上海地區(qū)9種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盲樣檢測結(jié)果一致性分析

楊 雪 朱 俊 蔣玲麗 王 青 胡曉波

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 100126）

新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）為β屬冠狀病毒，有包膜，形狀為圓形或橢圓形，是單股正鏈RNA病毒。實(shí)驗(yàn)室檢測包括抗原檢測和核酸檢測。核酸檢測具有較高的靈敏度和特異性，是診斷SARS-CoV-2感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。SARS-CoV-2核酸檢測主要針對病毒的OFR1ab基因（編碼RNA聚合酶，可參與病毒核酸復(fù)制）、N基因（編碼核殼蛋白，與病毒基因組宿主RNA相互識別）和E基因（編碼囊膜蛋白，與病毒包膜和病毒顆粒形成有關(guān)）。

SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果的假陽性和假陰性一直備受關(guān)注[1-2]。造成結(jié)果假陽性/假陰性的原因可能是樣本采集、運(yùn)輸過程中的不恰當(dāng)處理，也可能是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部不規(guī)范的操作。循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）是判斷檢測結(jié)果的重要標(biāo)準(zhǔn)。本研究對上海市臨床檢驗(yàn)中心組織的全市SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室4次盲樣檢測結(jié)果進(jìn)行分析，重點(diǎn)分析不同品牌SARSCoV-2核酸檢測試劑檢測結(jié)果Ct值的一致性和不同品牌檢測試劑的檢測性能，旨在及時(shí)掌握上海市SARS-CoV-2核酸檢測質(zhì)量，以確保類似場景下臨床實(shí)驗(yàn)室能夠快速反應(yīng)，且檢測結(jié)果一致、可靠。

1 材料和方法

1.1 盲樣樣品

盲樣樣品為經(jīng)處理的SARS-CoV-2 RNA（含胍鹽）樣本，600 μL/支，每套5支，包括陰性樣品2支和陽性樣品3支。陽性樣品濃度分別為1.00×103拷貝/mL（濃度1）、1.75×103拷貝/mL（濃度2）和3.5×103拷貝/mL（濃度3）；2支陰性樣品為樣本保存液稀釋的體外培養(yǎng)人體細(xì)胞。

1.2 樣品發(fā)放和檢測

每周將盲樣通過冷鏈隨機(jī)發(fā)放至上海市所屬SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室：第1次發(fā)放至230個(gè)實(shí)驗(yàn)室，第2次發(fā)放至233個(gè)實(shí)驗(yàn)室，第3次發(fā)放至234個(gè)實(shí)驗(yàn)室，第4次發(fā)放至230個(gè)實(shí)驗(yàn)室，合計(jì)927套。實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定時(shí)間內(nèi)按要求儲存、復(fù)融、混勻、離心、檢測，并上傳檢測結(jié)果。

1.3 檢測試劑

盲樣共涉及9種SARS-CoV-2核酸檢測試劑，分別編號為A、B、C、D、E、F、G、H、I。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析盲樣檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的一致性，計(jì)算陽性樣品ORF1ab基因和N基因Ct值的x、中位數(shù)（M）、95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）、極差（R）和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），根據(jù)拉依達(dá)準(zhǔn)則（3σ準(zhǔn)則）剔除離群值。由于D和G試劑結(jié)果判讀時(shí)各有10和5個(gè)Ct值不計(jì)數(shù)，因此在結(jié)果比較時(shí)分別加10個(gè)和5個(gè)Ct值進(jìn)行校準(zhǔn)。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)對9種試劑的檢測結(jié)果進(jìn)行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參評實(shí)驗(yàn)室基本情況

參與4次盲樣檢查的實(shí)驗(yàn)室共249個(gè)，其中公立醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室108個(gè)，社會辦醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室6個(gè)，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室132個(gè)，其他類型實(shí)驗(yàn)室3個(gè)。

2.2 9種試劑基本情況

9種試劑均采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）對靶基因進(jìn)行檢測。有2種試劑（C和G）檢測靶基因?yàn)镺RF1ab、N和E基因，其余7種試劑檢測靶基因均為ORF1ab和N基因。9種試劑檢出限為200～500拷貝/mL。見表1。

