基于LC-MS 的除濕胃苓湯加減治療脾虛濕蘊(yùn)型慢性濕疹的血清代謝組學(xué)研究

唐毅 周瑤 陳敏 易小明 丁建國 魯昆 李煌

濕疹是由諸多內(nèi)外因素導(dǎo)致的一種過敏性炎癥性皮膚疾病, 患者多數(shù)病程較長, 易復(fù)發(fā), 易誘發(fā)急性發(fā)作, 癥狀劇烈, 嚴(yán)重影響患者的生活?，F(xiàn)代社會由于生活節(jié)奏加快、工作壓力上升、環(huán)境污染、化妝品濫用及生活飲食習(xí)慣、方式改變等因素的影響, 濕疹發(fā)病率逐年升高, 且各年齡段均可發(fā)生［1］。臨床常用激素類藥物對短期病程患者治療效果較好, 但對大部分病程較長的慢性濕疹患者來說, 長期應(yīng)用會帶來許多副作用及不良反應(yīng), 如耐藥性和復(fù)發(fā)率普遍較高。而屏障修復(fù)類藥物難以在短時間內(nèi)緩解患者急性期癥狀,用藥周期長, 價格較高。故提高濕疹的治療效果、減輕患者癥狀及控制復(fù)發(fā)率是研究的熱點(diǎn)［2］。中醫(yī)認(rèn)為濕疹的發(fā)病多為患者自身先天的稟賦不足, 加之后天飲食不節(jié), 致使脾胃健運(yùn)失常, 濕邪內(nèi)生, 若復(fù)感外邪, 內(nèi)外合邪, 多種邪氣相互交錯浸淫肌膚而發(fā)為本?。?,4］。臨床對常見的脾虛濕蘊(yùn)型濕疹患者, 多采用除濕胃苓湯加味對證化裁, 取得了不錯的臨床療效, 能較大程度提高治愈率、降低復(fù)發(fā)率和不良反應(yīng)發(fā)生率,可改善患者生活質(zhì)量［5-9］。進(jìn)一步研究除濕胃苓湯加減治療的具體作用機(jī)制, 可對濕疹的臨床用藥提供依據(jù)和參考。代謝組學(xué)作為與表型最為接近的組學(xué)方法,是目前了解中藥多靶點(diǎn)、多途徑機(jī)制有效的方法。對中藥復(fù)方采用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究, 既能夠從整體觀角度考察中藥復(fù)方的療效, 又能從生物標(biāo)志物及代謝通路層面考察中藥復(fù)方的作用機(jī)制, 比傳統(tǒng)的研究手段更具優(yōu)勢［10,11］。因此, 本研究選取脾虛濕蘊(yùn)型濕疹患者, 予以除濕胃苓湯加減治療, 從血清代謝組學(xué)的角度著手, 初步探討其作用機(jī)制。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取湖南省直中醫(yī)醫(yī)院皮膚科2021年3～11 月收治的10 例慢性濕疹門診患者進(jìn)行研究, 男4 例, 女6 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合慢性濕疹的中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②中醫(yī)辨證為脾虛濕蘊(yùn)型；③年齡18～65 歲；④病程≥3 個月；⑤近2 周未服用任何皮質(zhì)激素類藥物, 治療過程中未服用任何其他藥物；⑥未合并有嚴(yán)重心腦血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)、造血、肝腎、精神疾病者；⑦非過敏體質(zhì)者；⑧非妊娠期或哺乳期女性；⑨符合知情同意原則, 且簽屬知情同意書者。

