)地取決于酪蛋白膠束之間的相互作用[33]，在酸乳發(fā)酵時(shí)加入HA，HA帶有負(fù)電荷的羧酸基團(tuán)會(huì)與酸乳中的酪蛋白混合形成凝膠，改變凝膠網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，抑制酪蛋白簇的進(jìn)一步聚集，從而降低凝膠結(jié)構(gòu)的完整性，降低酸乳的硬度和黏稠度等[33]。

2.6 HA對(duì)酸乳流變學(xué)特征的影響

2.6.1 HA對(duì)酸乳彈性模量和黏性模量的影響

彈性模量（G’）代表樣品形變能力的大小，黏性模量（G”）一定程度反映了樣品的黏性。如圖5所示，添加量為0.006%和0.018%的中分子質(zhì)量HA酸乳樣品G”低于G’，說明樣品中黏性成分占主導(dǎo)地位，樣品具有更好的流動(dòng)性；其余組的G’均大于G”，樣品呈類固體的特征。添加高分子質(zhì)量HA的酸乳樣品G’高于空白對(duì)照組；添加量為0.012%的中分子質(zhì)量HA酸乳樣品的G’接近空白對(duì)照組，另外兩種添加量低于空白對(duì)照組；而低分子質(zhì)量HA的酸乳樣品隨著角頻率的增大，其G’逐漸超過空白對(duì)照組。如圖5B所示，隨著角頻率的增大，除添加0.006%中分子質(zhì)量HA的上升趨勢略快外，其余所有的酸乳樣品的G”都具有相似的變化趨勢，其中添加量為0.006%的中分子質(zhì)量HA酸乳和0.018%的高分子質(zhì)量HA酸乳的G”高于空白對(duì)照組，其余HA酸乳樣品的G”均低于空白對(duì)照組；中分子質(zhì)量HA隨著添加量的增大其G”逐漸降低，當(dāng)添加量為0.018%時(shí)G”最低，與質(zhì)構(gòu)測試中黏稠度的變化趨勢相反，這可能是因?yàn)橹蟹肿淤|(zhì)量HA在加入鮮牛乳后形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在于發(fā)酵乳凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙中[34]，從而表現(xiàn)出更高的黏稠度；而G”逐漸降低，可能是因?yàn)樾D(zhuǎn)流變儀在測量時(shí)產(chǎn)生的剪切力破環(huán)了二者的結(jié)合，導(dǎo)致G”隨HA添加量的增大而逐漸降低[35]。

2.6.2 HA對(duì)酸乳表觀黏度的影響

如圖6所示，所有酸乳樣品均表現(xiàn)出剪切稀化的行為，這與Yang Tongxiang等[36]的研究結(jié)果一致，出現(xiàn)這種假塑性現(xiàn)象是由于蛋白質(zhì)聚集體之間的鍵斷裂[37]。在同一剪切速率下，高分子質(zhì)量HA酸乳的表觀黏度高于空白對(duì)照組，當(dāng)剪切速率為0.1 s-1時(shí)，添加0.018%的高分子質(zhì)量HA酸乳樣品表觀黏度最高，低分子質(zhì)量HA和中分子質(zhì)量HA接近或低于空白對(duì)照組，其中添加0.006%中分子質(zhì)量HA酸乳樣品的表觀黏度最低?？梢?，添加高分子質(zhì)量HA可以使酸乳的表觀黏度維持在較高水平，從而提高酸乳穩(wěn)定性[38]；而低分子質(zhì)量HA和中分子質(zhì)量HA則會(huì)降低酸乳穩(wěn)定性。出現(xiàn)這種變化的原因可能是低分子質(zhì)量HA和中分子質(zhì)量HA抑制了酸乳中連續(xù)蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成[39]，導(dǎo)致酸乳的硬度降低；而高分子質(zhì)量HA則會(huì)使酸乳結(jié)構(gòu)更加均勻，表觀黏度增加[40]。

