CRISPR/Cas13系統(tǒng)用于病原體檢測(cè)的研究進(jìn)展

趙亞楠 曹啟新 閆 彥 李曉聰 趙建平 肖偉利

（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

近年來，新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）、埃博拉病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒等各種病原體嚴(yán)重危脅著公共衛(wèi)生安全，快速、有效的病原體檢測(cè)是預(yù)防疾病傳播的重要途徑。然而，目前常用的病原體檢測(cè)方法，如聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、基因芯片、恒溫?cái)U(kuò)增和基因測(cè)序，操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴，無法滿足基層醫(yī)療和貧困地區(qū)的需求。因此，急需開發(fā)一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、快捷、簡(jiǎn)便的新一代檢測(cè)技術(shù)。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein，Cas）是細(xì)菌和古生菌中普遍存在的一段重復(fù)序列，能夠在向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）引導(dǎo)下將Cas蛋白與靶序列結(jié)合，并對(duì)其進(jìn)行特異性切割，從而抵御外源物質(zhì)的入侵[1]。近年來，CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)展迅速，在基因調(diào)控、疾病治療、植物育種等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在DNA基礎(chǔ)上對(duì)靶序列進(jìn)行高效、精準(zhǔn)的編輯，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床治療等領(lǐng)域[2-5]。但CRISPR/Cas9僅能對(duì)DNA進(jìn)行調(diào)控，對(duì)RNA的特異性較低，且會(huì)出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，甚至可能會(huì)對(duì)細(xì)胞基因組造成損傷，因此在應(yīng)用方面存在一定的安全隱患。而CRISPR/Cas13系統(tǒng)以Cas13酶特異靶向并剪切單鏈RNA，同時(shí)對(duì)周邊RNA進(jìn)行“附帶切割”，基于其精準(zhǔn)的靶向性和酶切割能力，已被開發(fā)為新一代診斷技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在病原微生物檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景[6-8]。本文對(duì)基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的病原體檢測(cè)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為后續(xù)研究提供參考。

1 CRISPR /Cas13系統(tǒng)簡(jiǎn)介

根據(jù)Cas蛋白組成和發(fā)揮作用方式的不同，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為兩大類：一類系統(tǒng)可分為Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)，其核酸酶需要多種Cas蛋白酶集合形成復(fù)合物才能發(fā)揮作用；二類系統(tǒng)可分為Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型系統(tǒng)，其核酸酶只需要單一Cas蛋白即可發(fā)揮效用[9-10]。Ⅱ型（Cas9）和Ⅴ型（Cas12）主要對(duì)DNA具有靶向性，在基因編輯、腫瘤治療等方面被廣泛研究[4，11]。Cas13屬于二類Ⅵ型系統(tǒng)，含有2個(gè)高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合域（higher eukaryote and prokaryote nucleotidebinding domain，HEPN）結(jié)構(gòu)，是一種靶向剪切RNA的新型CRISPR系統(tǒng)酶。Cas13具有加工處理向?qū)NA（CRISPR RNA，crRNA）和crRNA引導(dǎo)下靶向剪切單鏈RNA的雙重核酸酶活性，能夠特異性識(shí)別并剪切RNA片段，同時(shí)還具備非特異性RNA核糖核苷酸酶（RNA ribonuclease，RNase） 活性，可對(duì)周邊的RNA片段進(jìn)行無差別的“附帶剪切”。根據(jù)Cas蛋白功能的不同，Ⅵ型系統(tǒng)又可分為4種亞型，分別為Ⅵ-A、Ⅵ-B、Ⅵ-C、Ⅵ-D，其中Ⅵ-A即為Cas13a，含有Cas1和Cas2蛋白，高分辨率電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示Cas13a具有“雙瓣葉”球狀蛋白結(jié)構(gòu)，由1個(gè)crRNA識(shí)別葉和1個(gè)核酸酶葉組成[11]。Cas13a與靶序列結(jié)合，可引起構(gòu)象變化，催化HEPN 1和HEPN 2結(jié)合部位位點(diǎn)活化，導(dǎo)致靶序列在結(jié)合區(qū)域的外部被切割（順式切割），同時(shí)非特異性切割周邊其他RNA（反式切割）[12]。Ⅵ-B即為Cas13b，不含Cas1和Cas2，根據(jù)Cas13b轉(zhuǎn)座子上攜帶的附屬蛋白基因型的不同，可分為Ⅵ-B1和Ⅵ-B2型[13]。Ⅵ-B1的附屬蛋白是Csx27，Ⅵ-B2的附屬蛋白是Csx28，Cas13b蛋白酶活性受Csx27/Csx28影響，Csx27表現(xiàn)為抑制，Csx28表現(xiàn)為增強(qiáng)[13]。Ⅵ-D即為Cas13d，由crRNA、CRISPR系統(tǒng)酶（Cas1、Cas2、Cas13d）和附屬蛋白WYL1組成，Cas13d的相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于其他3種核酸酶，可以僅依靠Cas13d上最小序列，即二級(jí)結(jié)構(gòu)靶向RNA，附屬蛋白WYL1可以正向誘導(dǎo)酶切活性，由于Cas13d具有較強(qiáng)的靶向切割能力和酶切活性，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究中[14]。目前關(guān)于Cas13c的報(bào)道較少。