1.2 治療方法 患者均采用單純中藥復(fù)方除濕胃苓湯加減治療。藥物組成：厚樸、蒼術(shù)、白鮮皮、地膚子各15 g, 豬苓、茯苓、防風(fēng)、白術(shù)各10 g, 白芍12 g, 山梔子、甘草各6 g, 滑石20 g, 陳皮8 g, 肉桂3 g, 隨癥加減。1 劑/d, 2 次/d, 水煎煮, 早晚分服。治療期間囑患者少食辛辣刺激、油炸食物, 保證新鮮蔬菜和水果的攝入量, 保持心情舒暢、作息時間規(guī)律。以15 d 為1 個療程,治療2 個療程后進(jìn)行療效評價及血清代謝組學(xué)研究。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清樣本收集與制備 收集10 例患者藥物干預(yù)前后空腹靜脈血5 ml, 常溫靜置20 min, 4℃條件下以3500 r/min 的速度離心處理10 min, 提取上清液, 轉(zhuǎn)移至凍存管, 并保存于-80℃冰箱中。另收集10 例無濕疹癥狀及病史的健康人血清作為健康對照血清組, 處理方法同患者治療前血清組(10 例)和患者治療后血清組(10 例), 待全部樣本收集完成后進(jìn)行代謝組學(xué)分析。取100 μl 血清與400 μl 甲醇/乙腈(V∶V, 1∶1)渦旋30 s, 超聲10 min(4℃水浴), -20℃下孵育1 h 后,在4℃條件下以13000 r/min 的速度離心15 min, 取上清液, 用真空濃縮器4℃下蒸發(fā)至干。加入100 μl 乙腈/水(H2O)(V ∶V, 1 ∶1), 渦旋30 s, 超聲10 min(4℃水浴),在4℃條件下以13000 r/min 的速度離心15 min 后, 取上清液進(jìn)行LC-MS 檢測。質(zhì)量控制樣品(QC 樣品)通過等比混合所有血清樣品組成, 按照同樣的方法處理,在樣品進(jìn)樣的不同時期進(jìn)樣以評價方法的穩(wěn)定性。

1.3.2 LC-MS 數(shù)據(jù)采集與分析 分析儀器為超高效液 相 色 譜 儀( 島 津Nexera UHPLC LC-30A)、Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。色譜分離條件：流速0.3 ml/min, 進(jìn)樣盤溫度：4℃, 柱溫：40℃,流動相：A 為H2O、B 為乙腈(均含0.1%甲酸), 進(jìn)樣量3 μl, 分別于正負(fù)離子模式下測定。正離子模式檢測條件：檢測范圍60～1000 m/z, 離子噴霧電壓5500 V, 離子源溫度：550℃, 霧化氣(GAS1)：55 psi、輔助氣(GAS2)：55 psi；負(fù)離子模式檢測條件：檢測范圍60～1000 m/z,離子噴霧電壓-4500 V, 離子源溫度：550℃, GAS1：55 psi、GAS2：55 psi。

1.4 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) ①比較患者治療前后的EASI 評分, 包括患處紅斑、水腫、鱗屑、苔蘚樣變、瘙癢程度等嚴(yán)重程度評價。②將三組應(yīng)用LC-MS 進(jìn)行血清樣品的分離和數(shù)據(jù)采集, 以PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 法篩選出相關(guān)差異代謝物, 通過KEGG 和HMDB 等開放數(shù)據(jù)庫對差異的標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 經(jīng)LC-MS 分析后獲得原始數(shù)據(jù),運(yùn)用Progenesis QI v2.3 程序?qū)υ紨?shù)據(jù)進(jìn)行處理, 包括基線過濾、峰識別與對齊、保留時間校正等。將正負(fù)離子數(shù)據(jù)合并, 得到的包括保留時間、離子模式和質(zhì)核比等信息的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA14.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行PCA、PLS-DA, 分析各組間代謝輪廓的總體差異, 以O(shè)PLS-DA 模型的變量重要性投影(variable important in projection, VIP)1.7 為條件篩選組間差異代謝物。利用SPSS21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t 檢驗, P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過KEGG 和HMDB 等開放數(shù)據(jù)庫對顯著差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析, 以RawP＜0.05 且Impact＞0 為條件進(jìn)行分析評價。

2 結(jié)果

2.1 患者治療前血清組、患者治療后血清組EASI評分比較 患者治療后血清組的EASI 評分(1.81±0.45)分明顯低于患者治療前血清組的(8.16±1.41)分,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.567, P=0.000＜0.01)。

