心肌損傷多肽和蛋白類標(biāo)志物方法學(xué)分析和進(jìn)展

孫澤朋 王洪彬 王建東 宋德偉 肖 鵬

[1.天津科技大學(xué)，天津 300450；2.中國計量科學(xué)研究院 國家市場監(jiān)管重點實驗室（營養(yǎng)與健康化學(xué)計量及應(yīng)用），北京 100029]

缺氧、細(xì)菌、病毒、支原體、藥物反應(yīng)、先天性心臟病、心肌梗死、心力衰竭、川崎病等都可干擾心肌細(xì)胞代謝，從而引起心肌損傷，每年有超過700萬人死于心肌損傷類疾病[1]。標(biāo)志物篩查是疾病分類、病程判斷的快捷方法，也是確定治療方案、用藥、預(yù)后的關(guān)鍵方法。據(jù)報道，約有70%的臨床診斷來自相關(guān)標(biāo)志物的體外檢驗結(jié)果[2]，因此檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性會在很大程度上影響臨床診斷和治療。近年來，生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)均取得了長足進(jìn)步，歐盟、美國、中國、日本等在其制定的診療指南、專家共識中，均將生物標(biāo)志物作為影像學(xué)診斷的補(bǔ)充，并對生物標(biāo)志物的判斷閾值、參考區(qū)間進(jìn)行細(xì)化。在心肌損傷類疾病標(biāo)志物中，很大一部分為氨基酸組成的多肽和蛋白質(zhì)。然而，準(zhǔn)確測量大分子生物標(biāo)志物存在很多難點：生物標(biāo)志物的含量通常很低，需要高靈敏的檢測方法才能檢出；在蛋白酶的作用下，一些生物標(biāo)志物會發(fā)生降解，導(dǎo)致被測物水平下降；生成的酶解產(chǎn)物有可能干擾檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文從大分子標(biāo)志物測量存在的核心問題出發(fā)，分析成因，并對先進(jìn)檢測技術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用可行性進(jìn)行展望。

1 心肌損傷標(biāo)志物的發(fā)展歷程

1954年，LADUE等[3]首次發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者血液中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）異常升高。隨后經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶（lactic acid dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）等也會在心肌損傷過程中被大量釋放至外周血中[4]。上述酶類被公認(rèn)為是最早的心肌損傷體外診斷標(biāo)志物。隨著醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，敏感性和特異性更高的標(biāo)志物，如肌紅蛋白（myoglobin，MYO）、D-二聚體（D-dimer，DD）、肌鈣蛋白、B型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）、氨基末端B型鈉尿肽原（N-terminal B-type natriuretic peptide，NT-proBNP），被逐步應(yīng)用于臨床實踐。另外，脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、可溶性生長刺激表達(dá)基因2蛋白（soluble growth stimulation expressed gene 2，sST2）等非特異性標(biāo)志物在心肌損傷疾病診斷和預(yù)后評估中也發(fā)揮了重要的輔助作用，多指標(biāo)聯(lián)合檢測更加有利于提高診斷準(zhǔn)確度。

2 多肽和蛋白質(zhì)類標(biāo)志物的檢測方法和面臨的挑戰(zhàn)

通過單克隆/多克隆抗體特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白，再根據(jù)抗原抗體復(fù)合物二次結(jié)合的報告基團(tuán)產(chǎn)生的光譜、化學(xué)等信號間接定量目標(biāo)蛋白，是目前臨床檢測大分子標(biāo)志物的主流方法。低豐度（ng/L）的心肌損傷標(biāo)志物，如BNP、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI），可以采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，一些含量相對較高（μg/L～g/L）的標(biāo)志物，如CKMB、MYO，可采用生化方法進(jìn)行檢測[5]。2種方法在分析時間、檢測范圍、成本、自動化程度等方面各有優(yōu)缺點。乳膠增強(qiáng)免疫比濁法、化學(xué)發(fā)光法等利用了抗原抗體結(jié)合的免疫學(xué)原理。標(biāo)志物與抗體的復(fù)合體形成過程可被視為影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的先決因素，抗原結(jié)構(gòu)異質(zhì)性、抗體識別特異性等均可以改變事先定義的目標(biāo)蛋白及其檢測結(jié)果。由此可見，方法的靈敏度決定了是否能檢測到被測物。另外，檢測方法的特異性代表檢測到被測物屬于單一結(jié)構(gòu)還是結(jié)構(gòu)類似物的集合，對半衰期短、個體異質(zhì)性程度高的被測物進(jìn)行檢測或許是臨床檢驗面臨的最大的挑戰(zhàn)。

