巢式多重聚合酶鏈反應(yīng)快速診斷兒童腦膜炎/腦炎

石迎迎 潘 芬 孫 燕 王 春 蔣 婕 于方圓 張?zhí)鞐?秦惠宏 張 泓

（上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

腦膜炎/腦炎是發(fā)病迅速、病情進(jìn)展快、致死率高的臨床急癥[1]。進(jìn)展快速的細(xì)菌性腦膜炎24～48 h即可致命[2]。有多種原因可誘發(fā)腦膜炎/腦炎，包括感染性和非感染性因素。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染通常由細(xì)菌、病毒或真菌引起，其中最常見的是病毒性腦炎。兒童病毒性腦炎發(fā)病率約為16/10萬，顯著高于成人[3]。中國疾病預(yù)防控制中心流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，5歲以下兒童細(xì)菌性腦膜炎總體發(fā)病率顯著高于成人[4]。因此，兒童腦膜炎/腦炎的快速診斷具有極其重要的意義。腦脊液培養(yǎng)是鑒別細(xì)菌和非細(xì)菌性腦炎/腦膜炎的常規(guī)方法[5]，也是診斷疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其病原體檢出率偏低，檢測周期較長，易受多種因素影響[6]。由于病毒培養(yǎng)的特殊性，臨床對病毒性腦膜炎/腦炎的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，但常規(guī)方法敏感性和特異性均不理想。尋找高特異性和高敏感性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢測新方法迫在眉睫。

巢式多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）可在1 h內(nèi)同時檢測多種病原體，包括病毒、細(xì)菌和真菌，樣本用量少，敏感性和特異性高[7]。本研究擬采用巢式多重PCR檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒腦脊液樣本，分析這種快速病原體檢測方法在兒童腦膜炎/腦炎診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2017年5月—2020年5月上海市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、新生兒科、重癥醫(yī)學(xué)科、血液科、消化與感染科臨床診斷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染或疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒的腦脊液樣本82例，所有患兒年齡均<18歲，診療記錄完整。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染或疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[8-9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）患兒有先天性疾病或慢性疾??；2）患兒在腦脊液樣本采集時已有其他無法排除的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病；3）腦脊液樣本量低于檢測要求。本研究經(jīng)上海市兒童醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)（2019R031-F01），所有患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 方法

收集所有患兒腦脊液常規(guī)和生化檢測結(jié)果（腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)、葡萄糖、蛋白、氯、乳酸脫氫酶）、腦脊液培養(yǎng)結(jié)果和本次住院天數(shù)、抗菌藥物使用天數(shù)、是否使用阿昔洛韋、是否合并感染、是否發(fā)熱和臨床結(jié)局等臨床資料。采用法國生物梅里埃公司Filmarray2.0多重核酸檢測系統(tǒng)及配套ME panel檢測14種病原體，包括大腸埃希菌K1株、流感嗜血桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、腦膜炎奈瑟菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、新生隱球菌/格特隱球菌、巨細(xì)胞病毒、腸道病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、人皰疹病毒6型、人雙?？刹《尽⑺?帶狀皰疹病毒。嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用例或率表示，組間比較采用Fishers精確檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。偏態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 82例患兒基本臨床資料

82例患兒中，男49例、女33例，年齡（3.52±3.95）歲。臨床診斷為細(xì)菌性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染30例，病毒性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染23例，疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染29例；好轉(zhuǎn)76例，未愈4例，死亡2例。具體情況見表1。

表1 82例患兒基本臨床資料

2.2 巢式多重PCR檢測結(jié)果

82例患兒中，臨床明確診斷53例，其中巢式多重PCR檢出31例（58.5%）陽性病例；30例臨床明確診斷為細(xì)菌性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患兒中，巢式多重PCR僅檢出11例（36.7%）細(xì)菌陽性；23例臨床明確診斷為病毒性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患兒中，巢式多重PCR檢出20例（87.0%）病毒陽性；巢式多重PCR病毒陽性檢出率顯著高于細(xì)菌陽性檢出率（P<0.05）。病毒陽性患兒中，腸道病毒感染率最高；細(xì)菌陽性患兒中，無乳鏈球菌感染率最高。1～12個月、3～6歲患兒病毒感染率最高，<1個月患兒細(xì)菌感染率最高。見圖1。

圖1 巢式多重PCR病原體檢出情況

2.3 不同類型病原體感染患兒相關(guān)指標(biāo)比較

細(xì)菌組腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白水平、乳酸脫氫酶水平、抗菌藥物使用天數(shù)和住院天數(shù)均高于病毒組，腦脊液葡萄糖水平和阿昔洛韋使用率均低于病毒組（P<0.05）。腦脊液中氯含量2個組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 病毒組、細(xì)菌組相關(guān)指標(biāo)比較