2 CRISPR /Cas13系統(tǒng)在病原體檢測(cè)中的研究進(jìn)展

2.1 在病毒檢測(cè)中的研究進(jìn)展

EAST-SELETSKY等[15]在CRISPR/Cas13a系統(tǒng)中加入結(jié)合有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的RNA熒光報(bào)告分子，在其被切割前淬滅基團(tuán)發(fā)揮作用，使RNA熒光報(bào)告分子不發(fā)射熒光；當(dāng)Cas13a被靶序列激活時(shí)，“附帶切割”RNA熒光報(bào)告分子，致使RNA鏈斷裂，熒光基團(tuán)被激活，并釋放熒光信號(hào)，通過收集熒光信號(hào)即可進(jìn)行特定核酸檢測(cè)，但該方法的靈敏度較低，只達(dá)到pmol/L級(jí)，尚不能滿足臨床檢測(cè)需求。2017年，GOOTENBERG等[16]在先前研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合重組聚合酶（recombinase polymerase amplification，RPA）擴(kuò)增技術(shù)和T7核糖核酸聚合酶轉(zhuǎn)錄技術(shù)，發(fā)明了特異性高靈敏度酶報(bào)告解鎖（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）技術(shù)，并成功檢測(cè)出寨卡病毒和登革熱病毒的特定毒株。2018年，GOOTENBERG等[17]又根據(jù)CRISPR酶學(xué)的特點(diǎn)進(jìn)一步優(yōu)化了SHERLOCK技術(shù)，第2代SHERLOCK技術(shù)與CRISPR相關(guān)蛋白Csm6結(jié)合，將靈敏度從pmol級(jí)提升至amol級(jí)；針對(duì)不同的Cas蛋白所結(jié)合的crRNA具有特異性，可以進(jìn)行不同病原體的Cas13多通路檢測(cè)；結(jié)合側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)結(jié)果，采用凍干技術(shù)可制備成易于攜帶的即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing，POCT）試劑。MYHRVOLD等[18]研發(fā)出HUDSON技術(shù)，用于病毒核酸的保護(hù)和釋放，該技術(shù)的原理為：利用加熱和化學(xué)還原方法，可同時(shí)裂解病毒顆粒，并滅活體液中的高水平核糖核酸酶，免去核酸提取的步驟。將HUDSON和SHERLOCK結(jié)合，可直接檢測(cè)體液中的病毒DNA/RNA，無需特殊設(shè)備，1～2 h即可出結(jié)果，大大提高了POCT的效能。有研究結(jié)果顯示，基于SHERLOCK技術(shù)可檢出EB病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、禽流感病毒、非洲豬瘟病毒等[19-23]，靈敏度高，特異性強(qiáng)，與其他病原體無交叉反應(yīng)。郭悅等[24]將CRISPR/Cas13檢測(cè)與重組酶介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)（recombinase aided amplification，RAA）結(jié)合，39 ℃條件下40～52 min可檢出8種輸入性傳染病病原體，靈敏度可以達(dá)到1～10拷貝/μL，臨床樣本中的病原體被全部檢出。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是檢測(cè)SARSCoV-2的金標(biāo)準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用大規(guī)模篩查，檢測(cè)限低至1拷貝/μL，但最新病毒動(dòng)力學(xué)模型表明，相對(duì)于靈敏度而言，高頻率檢測(cè)和快速診斷才是減少病毒傳播的關(guān)鍵[25]。FOZOUNI等[26]將CRISPR/Cas13a與手機(jī)顯微鏡結(jié)合，進(jìn)行SARSCoV-2檢測(cè)，無需預(yù)擴(kuò)增即可直接檢測(cè)鼻拭子中的RNA，通過手機(jī)攝像頭讀取熒光信號(hào)，靈敏度達(dá)到100拷貝/μL，且能在5 min內(nèi)提供準(zhǔn)確結(jié)果。在大規(guī)模篩查中，基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的SARS-CoV-2檢測(cè)在時(shí)效、成本、便攜上有著巨大的優(yōu)勢(shì)。

