基于cfDNA的NGS技術(shù)探究術(shù)后膿毒癥患者血液微生物群特征

梁 棟 梅 月 王騰蛟 喻 東

（中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200433）

隨著外科無菌術(shù)、重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的進(jìn)步，以及抗菌藥物使用的規(guī)范化，術(shù)后感染得到了極大改善，但膿毒癥依然是常見的術(shù)后并發(fā)癥，威脅著患者生命[1]。膿毒癥是由微生物病原體侵入血液而引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)[2]。細(xì)菌感染是誘發(fā)膿毒癥的首要因素，常見的病原體包括肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和克雷伯菌屬細(xì)菌[3-6]，由真菌和病毒引發(fā)的膿毒癥相對較少[7-8]。目前，診斷膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)的血培養(yǎng)法，但該方法有耗時長、敏感性和特異性較弱等局限[9]。因此，更便捷的診斷工具和高敏感性、高特異性的病原體鑒定技術(shù)，成為感染性疾病診斷的迫切需求。

目前，血液和其他體液中生物標(biāo)志物的檢測已廣泛用于醫(yī)學(xué)研究，并在臨床診斷領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用前景。在現(xiàn)有的診斷工具中，細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）作為一種高效、非侵襲性的生物標(biāo)志物，已被應(yīng)用于腫瘤、產(chǎn)前診斷和器官移植排斥等臨床實踐中[10-12]，但其在傳染病領(lǐng)域卻鮮有應(yīng)用[13]。近年來，基因組測序技術(shù)飛速發(fā)展，下一代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)在感染性疾病的診斷中展現(xiàn)出較大的價值[14]。有研究結(jié)果顯示，全基因組NGS能夠有效識別血漿中的病原體，并在24 h之內(nèi)完成對膿毒癥的診斷[9]。如果將基于cfDNA的NGS技術(shù)應(yīng)用于膿毒癥的診斷，有望實現(xiàn)病原微生物的精準(zhǔn)、快速識別，以及疾病的非侵襲性診斷。本研究擬通過對公共數(shù)據(jù)庫中cfDNA的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行再次分析，探索膿毒癥患者（sepsis patient，SP）和對照患者（control patient，CP）血漿中微生物組成的差異性，以更好地理解微生物在引發(fā)膿毒癥中所起的重要作用，幫助臨床有效預(yù)防膿毒癥。

1 材料和方法

1.1 原始測序數(shù)據(jù)的收集

從SRA-NCBI公共數(shù)據(jù)庫（BioProject：PRJEB21872和PRJEB30958）下載cfDNA原始測序數(shù)據(jù)。測序樣本來源于239例外科手術(shù)術(shù)后SP和34例外科手術(shù)術(shù)后未發(fā)生感染的CP的血漿樣本[15-16]。樣本的測序信息見表1。

1.2 數(shù)據(jù)處理和分析

首先，通過SRA Toolkit軟件將原始的sra格式文件轉(zhuǎn)化為Fastq格式，并通過FastQC進(jìn)行質(zhì)量控制[17]。然后，用Kraken2軟件進(jìn)行物種分類分析，Kraken2軟件的比對數(shù)據(jù)庫包括古菌、細(xì)菌、人類和病毒[18-19]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用例或率表示。正態(tài)分布計量資料用±s表示。用線性判別分析效應(yīng)分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）評估組間物種豐度的差異性，以物種的線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值>2，且P<0.05（Kruksal-Wallis檢驗）為顯著性富集。

2 結(jié)果

2.1 微生物分布特征

利用Kraken2將DNA序列與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到每個樣本的物種分類信息和相對豐度（表2），結(jié)果顯示，SP和CP分別有（99.11±5.42）%和（99.84±0.47）%的序列被識別為細(xì)菌，（0.89±5.42）%和（0.16±0.47）%的序列被識別為病毒，（0.002 6±0.015 0）%和（0.000 14±0.000 83）%的序列被識別為古生菌。

表2 前期研究[15-16]和本研究之間的物種比較

2.2 微生物多樣性差異分析

CP和SP血液中分布的微生物在門、綱、目、科、屬、種水平上的數(shù)量分別為15、25、82、133、267、634和16、37、121、205、432、1 085，見表2。對CP和SP組樣本進(jìn)行α多樣性分析和β多樣性分析，發(fā)現(xiàn)SP樣本中微生物的總體多樣性顯著低于CP樣本，見圖1。

2.3 CP和SP微生物相對豐度差異分析

在CP中，變形菌門是最主要的物種（95.23%），其次是放線菌門（4.36%），還有0.19%的厚壁菌門和0.01%的擬桿菌門，以及極少量的酸桿菌門、產(chǎn)水菌門、衣原體門、藍(lán)藻門、梭桿菌門、Kiritimatiellaeota、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、螺旋體門和疣微菌等。與CP相比，SP血漿樣本中放線菌門（28.02%）、厚壁菌門（1.82%）和擬桿菌門（0.61%）顯著增多，變形菌門（69.03%）顯著減少。見圖2。