2.1 抗原結(jié)構(gòu)異質(zhì)性對檢測準(zhǔn)確度的影響

美國臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)家、肌鈣蛋白發(fā)現(xiàn)者之一的APPLE教授于2012年發(fā)文稱：“在我有生之年可能無法看到肌鈣蛋白I標(biāo)準(zhǔn)化的那一天”[6]。我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2012年針對124家臨床實驗室的室間質(zhì)量評價（external quality assessment，EQA）結(jié)果顯示，cTnI的中位值為0.09 μg/L，但最大值約是最小值的230倍（0.01 μg/L～2.3 μg/L）[7]。異質(zhì)性或許是肌鈣蛋白準(zhǔn)確測量的最大障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者肌鈣蛋白主要以CI雙亞基形式出現(xiàn)，但同樣會存在游離I亞基、CTI三亞基的形式[6，8]。更糟糕的是，亞基氨基端或羧基端還會發(fā)生酶解、氧化、還原、磷酸化等反應(yīng)，生成大量代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致抗原中包含了游離、代謝、復(fù)合體形式，以及翻譯后修飾產(chǎn)物，而這一系列反應(yīng)與個體的性別、年齡和健康狀況等均有關(guān)。因抗原組成復(fù)雜、個體間異質(zhì)性明顯，即便使用相同試劑和檢測系統(tǒng)，結(jié)果一致性也無法得到保證，這或許就是肌鈣蛋白難以準(zhǔn)確測量的根本原因。另外，美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）研制的SRM2921是目前唯一的冰凍人血清肌鈣蛋白復(fù)合體有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，利用該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對不同系統(tǒng)校準(zhǔn)后，13個平臺的測量變異程度由校準(zhǔn)前的40倍縮小到3倍[9]。盡管在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)介入下不同檢測系統(tǒng)間的校準(zhǔn)效果明顯，但3倍的變異程度也是不可接受的。可惜的是，SRM2921由于穩(wěn)定性問題目前已經(jīng)停產(chǎn)，且NIST暫時沒有重新研制或復(fù)制該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的計劃。中國計量科學(xué)研究院（the National Institute of Metrology，NIM）研制的肌鈣蛋白溶液純度國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW09229）為了避免抗原降解給定值帶來偏差，在研制過程中建立了穩(wěn)定片段代替完整蛋白的同位素稀釋質(zhì)譜法，使得定值結(jié)果在長期監(jiān)測中具備很好的穩(wěn)定性。肌鈣蛋白已經(jīng)是全球公認(rèn)的心肌梗死診斷金標(biāo)準(zhǔn)，個體異質(zhì)性使得抗體結(jié)合程度無法準(zhǔn)確量化，免疫學(xué)方法的檢測結(jié)果變異程度高；同時，負(fù)責(zé)量值傳遞和溯源的血清/血漿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性差，也給檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)帶來了極大阻力。導(dǎo)致出現(xiàn)這種結(jié)果的根本原因可歸結(jié)為分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。在不改變現(xiàn)有臨床免疫檢測原理和抗體類型的前提下，準(zhǔn)確測量肌鈣蛋白亞基或復(fù)合體，確實很難實現(xiàn)。