2.3 參評實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果總體情況

249個(gè)實(shí)驗(yàn)室均檢出3個(gè)陽性盲樣的全部靶基因，檢出率均為100%，2個(gè)陰性盲樣檢測符合率均為100%。3個(gè)陽性盲樣ORF1ab基因檢測Ct值的CV分別為4.32%（濃度1）、4.42%（濃度2）、4.43%（濃度3）；N基因檢測Ct值的CV分別為4.32%（濃度1）、4.46%（濃度2）、4.54%（濃度3）；ORF1ab基因和N基因Ct值的極差（R）值分別為8.15和7.73（濃度1）、8.07和7.71（濃度2）、7.98和7.52（濃度3）。各實(shí)驗(yàn) 室檢測結(jié)果Ct值見圖1。

圖1 3個(gè)濃度陽性盲樣ORF1ab基因和N基因Ct值分布

2.4 9種試劑Ct值波動情況

3個(gè)濃度陽性盲樣9種試劑間ORF1ab基因和N基因Ct值的差異范圍分別為2.58～2.66和2.88～3.06。9種試劑3個(gè)濃度陽性盲樣ORF1ab基因和N基因Ct值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。不同試劑組兩兩比較結(jié)果顯示，D試劑ORF1ab基因和N基因檢測結(jié)果與其他8種試劑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)Bonferroni校正后，D試劑與A、B、C、H、I、F、G試劑比較，ORF1ab基因濃度1、濃度2和濃度3差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），D試劑與A、B、C、E、F、G、H、I試劑比較，N基因濃度1、濃度2和濃度3差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A試劑和H試劑ORF1ab基因檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），A試劑和H試劑與其他8種試劑比較，ORF1ab基因檢測結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)Bonferroni校正后，A試劑與B、C、D、E、F、G、I試劑比較，H試劑與B、C、D、E、G、I試劑比較，ORF1ab基因濃度1、濃度2和濃度3差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。D試劑的ORF1ab基因和N基因檢測結(jié)果Ct值較高，A試劑和H試劑ORF1ab基因檢測結(jié)果Ct值較低。

9種試劑組內(nèi)ORF1ab基因和N基因Ct值極差（R）的差異范圍分別為4.37～7.94和4.11～7.21。A、B、C、E、F和I這6種試劑組內(nèi)實(shí)驗(yàn)室間ORF1ab基因和N基因Ct值的CV均<5%。D試劑組內(nèi)ORF1ab基因檢測結(jié)果極差（R）和CV均較大。見表2、表3。

表2 9種試劑3個(gè)濃度陽性盲樣ORF1ab基因Ct值波動情況

表3 9種試劑3個(gè)濃度陽性盲樣N基因Ct值波動情況

3 討論

2022年3月末，上海地區(qū)新型冠狀病毒肺炎疫情暴發(fā)，上海地區(qū)SARS-CoV-2核酸檢測量與日俱增，屢創(chuàng)新高。為確保實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果正確、可靠，上海市臨床檢驗(yàn)中心通過盲樣方式開展室間質(zhì)量評價(jià)，同時(shí)將檢查頻次從每月1次增加為每周1次。4次SARS-CoV-2盲樣檢查結(jié)果顯示，上海地區(qū)SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室主要使用9種檢測試劑，均采用RT-PCR方法，最低檢出限均能達(dá)到500 拷貝/mL，符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行第二版）》[3]工作要求。2種陰性樣品和3種陽性樣品的盲樣檢測結(jié)果的正確率均為100%，說明實(shí)驗(yàn)室SARS-CoV-2核酸檢測能力可滿足防疫要求。

基于SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果的不同用途（篩查、療效監(jiān)測、出院或出艙判斷），實(shí)驗(yàn)室除按試劑盒說明書要求報(bào)告陽性和陰性結(jié)果外，必要時(shí)還需同時(shí)上報(bào)陽性結(jié)果Ct值。Ct值的高低對應(yīng)不同的病毒載量。有研究結(jié)果顯示，Ct值每增加3，病毒載量降低1個(gè)數(shù)量級，Ct值分別為12和33時(shí)，對應(yīng)的病毒載量分別為2.2×106pfu/mL和15 pfu/mL[4]。本研究中使用了3個(gè)濃度陽性盲樣，每個(gè)濃度盲樣ORF1ab基因和N基因?qū)嶒?yàn)室檢測結(jié)果Ct值的CV均<5%，但R值可達(dá)8。不同實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果Ct值差異大提示應(yīng)先對SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和一致化的管理，再將結(jié)果用于臨床病毒載量的判斷。各濃度盲樣N基因的Ct值均低于ORF1ab基因，與臨床實(shí)際檢測結(jié)果相符，原因可能為SARSCoV-2核酸在轉(zhuǎn)錄時(shí)會形成不同長度的mRNA片段，這些片段中均含有N基因，只有少數(shù)mRNA片段含ORF1ab基因。