2.4 巢式多重PCR與培養(yǎng)法、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)判斷結(jié)果比較

巢式多重PCR與培養(yǎng)法判斷細(xì)菌性腦膜炎/腦炎的一致性較好（Kappa=0.659，P<0.001），見表3。2種方法具體細(xì)菌種類檢出情況見表4。

表3 巢式多重PCR與培養(yǎng)法一致性分析 例

表4 巢式多重PCR與培養(yǎng)法細(xì)菌鑒定結(jié)果 株

巢式多重PCR與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)判斷病毒性腦膜炎/腦炎的一致性分析較好（Kappa=0.737，P<0.001）。見表5。

表5 巢式多重PCR與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)判斷的一致性分析 例

3 討論

目前，我國最常見的細(xì)菌性腦膜炎病原菌是肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、大腸埃希菌，3月齡內(nèi)兒童細(xì)菌性腦膜炎主要病原菌為無乳鏈球菌和大腸埃希菌[10]。本研究中，細(xì)菌陽性患兒無乳鏈球菌感染率最高，且多為<1個月患兒。巢式多重PCR細(xì)菌檢出率低的原因是其檢測細(xì)菌的覆蓋范圍有限，特異性高說明其準(zhǔn)確性高，假陽性率低，可以準(zhǔn)確檢出檢測系統(tǒng)覆蓋的病原體。有研究發(fā)現(xiàn)，我國病毒性腦炎或腦膜炎最常見的病毒病原體為腸道病毒[11]，與本研究腸道病毒檢出率最高的結(jié)果一致，也與浙江省疾病預(yù)防控制中心的調(diào)查結(jié)果相似[12]。

對于疑似細(xì)菌性腦膜炎患兒，一般推薦入院后1 h內(nèi)即使用抗菌藥物，并推薦將三代頭孢菌素作為初始經(jīng)驗(yàn)治療用藥方案之一[13]。本研究檢出1例單核細(xì)胞增生性李斯特菌感染患兒，該菌對頭孢菌素類抗菌藥物天然耐藥[14]，提示快速多重分子檢測能夠減少經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物的不當(dāng)使用。病毒性腦膜炎/腦炎患兒中，單純皰疹病毒腦炎患兒一般預(yù)后最差，未經(jīng)治療患兒病死率為70%～80%，即使進(jìn)行特定的抗病毒治療，病死率仍高達(dá)30%[15]。因此，兒童病毒性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染需要早診斷，及時進(jìn)行有效干預(yù)[16]?？焖俚姆肿釉\斷方法能夠快速鑒定病原體，有效避免患兒不良預(yù)后，縮短住院時間[17]。對于病原不明的病毒性腦炎或疑似單純皰疹病毒性腦炎，在沒有明確的病原學(xué)檢查結(jié)果的情況下，推薦先使用阿昔洛韋治療[18]。兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染需要早期診斷，并及時采取有效的干預(yù)，但據(jù)報(bào)道，仍有近50%的病毒性腦炎患兒因無法獲得明確的病原學(xué)結(jié)果而延誤治療[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，腸道病毒陽性患兒阿昔洛韋使用率達(dá)70.00%（7/10），總體來說，病毒組阿昔洛韋使用率為60.87%，細(xì)菌組僅為10.00%。因此，快速多重分子檢測技術(shù)的應(yīng)用迫在眉睫，可短時間內(nèi)幫助臨床判斷病毒感染情況，從而對癥治療，減少阿昔洛韋經(jīng)驗(yàn)性使用。

腦脊液實(shí)驗(yàn)室檢測是目前輔助診斷兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的必要依據(jù)，腸道病毒、人皰疹病毒6型等導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)不升高[20]，但也有部分細(xì)菌性腦膜炎患者腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)不升高的報(bào)道[21]。本研究共檢出7例根據(jù)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)判斷為陰性的樣本，均為病毒感染，這一結(jié)果表明，如果單純采用腦脊液實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)判斷兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，有漏診或誤診風(fēng)險(xiǎn)。

然而，本研究結(jié)果顯示，巢式多重PCR陰性樣本中，有2例培養(yǎng)出細(xì)菌，其病原體種類不在檢測系統(tǒng)覆蓋范圍內(nèi)。提示巢式多重PCR檢測仍有一定的局限性，需要進(jìn)一步優(yōu)化。建議聯(lián)合送檢快速多重分子檢測和腦脊液培養(yǎng)，并結(jié)合其他輔助檢查，以更大程度發(fā)揮快速多重分子檢測的診斷價(jià)值[22]。

綜上所述，巢式多重PCR具有快速，操作簡便，結(jié)果可靠，可同步檢出多種病原體的優(yōu)勢，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法的不足，值得在臨床推廣。