cTnI的EQA結(jié)果變異很大，而意大利組織的130家臨床實驗室開展的BNP能力驗證計劃結(jié)果顯示，不同實驗室間的偏差達(dá)到了43%[10]，類似的情況還有很多。追蹤偏差成因的難度較大，因為檢驗結(jié)果不但受試劑、儀器的影響，環(huán)境、操作者等因素也會造成一定的影響，偏差成因往往很難聚焦。在我國，各級臨床檢驗中心會定期組織大量EQA活動，通過分發(fā)考核樣本對不同品牌儀器、試劑的性能和不同臨床檢驗機(jī)構(gòu)的檢測能力進(jìn)行測試、對比，在督促儀器、試劑生產(chǎn)廠商提高產(chǎn)品質(zhì)量的同時，操作人員也可以隨時查找問題，主觀上避免額外偏差產(chǎn)生。EQA的統(tǒng)計結(jié)果時刻提醒臨床醫(yī)學(xué)從業(yè)者，試劑生產(chǎn)、被測物定義、溯源體系建立等很多環(huán)節(jié)還具備提升和改進(jìn)空間，標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)體系的建立任重道遠(yuǎn)。ISO17511是體外診斷試劑（in vitrodiagnostic reagent，IVD）量值溯源的核心文件，其中規(guī)定了多種溯源路線圖，無論哪一種技術(shù)路線都離不開標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和方法?，F(xiàn)階段，大分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制仍具有很大挑戰(zhàn)性，這種挑戰(zhàn)并不完全來自于定值方法，而是來自“物質(zhì)量”和“活性量”之間的一條“鴻溝”。在化學(xué)計量學(xué)中，針對被測物開展絕對定值可以通過將蛋白質(zhì)水解至氨基酸，或酶解至肽段的形式，采用同位素稀釋質(zhì)譜法獲得量值準(zhǔn)確可靠、可溯源至國際單位制（SI單位）的定值結(jié)果，也就是“物質(zhì)量”；但“活性量”目前還沒有明確溯源技術(shù)和方法，事實上“活性”既不是SI單位也不是導(dǎo)出單位。因此，以免疫技術(shù)為主的臨床測量若想實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，達(dá)到結(jié)果統(tǒng)一、可比的目的，就一定要建立連接“物質(zhì)量”和“活性量”的橋梁。

2.2 抗體識別特異性對檢測準(zhǔn)確度的影響

當(dāng)某些標(biāo)志物的前體分子和代謝物都能被抗體識別時，將會發(fā)生交叉反應(yīng)[11-12]，BNP便是典型代表。由于外周血中存在多種內(nèi)肽酶，BNP在被釋放至外周血后，半衰期僅為20 min左右，此時患者血液中不僅有完整的BNP，即BNP1-32，還存在大量的代謝產(chǎn)物，如BNP3-32、BNP4-32、BNP5-32，甚至還存在糖基化的B型鈉尿肽原。根據(jù)國際臨床化學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）公開的BNP檢測系統(tǒng)信息，識別抗體針對的抗原表位為BNP的aa.5-13、aa.27-32、aa.14-21，這表明B型鈉尿肽原和絕大多數(shù)BNP代謝產(chǎn)物均可被抗體結(jié)合，從而被計算到檢測結(jié)果中，也就是說，目前技術(shù)檢測的是BNP的總量，而非BNP1-32。BNP總量是否可以代替BNP1-32尚需要大量的臨床研究才能下結(jié)論。但追求被測量的真實結(jié)果一定是檢驗的發(fā)展方向。另外，BNP1-32還具有激活cGMP通路等的活性，將其與無活性的代謝物一起計入BNP檢測結(jié)果顯然是不合適的。基于此，LEWIS等[13]針對氨基端抗原表位設(shè)計并研制了一種新型抗體，用于識別BNP1-32，在與50E1（aa.26-32）檢測抗體結(jié)合使用后，發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)得到了很好的抑制，盡管這項研究還未應(yīng)用于商品化試劑的生產(chǎn)中，但在追求BNP檢測真實結(jié)果中無疑具有里程碑式的意義。

3 多肽和蛋白類標(biāo)志物檢測新技術(shù)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些新興的多肽和蛋白類檢測技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來，可以克服檢測靈敏度不夠、特異性較差、動態(tài)范圍小的問題。此外，還能實現(xiàn)高通量分析，即在單個樣本中同時檢測多種蛋白質(zhì)，有利于提高檢測效率、減少樣本損耗、降低成本。這些新興的多肽和蛋白類檢測技術(shù)具有超高靈敏度、高特異性、寬動態(tài)范圍，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量分析。

3.1 表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）是一種超靈敏的振動光譜技術(shù)，通過拉曼光譜法測定附著在經(jīng)過特殊處理的金屬表面（金/銀）的樣本，以拉曼散射作為讀取信號進(jìn)行測量。基于SERS免疫分析法檢測蛋白標(biāo)志物的基本過程見圖1[14]。SERS的探針在特異性識別目標(biāo)分析物的同時還可為目標(biāo)分析物的定量檢測提供SERS信號。HE等[15]使用了一種可以容納很多金/銀納米顆粒的新型高孔隙率晶體材料-金屬有機(jī)骨架（metal-organic framework，MOF），顯著增強(qiáng)了拉曼信號，從而提高了SERS的靈敏度。通過這種方法，成功對NT-proBNP進(jìn)行了快速有效的超靈敏檢測，其最低檢測限為0.75 fg/mL，檢測范圍為1 fg/mL～1 ng/mL。