圖2 SP和CP物種在門分類學(xué)水平上的分布

用LEfSe對SP和CP的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，SP和CP樣本間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的物種數(shù)量為260個（LDA>2，P<0.05），其中差異性較大（LDA>4，P<0.05）的物種有25個。SP顯著富集的物種數(shù)量為14個，包括1門（放線菌門）、1綱（放線菌綱）、2目、4科、2屬、4種；CP顯著富集的物種數(shù)量為11個，包括1門（變形菌門）、1綱（γ變形菌綱）、2目、2科、2屬、3種。見圖3。

圖3 SP和CP微生物差異分析

除細(xì)菌外，SP和CP病毒也表現(xiàn)出較大的差異性，包括細(xì)小病毒科（CP為0.000 24%，SP為0）、指環(huán)病毒科（CP為0.14%，SP為0.002 3%）和有尾噬菌體目（CP為0.027%，SP為0.093%）。

2.4 SP優(yōu)勢菌種的鑒別

在種水平，前20個相對豐度較高的菌種中，有16個在SP和CP之間表現(xiàn)出了顯著性差異（圖4）。其中，SP有12個菌種（嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、紅串紅球菌、食酸菌sp. KKS102、皮氏羅爾斯頓菌、屎腸球菌、人乙型皰疹病毒5、食酸菌sp. JS42、脆弱擬桿菌、大腸埃希菌、Azospira oryzae、中間硫桿菌和多形擬桿菌）顯著增多，4個菌種（惡臭假單胞菌、痤瘡丙酸桿菌、羅氏假單胞菌和銅綠假單胞菌）顯著減少。值得注意的是，屎腸球菌、大腸埃希菌、Azospira oryzae和中間硫桿菌這4種兼性厭氧菌僅存在于SP中。

圖4 SP和CP相對豐度居前20位的物種

將SP顯著增加，且相對豐度>1%的物種視為代表性物種，選出6種代表性物種，包括麥芽寡養(yǎng)單胞菌、紅串紅球菌、食酸菌sp. KKS102、皮氏羅爾斯頓菌、屎腸球菌和唯一的病毒人乙型皰疹病毒5。見表1、圖4。

3 討論

本研究識別出6種代表性物種，包括麥芽寡養(yǎng)單胞菌、紅串紅球菌、食酸菌sp. KKS102、皮氏羅爾斯頓菌、屎腸球菌和人乙型皰疹病毒5。有大量文獻(xiàn)提示這幾個物種與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展具有潛在的聯(lián)系。麥芽寡養(yǎng)單胞菌和皮氏羅爾斯頓菌屬于變形菌門，屎腸球菌屬于厚壁菌門，3種細(xì)菌都是醫(yī)院內(nèi)常見的條件致病菌[20-22]，且是醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌，包括膿毒癥[23-25]。值得注意的是，在健康人群中，厚壁菌門和變形菌門常定植于腸道，是腸道菌群中的2類優(yōu)勢菌門[26]。然而，與健康人群相比，危重癥患者的腸道中厚壁菌門顯著減少，變形菌門顯著增加[27]。這種微生物結(jié)構(gòu)的劇烈變動會導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境紊亂，進(jìn)而可能引發(fā)腸道細(xì)菌移位和腸源性膿毒癥[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血液中所占比例最多的菌種是變形菌門（69.03%），而厚壁菌門僅占1.82%。膿毒癥患者血液與危重癥患者腸道微生物結(jié)構(gòu)的相似性提示腸道細(xì)菌發(fā)生了移位[29]，而細(xì)菌移位在膿毒癥早期起重要作用[30]。本研究中，麥芽寡養(yǎng)單胞菌、皮氏羅爾斯頓菌和屎腸球菌的定量變化可能是導(dǎo)致腸道屏障功能紊亂的關(guān)鍵因素，繼而誘發(fā)致病性細(xì)菌移位和腸源性膿毒癥。

與上述3種條件致病菌不同，紅串紅球菌和食酸菌sp. KKS102是侵入性病原體[31-32]。紅串紅球菌雖然廣泛分布于自然環(huán)境中，但很少有人類感染，目前僅查到2例紅串紅球菌引發(fā)的血液感染病例[31，33]。食酸菌sp. KKS102也很少引發(fā)人類感染[34]，查閱文獻(xiàn)，尚未見除本研究外的食酸菌sp. KKS102引發(fā)的膿毒癥的報道。紅串紅球菌和食酸菌sp. KKS102難以檢測的原因可能是物種的難以鑒定和生長延遲[33-34]。另外，這2種菌的非嗜熱生長特性也是導(dǎo)致其極少引發(fā)人類感染的原因之一[31，35]。雖然紅串紅球菌和食酸菌sp. KKS102極少引發(fā)人類感染，但本研究結(jié)果提示其依舊是膿毒癥的潛在致病菌，不能簡單地將其看作環(huán)境污染菌而忽視。