圖6 HA對(duì)酸乳表觀黏度的影響Fig.6 Effect of HA on the apparent viscosity of yogurt

2.6.3 HA對(duì)酸乳剪切應(yīng)力的影響

如圖7所示，隨著剪切速率的增加，剪切應(yīng)力上升趨勢減緩，這一現(xiàn)象表明10 組酸乳樣品均為典型的非牛頓流體[41]。添加HA的酸乳樣品剪切應(yīng)力各不相同。相比之下，高分子質(zhì)量HA酸乳樣品的剪切應(yīng)力高于空白對(duì)照組，低分子質(zhì)量HA酸乳樣品的剪切應(yīng)力趨近于空白對(duì)照組，而中分子質(zhì)量HA酸乳樣品的剪切應(yīng)力最低。結(jié)合pH值的變化趨勢，出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)樵诃h(huán)境pH值的影響下乳清蛋白分離物與HA相互作用產(chǎn)生了α-螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分子內(nèi)可溶性絡(luò)合物的數(shù)量不同，從而使酸乳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[6]。

圖7 HA對(duì)酸乳剪切應(yīng)力的影響Fig.7 Effect of HA on shear force of yogurt

2.7 HA對(duì)酸乳風(fēng)味物質(zhì)的影響

風(fēng)味物質(zhì)是酸乳的主要品質(zhì)特征。采用頂空固相微萃取-GC-MS對(duì)HA酸乳風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，共檢出103 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行分類（表3）并進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。如圖8、9所示，構(gòu)成HA酸乳的揮發(fā)性物質(zhì)有3 個(gè)PC，PC1主要為酸類、酮類、醇類、烷烴類，PC2為酯類，PC3為醛類，其貢獻(xiàn)率分別為40.043%、20.505%、14.798%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)75.346%，能夠較好地反映酸乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量的變化。

圖8 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的因子載荷分析圖Fig.8 Factor loading analysis of volatile flavor substances

圖9 樣品在不同PC上的得分散點(diǎn)圖Fig.9 Score scatter plot of principal component analysis for yogurt samples

酸乳發(fā)酵中揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生主要受酸類和酯類的影響[42]。所有樣品中均檢出大部分揮發(fā)性成分，添加HA的酸乳樣品中酸類物質(zhì)含量有所增高，其中己酸和辛酸含量最高，這與Papaioannou等[43]的報(bào)道結(jié)果相似；烷烴類、醇類、雜環(huán)類物質(zhì)的含量降低，說明添加HA對(duì)酸乳的風(fēng)味未產(chǎn)生負(fù)面影響，但所有酸乳樣品中都未檢測到被認(rèn)為是酸乳主要成分的乙醛、雙乙酰和乙酰乙素，這可能是因?yàn)槠浜刻俣幢粰z測出[42]，需進(jìn)一步檢測確定。

2.8 HA對(duì)酸乳穩(wěn)定性的影響

Lumisizer穩(wěn)定性分析儀基于Stocks理論及Beer-Lambert定律，利用近紅外光對(duì)樣品實(shí)時(shí)掃描分析乳液的穩(wěn)定性，直接客觀地反映樣品分層、沉降、聚合等狀態(tài)的變化[45]。應(yīng)用Lumisizer穩(wěn)定性分析儀可以快速測定酸乳樣品的穩(wěn)定性。其中澄清指數(shù)、積分透光率和沉降速率越小，說明乳液分離較慢，狀態(tài)更穩(wěn)定[46]。