圖1 基于SERS的夾心免疫分析法[14]

為了將這種高靈敏度、高特異性、動態(tài)范圍寬的SERS免疫分析方法應(yīng)用于臨床疾病蛋白類標(biāo)志物檢測，未來關(guān)注點應(yīng)該集中于提高檢測方法的可重復(fù)性、降低成本和簡化操作步驟方面。

3.2 懸浮陣列技術(shù)

懸浮陣列技術(shù)是美國Luminex公司研制的以熒光編碼微球為核心，集流式細(xì)胞分析、激光分析、高速信號處理等技術(shù)于一體的分析技術(shù)平臺。該技術(shù)將聚苯乙烯微球用熒光染色法進(jìn)行編碼（即通過2種熒光染料對微球進(jìn)行染色，調(diào)節(jié)比例后，可以獲得100種不同顏色的微球），每種染色的微球交聯(lián)1種針對某個被測物的生物探針（抗體、適體）。不同被測物的編碼微球進(jìn)行混合后，再加入微量待檢的樣本，靶分子與微球表面交聯(lián)的探針在懸液中進(jìn)行特異性結(jié)合，在1個反應(yīng)孔中可同時完成約100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，采用激光流式儀鑒定微球顏色來確定被測物，同時通過檢測靶物質(zhì)上的報告分子產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度來進(jìn)行定量[16]。LIU等[17]通過該技術(shù)檢測了血清中3種心肌梗死生物標(biāo)志物（cTnI、CK-MB、MYO），具體過程見圖2。與常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）相比，懸浮陣列技術(shù)的檢測靈敏度可提高10～100倍，最低檢測下限為0.01 pg/mL；檢測的動態(tài)范圍比常規(guī)的ELISA方法高10倍以上，可達(dá)3～5個數(shù)量級；檢測所需時間更短，檢測效率更高，重復(fù)性好；一次可同時檢測多種疾病的生物標(biāo)志物，具高通量檢測能力[17]。

圖2 懸浮陣列技術(shù)檢測AMI生物標(biāo)志物[17]

懸浮陣列技術(shù)的高通量、高靈敏度、高精確性的特點符合臨床多指標(biāo)聯(lián)合檢測的要求，在檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 單分子免疫陣列分析技術(shù)

單分子免疫陣列分析技術(shù)是一種在體積為fL大小的微孔中進(jìn)行單分子酶促反應(yīng)，并可進(jìn)行熒光成像的數(shù)字式ELISA（圖3），具有靈敏度高、檢測范圍寬、耗時短等優(yōu)勢[18]。單分子免疫陣列分析技術(shù)采用經(jīng)典的雙抗夾心ELISA原理，可實現(xiàn)極低含量蛋白的定量檢測。該技術(shù)的關(guān)鍵在于將免疫復(fù)合物捕獲，并密封在含有超過20萬個fL大小的微孔的芯片中，從而實現(xiàn)單個分子的檢測，大幅提升了檢測靈敏度，因此這種技術(shù)又被稱為數(shù)字式ELISA，比傳統(tǒng)的ELISA方法靈敏度高1 000倍。JAROLIM等[19]基于單分子免疫陣列技術(shù)開發(fā)了一種用于檢測cTnI的新型全自動數(shù)字分析儀，檢測限為0.01 ng/L，定量限為0.08 ng/L；通過檢測健康對照者和心力衰竭患者的cTnI水平，發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者cTnI水平顯著升高，并可作為心力衰竭嚴(yán)重程度更詳細(xì)的分類參考。此外，建立個性化的參考區(qū)間，不僅適用于測定健康個體cTnI水平，還適用于運動負(fù)荷測試后cTnI變化的監(jiān)測。

圖3 單分子陣列免疫分析示意圖[18]

這種超靈敏、高通量、操作簡便的單分子免疫陣列分析技術(shù)不僅可以檢測血清、血漿中極低含量的蛋白類標(biāo)志物，還可以辨別生物標(biāo)志物的微小變化，有利于心肌損傷類疾病的早期診斷，了解高風(fēng)險患者的疾病進(jìn)展，及時采取個性化預(yù)防措施。