本研究結(jié)果顯示，9種試劑同一濃度盲樣檢測結(jié)果Ct值存在一定差異。9種試劑檢測3個(gè)濃度陽性盲樣時(shí)，ORF1ab基因和N基因Ct值的差異范圍分別為2.58～2.66和2.88～3.06。原因可能是不同試劑引物和探針設(shè)計(jì)原理和對靶基因的檢測能力存在一定差異[5]。有研究結(jié)果顯示，核酸檢測試劑盒的批間差異較大，這個(gè)問題應(yīng)引起重視[6-8]。本研究9種試劑說明書中對不精密度的要求是5%，以此為標(biāo)準(zhǔn)，A、B、C、E、F和I這6種試劑組內(nèi)實(shí)驗(yàn)室間ORF1ab基因和N基因Ct值的CV均滿足要求，但不同檢測試劑組內(nèi)ORF1ab基因和N基因Ct值仍存在較大差異，R值差異范圍分別為4.37～7.94和4.11～7.21。原因可能是核酸提取方式、檢測系統(tǒng)的分析性能差異、擴(kuò)增儀器差異、定量閾值限設(shè)置不同[9]。有研究結(jié)果顯示，SARS-Cov-2核酸檢測假陽性結(jié)果主要出現(xiàn)在濃度較低的樣本中[10]。因此，建議實(shí)驗(yàn)室在更換試劑批號時(shí)，對試劑批間差進(jìn)行驗(yàn)證，尤其應(yīng)關(guān)注弱陽性樣本的檢測結(jié)果。

SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性/假陰性時(shí)，除應(yīng)關(guān)注檢驗(yàn)過程中的因素外，還應(yīng)關(guān)注檢驗(yàn)前階段樣本質(zhì)量問題。樣本采集方法、采集部位、采樣管、樣本量、運(yùn)輸時(shí)間、感染后樣本采集時(shí)機(jī)等檢驗(yàn)前環(huán)節(jié)都會影響樣本病毒載量，進(jìn)而影響Ct值[4]。當(dāng)病毒載量較高（Ct值較?。r(shí)，陽性結(jié)果易被檢出。假陰性結(jié)果易出現(xiàn)在樣本病毒載量較低時(shí)，此時(shí)需使用弱陽性樣品來監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室檢測能力。不同SARSCoV-2核酸檢測試劑的效能不同，尤其對弱陽性樣本而言，檢測結(jié)果差異更加明顯[11]。弱陽性樣本濃度一般為試劑檢出限的1.5～3.0倍，本研究中僅濃度1（標(biāo)準(zhǔn)值為1.00×103拷貝/mL）盲樣對檢出限為500、350和300 拷貝/mL的試劑而言滿足要求，這也是9種試劑陽性檢出率較高的原因。為加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室對弱陽性樣本的檢驗(yàn)?zāi)芰?，后期盲樣設(shè)計(jì)中應(yīng)準(zhǔn)備更低濃度的樣品。本研究使用的盲樣未能監(jiān)控到檢驗(yàn)前環(huán)節(jié)，結(jié)果僅能說明實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的檢測能力。

Ct值與SARS-CoV-2病毒載量密切相關(guān)，病毒載量越大，Ct值越低。Ct值為20可提示高傳染性，Ct值為33～35可提示低傳染性[4]。然而，Ct值易受到樣本采集方法、樣本類型、運(yùn)輸介質(zhì)類型、樣本采集到檢測前時(shí)間、樣本采集時(shí)感染情況、不同檢測方法內(nèi)和檢測方法間的差異等因素的影響。本研究結(jié)果顯示，不同檢測試劑Ct值差異較大，因此對檢測結(jié)果陽性且Ct值較高（接近臨界值），或檢測結(jié)果陰性但剛超出試劑說明書判讀標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)使用陰性和弱陽性質(zhì)控品進(jìn)行結(jié)果監(jiān)測；有條件的情況下，建議再次采集樣本以核實(shí)檢測結(jié)果。需要注意的是，此方式僅對避免假陽性結(jié)果有幫助，對判斷感染病程幫助不大（如無癥狀感染、癥狀出現(xiàn)前的感染）[12]。

綜上所述，上海地區(qū)SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室檢測能力均能達(dá)到要求，但不同品牌檢測試劑Ct值實(shí)驗(yàn)室間差異較大，依據(jù)Ct值判讀結(jié)果可能會產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果，應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)室和相關(guān)機(jī)構(gòu)重視。