如表4所示，在發(fā)酵時(shí)加入HA，酸乳的澄清指數(shù)、積分透光率、沉降速率均與HA分子質(zhì)量相關(guān)，不同分子質(zhì)量HA對(duì)酸乳穩(wěn)定性的影響不同。與空白對(duì)照組相比，酸乳在加入低、中分子質(zhì)量HA發(fā)酵后，酸乳的澄清指數(shù)、積分透光率、沉降速率均顯著增大（P＜0.05），即酸乳穩(wěn)定性下降。而高分子質(zhì)量HA的澄清指數(shù)、積分透光率與空白對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），沉降速率接近空白對(duì)照組，這與質(zhì)構(gòu)和流變結(jié)果相似。有研究報(bào)道，HA與蛋白質(zhì)之間的相互作用由靜電相互作用主導(dǎo)[47]；在pH值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，二者之間相互作用程度增大，產(chǎn)生不溶性復(fù)合物[48]。也有研究指出，當(dāng)?shù)鞍缀扛哂诙嗵呛繒r(shí)，會(huì)通過靜電排斥使復(fù)合物發(fā)生凝聚[49]。HA作為一種多糖，由于自身的離子狀態(tài)和分子質(zhì)量的不同，在與發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用時(shí)，對(duì)發(fā)酵乳的穩(wěn)定性產(chǎn)生不同影響。其中低分子質(zhì)量HA對(duì)酸乳凝膠性質(zhì)產(chǎn)生的負(fù)面影響與Sutariya等[9]的研究結(jié)果類似；Albano等[50]研究發(fā)現(xiàn)具有大分子質(zhì)量的多糖會(huì)增加酸乳穩(wěn)定性，該結(jié)果與本研究高分子質(zhì)量HA增強(qiáng)酸乳穩(wěn)定性的結(jié)果類似。

表4 HA對(duì)酸乳穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of HA on the stability of yogurt

2.9 HA對(duì)酸乳感官的影響

如圖10所示，與空白對(duì)照組相比，添加低分子質(zhì)量和中分子質(zhì)量HA可以顯著提高酸乳的口感接受度（P＜0.05），其中添加0.018%中分子質(zhì)量HA酸乳的接受度最高。而添加高分子質(zhì)量HA的酸乳樣品感官評(píng)分顯著低于空白對(duì)照組，原因是添加高分子質(zhì)量HA出現(xiàn)明顯的乳清析出現(xiàn)象，這可能是因?yàn)椴煌肿淤|(zhì)量的HA在加入鮮牛奶時(shí)吸水形成不同的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。但酸乳在發(fā)酵完成時(shí)也會(huì)形成特有的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[51]，與低、中分子質(zhì)量的HA相比，高分子質(zhì)量HA形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)吸水更多，更易被破環(huán)[52]，酸乳發(fā)酵完成后形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會(huì)破環(huán)高分子質(zhì)量HA形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致被HA吸收的水分游離形成乳清析出；也可能是因?yàn)楦叻肿淤|(zhì)量HA增強(qiáng)了酸乳發(fā)酵菌種的生長繁殖，導(dǎo)致產(chǎn)酸加快，蛋白質(zhì)脫水發(fā)生收縮，使得酸乳樣品乳清析出，從而影響產(chǎn)品感官品質(zhì)[53]。

3 結(jié)論

本研究探討了不同HA分子質(zhì)量和添加量對(duì)酸乳pH值、質(zhì)構(gòu)、流變、微生物、穩(wěn)定性和感官評(píng)價(jià)等品質(zhì)的影響。添加HA均能提高酸乳持水力，降低酸乳的彈性，增加酸乳的爽滑性以及細(xì)膩度，同時(shí)改善酸乳風(fēng)味。其中，添加高分子質(zhì)量HA可以提高酸乳的G’和G”，增強(qiáng)穩(wěn)定性、促進(jìn)發(fā)酵菌的生長繁殖，但在發(fā)酵結(jié)束后有明顯的乳清析出；添加中分子質(zhì)量HA會(huì)抑制保加利亞乳桿菌的生長繁殖，降低酸乳酸度，有利于延長貯藏期，同時(shí)，乳液穩(wěn)定性隨著添加量的增大而降低；低分子質(zhì)量HA則會(huì)降低酸乳的穩(wěn)定性。本研究認(rèn)為，HA在改善酸乳品質(zhì)方面有一定作用，HA作為酸乳添加劑有一定的市場前景。