3.4 臨床質(zhì)譜

與前幾項技術(shù)相比，質(zhì)譜技術(shù)具有極好的特異性，可以提供蛋白質(zhì)序列信息，并可用于檢測和量化蛋白翻譯后修飾和代謝產(chǎn)物。此外，質(zhì)譜技術(shù)已被應(yīng)用于一些臨床檢驗領(lǐng)域，如基于高分辨質(zhì)譜的微生物鑒定、基于四極桿質(zhì)譜和配套試劑盒的定量檢測，但大多數(shù)還僅限于小分子物質(zhì)的檢測。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對復(fù)雜基質(zhì)中的多肽和蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量較為困難，需要驗證方法的回收率、定量范圍、定量限、準(zhǔn)確度和精密度[20]，該技術(shù)主要受制于前處理方法的性能，一旦樣本經(jīng)處理后達(dá)到檢測要求，色譜、質(zhì)譜和工作站等完全具備檢測大分子生物標(biāo)志物的能力。

同位素稀釋質(zhì)譜（isotope dilution mass spectrometry，ID-MS）是目前國際物質(zhì)量咨詢委員會認(rèn)可的基準(zhǔn)方法之一，被各國計量機(jī)構(gòu)廣泛用于大分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。TORMA等[21]基于ID-MS對BNP中的氨基酸或酶解肽段進(jìn)行準(zhǔn)確定量，從而推導(dǎo)出完整分子的量值，由于所有結(jié)果均可以溯源至氨基酸國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，利用該方法研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也同時具備了計量學(xué)溯源性，因此該方法也被稱為參考測量程序。電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）可通過測定標(biāo)志物中金屬元素的量，再根據(jù)一級結(jié)構(gòu)信息去計算蛋白的絕對量。由于BNP中的甲硫氨酸和半胱氨酸含有硫元素，因此可針對硫元素開發(fā)一種ICP-MS方法，間接對BNP進(jìn)行定量。DEITRICH等[22]采用ICP-MS技術(shù)對人硒蛋白P1（selenoprotein 1，SEPP1）進(jìn)行定量檢測，通過測量78Se/76Se和82Se/76Se同位素比值來確定2種酶解肽的Se質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而對SEPP1進(jìn)行準(zhǔn)確定量。這種方法校正了處理過程和分析過程中的隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差，提高了ICP-MS定量的準(zhǔn)確性。

近年來，國際物質(zhì)量咨詢委員會蛋白工作組的工作計劃可以看出，在完整蛋白水平開展ID-MS或許是下一階段技術(shù)突破的重點方向，盡管在完整蛋白水平開展研究需要更大的投入，但由于不使用水解或酶解反應(yīng)，目標(biāo)物的溯源路徑更短、定值不確定度更小，因此可提高ID-MS檢測系統(tǒng)校準(zhǔn)后測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 展望

臨床對心肌損傷標(biāo)志物檢測的第一訴求往往是速度，尤其是急性患者，檢測結(jié)果呈現(xiàn)給醫(yī)生的時間可能直接與患者生命相關(guān)聯(lián)。目前的免疫學(xué)檢測技術(shù)可以滿足“快”的需求，尤其是近年來開發(fā)的可達(dá)到μg和ng量級的即時檢驗（point-of-care testing，POCT）產(chǎn)品，使檢測的便捷性有了質(zhì)的提升。但在“快”的同時，還需面對“準(zhǔn)”的問題。很多研究結(jié)果均提示檢驗工作者，隨著更加靈敏、高特異性技術(shù)的發(fā)展，我們對復(fù)雜樣本中標(biāo)志物的存在狀態(tài)有了更清晰的認(rèn)知，下一步將是把這些技術(shù)向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。質(zhì)譜等新型技術(shù)在心肌損傷標(biāo)志物檢測的應(yīng)用中還有許多問題需要解決，但質(zhì)譜特有的質(zhì)量分辨率和擴(kuò)展分析能力可能是解決“準(zhǔn)”的問題的關(guān)鍵。盡管新型技術(shù)目前受到較多限制，但將具有更高結(jié)構(gòu)分析能力的技術(shù)引入臨床，必將推動檢驗醫(yī)學(xué)的發(fā)展。