2.2 在細(xì)菌檢測(cè)中的研究進(jìn)展

傳統(tǒng)病原菌檢測(cè)技術(shù)通常包括微生物分離培養(yǎng)與鑒定、免疫學(xué)檢測(cè)和基于核酸檢測(cè)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，分離培養(yǎng)與鑒定周期長(zhǎng)，無法滿足臨床快速檢測(cè)病原菌的需求，而免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)對(duì)儀器、人員要求較高，操作較復(fù)雜，所需成本高，無法滿足基層醫(yī)院的需要。2017年，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布了適用于發(fā)展中國(guó)家病原體檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)，要求具有經(jīng)濟(jì)、高靈敏度、高特異性、操作簡(jiǎn)單、快速穩(wěn)定和易儲(chǔ)運(yùn)的特點(diǎn)[27]。因此，迫切需要開發(fā)一種靈敏、特異、快速、便捷的新型病原菌檢測(cè)平臺(tái)。JIANG等[28]將PCR與CRISPR/Cas13結(jié)合，用于檢測(cè)沙門菌，顯示出優(yōu)異的敏感性，2 h內(nèi)可以檢出至少10個(gè)沙門菌基因組DNA（1 amol/L或10 CFU/mL），特異性良好，與其他常見的食源性細(xì)菌沒有交叉反應(yīng)。該方法能夠靈敏且準(zhǔn)確地檢測(cè)沙門菌，為食品中食源性病原體的檢測(cè)提供了一種新的策略，突破了傳統(tǒng)方法耗時(shí)且高度依賴巨大人力和物力資源的局限。JIANG等[28]還利用CRISPR/Cas13系統(tǒng)檢測(cè)B族鏈球菌（group BStreptococcus，GBS），與基于培養(yǎng)和PCR的檢測(cè)方法相比，這種新型GBS檢測(cè)方法顯示出優(yōu)異的診斷性能，敏感性和特異性被大大提高，有望成為GBS快速篩查的新型POCT方法。AI等[29]利用SHERLOCK技術(shù)成功檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌，與GeneXpert法具有相同的敏感性。黃明耀等[30]利用CRISPR/Cas13a技術(shù)在2 h內(nèi)快速檢測(cè)布魯菌，敏感性和特異性均為100%，檢測(cè)下限接近10 fg/μL，成功解決了臨床布魯菌檢測(cè)周期長(zhǎng)、患者無法得到及時(shí)救治的難題。蘇璇等[31]利用CRISPR/Cas13a輔助RAA技術(shù)檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌，其靈敏度為101CFU/mL，遠(yuǎn)高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（102CFU/mL），且檢測(cè)時(shí)間僅需30 min，大大提高了對(duì)食源性疾病暴發(fā)的應(yīng)急檢測(cè)能力，為金黃色葡萄球菌引起的食源性疾病早期診斷提供了有力的支持。

2.3 在真菌檢測(cè)中的研究進(jìn)展

近年來，隨著免疫抑制劑、侵入性診療的廣泛應(yīng)用，真菌感染率逐年上升，已成為醫(yī)院感染的主要病原體之一。傳統(tǒng)真菌分離培養(yǎng)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高，因此快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)對(duì)臨床真菌感染診斷有著重要的意義。LI等[8]利用SHERLOCK檢測(cè)平臺(tái)建立了煙曲霉菌的鑒定方法，結(jié)果顯示，CRISPR/Cas13a技術(shù)能快速鑒定出煙曲霉菌，其敏感性和特異性與熒光定量PCR一致。宏基因組測(cè)序敏感性較高，但該技術(shù)對(duì)操作者的要求較高，并且需要使用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核酸序列比對(duì)，使該方法局限于實(shí)驗(yàn)室診斷而不能在臨床中廣泛使用，尤其是在缺乏實(shí)驗(yàn)室診斷條件的地區(qū)。因此，基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)可用于初步篩查，為臨床快速確定曲霉菌感染提供依據(jù)。這為未來開發(fā)基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的新型真菌感染檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