人乙型皰疹病毒5是本研究膿毒癥患者血液中唯一相對豐度顯著增加的病毒。人乙型皰疹病毒5屬于巨細(xì)胞病毒屬（cytomegalovirus，CMV），CMV是一類在免疫缺陷宿主中常見的機(jī)會性病原體[36]。細(xì)菌性膿毒癥是CMV重激活的重要觸發(fā)因素，且伴隨著較差的臨床預(yù)后，如死亡率增加、重癥監(jiān)護(hù)病房停留和住院時間延長，機(jī)械通氣時間延長，以及二次感染機(jī)會增加[36-37]。幸運的是，CMV重激活的風(fēng)險可被顯著降低，由于重激活事件往往出現(xiàn)在發(fā)病7～28 d，在發(fā)病8 d內(nèi)監(jiān)測可將CMV重激活的風(fēng)險降至1%，甚至是0[38]。

有研究發(fā)現(xiàn)，可通過控制感染源來減少紅串紅球菌、 食酸菌sp. KKS102和人乙型皰疹病毒5的感染風(fēng)險，包括移除污染設(shè)備（如中心靜脈導(dǎo)管）和醫(yī)療器械的表面消毒處理[33，37，39]。除控制感染源外，對腸道微生物的干預(yù)也是應(yīng)對腸源性膿毒癥的有效醫(yī)療策略。近年來，相關(guān)臨床病例報道均提示糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）在膿毒癥治療中有積極作用，糞便微生物在患者體內(nèi)表現(xiàn)出了較好的干預(yù)效果[40]。本研究發(fā)現(xiàn)的6種代表性微生物可能是引發(fā)術(shù)后膿毒癥患者感染的潛在病原體。然而，值得注意的是，這6種潛在病原體與引發(fā)膿毒癥的常見病原體（肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和克雷伯菌屬細(xì)菌）有較大差異，可能是由以下3方面因素造成的：1）不同的生物信息學(xué)分析方法所比對的微生物參考數(shù)據(jù)庫不一致；2）NCBI測序數(shù)據(jù)可能有偏差，不同實驗室的研究對象具有一定的選擇性，導(dǎo)致常見微生物測序比例大大降低，而部分罕見微生物比例則有所增加；3）術(shù)后膿毒癥患者的致病菌受醫(yī)院環(huán)境影響較大，不同醫(yī)院流行病原體不同。因此，本研究結(jié)果主要為膿毒癥的診斷和治療提供數(shù)據(jù)參考，同時提示部分罕見微生物雖較少引發(fā)人類感染，但不能忽視其潛在的致病性。

本研究基于公開的基因組測序數(shù)據(jù)，但在研究目的和方法上與之前的研究[15-16]完全不同。在之前的研究中，通過與非感染對照組的比對，計算基于NGS測序結(jié)果的膿毒癥量化指示分?jǐn)?shù)（sepsis indicating quantifier score，SIQ），對單個樣本檢測到的每個微生物進(jìn)行定量、概率性評估[16]，分析膿毒癥患者的病原體感染狀態(tài)，以鑒定NGS診斷的適用性，并將評估結(jié)果與傳統(tǒng)的血培養(yǎng)法進(jìn)行直接比較[15]，著重關(guān)注單個膿毒癥患者體內(nèi)病原微生物的識別，沒有進(jìn)一步分析膿毒癥患者體內(nèi)富集的微生物。本研究可視為對之前研究的補(bǔ)充，關(guān)注SP和CP微生物的總體差異性，并對一些重要的差異性物種進(jìn)行了詳細(xì)的分析。另外，從結(jié)果上比較，之前的研究[15-16]通過血培養(yǎng)或NGS檢測出的菌種在本研究中基本都被檢測了出來（表2）。

本研究也有一定的局限性，樣本數(shù)量相對較少，臨床信息不夠完整，限制了臨床特征與微生物群落的相關(guān)性分析，未進(jìn)行相關(guān)的實驗性驗證。在之后的研究中，我們將努力突破局限，進(jìn)一步完善相關(guān)微生物與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)性。

綜上，本研究基于較大的人群隊列基因組數(shù)據(jù)，以基于血漿cfDNA的NGS技術(shù)，初步探索了術(shù)后感染和未感染患者血液微生物組成的差異性，為進(jìn)一步理解微生物與膿毒癥之間的聯(lián)系提供了數(shù)據(jù)支撐。本研究揭示了膿毒癥患者血液中微生物多樣性的顯著下調(diào)，以及微生物群落結(jié)構(gòu)的明顯變化，發(fā)現(xiàn)了6種可能在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的代表性微生物。