2.4 在寄生蟲檢測(cè)中的研究進(jìn)展

寄生蟲實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要以病原學(xué)檢查、免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)為主。對(duì)于病原學(xué)檢查而言，影響因素較多，寄生蟲感染階段、寄生部位和樣本采集的方法、操作、部位不同均容易導(dǎo)致漏診，而且對(duì)檢測(cè)人員要求較高，需要有豐富的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。相較于傳統(tǒng)的病原學(xué)檢查，免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)有更高的敏感性和特異性，且操作相對(duì)簡(jiǎn)便、易行，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，結(jié)合病原學(xué)檢查結(jié)果，可以極大地提高寄生蟲的檢測(cè)效率[32]。隨著CRISPR/Cas13系統(tǒng)在病毒、細(xì)菌等病原體檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用，目前該系統(tǒng)也逐步應(yīng)用于寄生蟲檢測(cè)。余復(fù)昌[33]建立了基于RPA反應(yīng)和CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的檢測(cè)微小隱孢子蟲的“一管法”快速檢測(cè)方法，具有高效、特異、穩(wěn)定的特性，在資源相對(duì)匱乏的偏遠(yuǎn)地區(qū)具有廣闊的應(yīng)用前景。LEE等[34]采用SHERLOCK檢測(cè)平臺(tái)對(duì)惡性瘧原蟲（即鐮刀瘧原蟲）進(jìn)行檢測(cè)，可同時(shí)鑒別惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲；該方法優(yōu)化了核酸提取過程，能夠在60 min內(nèi)檢測(cè)出每毫升血液中的2個(gè)瘧原蟲，符合WHO建議的檢測(cè)靈敏度。

3 總結(jié)與展望

CRISPR/Cas13系統(tǒng)目前已被開發(fā)為一種新型的分子診斷工具，為病原體的檢測(cè)打開了新思路。該系統(tǒng)具有高靈敏度、高特異性、快速、便捷、成本低的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)快速POCT，在病原體檢測(cè)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。與基于PCR的傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)相比，基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏度和單堿基錯(cuò)配特異性高的特點(diǎn)，如SHERLOCK技術(shù)可以將靈敏度提高到amol/L級(jí)別，無需精密的儀器設(shè)備、昂貴的試劑和專業(yè)人員；SHERLOCK試紙條可以大批量生產(chǎn)，室溫儲(chǔ)存，保質(zhì)期長(zhǎng)，可在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和偏遠(yuǎn)地區(qū)實(shí)現(xiàn)病原體的快速篩查；借助生物傳感器實(shí)現(xiàn)可視化信號(hào)讀取，大大降低了檢測(cè)成本，能夠?qū)崿F(xiàn)快速定量檢測(cè)和多重檢測(cè)。ACKERMAN等[35]開發(fā)了一種用于可擴(kuò)展的多路復(fù)用病原體檢測(cè)平臺(tái)，即核酸多重評(píng)估的組合陣列反應(yīng)（combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids，CARMEN），將CARMEN和Cas13檢測(cè)（CARMEN-Cas13）結(jié)合，可在單個(gè)陣列上對(duì)4 500多個(gè)靶crRNA對(duì)進(jìn)行測(cè)試，能夠區(qū)分SARSCoV-2等169種可感染人類的病毒，并可對(duì)甲型流感病毒株進(jìn)行全面的亞型分析，完成數(shù)十種人類免疫缺陷病毒耐藥突變株鑒定。

然而，目前基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的病原體的診斷技術(shù)仍面臨許多挑戰(zhàn)。為了提高檢測(cè)靈敏度，許多基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)均加入了RPA擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)容易引起非特異性擴(kuò)增，造成假陽性或假陰性的結(jié)果，可能需要通過NGS等較為成熟的技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。多種引物的加入會(huì)使CRISPR/Cas13生物傳感器體系的建立和檢測(cè)過程復(fù)雜化，限制檢測(cè)速度，為實(shí)現(xiàn)POCT增加難度。優(yōu)選Cas13蛋白、設(shè)計(jì)crRNA引物是建立高效CRISPR/Cas13生物傳感器的基礎(chǔ)和難點(diǎn)，仍需進(jìn)一步研究。大多數(shù)基于 CRISPR/Cas13系統(tǒng)的檢測(cè)平臺(tái)只能實(shí)現(xiàn)對(duì)單一病原體的定性檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)與高通量檢測(cè)。因此，未來還需要對(duì)基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的病原體檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，構(gòu)建快速定量檢測(cè)和高通量檢測(cè)平臺(tái)是未來研究的重點(diǎn)。