2.2 三組代謝差異分析 分析三組LC-MS 數(shù)據(jù), PCA模型反映代謝組數(shù)據(jù)的原始狀態(tài), 可對樣本間差異進(jìn)行直觀顯示。PCA 分析圖顯示所有的QC 樣品較接近且聚集在原點(diǎn)附近。見圖1a。說明分析方法重復(fù)性和儀器系統(tǒng)穩(wěn)定性均較好, 可用于進(jìn)一步的組內(nèi)差異分析。PCA 3D 圖能更清晰地展示出三組樣本點(diǎn)雖有交叉點(diǎn), 但仍在空間分布上明顯分開, 且患者治療前血清組、患者治療后血清組分布相對集中, 可以看到患者治療前血清組血清中的代謝物與健康對照血清組相比發(fā)生了明顯變化。中藥干預(yù)后, 患者治療后血清組血清代謝輪廓則較集中地向著健康對照血清組方向靠攏。見圖1b。PLS-DA 得分圖顯示三組樣本點(diǎn)分離程度較好, 表明三組間代謝模式存在差異, 且三組樣本代謝變化情況具有同PCA 類似的趨勢。見圖2。為探究藥物作用的可能機(jī)制, 進(jìn)一步體現(xiàn)組間代謝差異, 結(jié)合OPLS-DA 分析法, 根據(jù)三組樣本點(diǎn)兩兩對比的得分圖,可見模型中兩組別均顯著地位于兩側(cè), 說明健康對照血清組和患者治療前血清組、患者治療前血清組與患者治療后血清組代謝數(shù)據(jù)之間均存在顯著差異。見圖3。

圖1 三組血清PCA 得分圖

圖2 三組血清PLS-DA 得分圖

圖3 三組血清OPLS-DA 得分圖

2.3 差異代謝物篩選 為進(jìn)一步探求組間分離的標(biāo)志變量, 基于OPLS-DA 模型的VIP(VIP＞1.7)和獨(dú)立樣本t 檢驗的P(P＜0.05), 從所有鑒定的化合物中篩選出42 種差異代謝物。見圖4。以患者治療前血清組出現(xiàn)顯著異常的代謝標(biāo)志物作為潛在藥物靶點(diǎn), 觀察藥物干預(yù)后的代謝物變化情況。結(jié)果顯示, 患者治療前血清組與健康對照血清組比較, 蘋果酸(malic acid)、油?；鈮A(oleylcarnitine)顯著上升, L-蛋氨酸(L-methionine)、丙?；鈮A(propionylcarnitine)、脫氧膽 酸(deoxycholic acid)、焦 谷 氨 酸(pyroglutamic acid)、甲基半胱氨酸(methylcysteine)、 谷氨酸肉堿(glutarylcarnitine)、L-蘇氨酸(L-threonine)、L-異蘇氨酸(L-allothreonine)、L-亮氨酸(L-leucine)、L-纈氨酸(L-valine)顯著下降；經(jīng)過除濕胃苓湯加減治療后, 以上12 種代謝物水平均出現(xiàn)顯著回調(diào), 接近健康對照血清組正常值, 提示這12 個代謝物及其相關(guān)通路變化是除濕胃苓湯加減治療脾虛濕蘊(yùn)型慢性濕疹的可能機(jī)制。

圖4 組間差異代謝物篩選

2.4 代謝通路分析 為進(jìn)一步解釋藥物作用的可能代謝機(jī)制, 通過KEGG 和HMDB 等開放數(shù)據(jù)庫對差異的標(biāo)志物進(jìn)行通路分析和富集分析。以RawP＜0.05 且Impact＞0 為條件進(jìn)行通路分析可得, 影響最大最顯著的是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑(D-Glutamine and D-glutamate metabolism)(Impact=0.5, P=0.002＜0.05)。見圖5。以P＜0.05 為條件, 富集分析結(jié)果可見, 富集程度最高的是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑(Valine, leucine and isoleucine biosynthesis)。見圖6。

圖5 差異標(biāo)志物代謝通路氣泡分析

圖6 差異標(biāo)志物代謝通路富集分析

3 討論

本研究屬于丁建國全國名老中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項目。丁建國教授指出, 脾虛濕蘊(yùn)證多由脾胃運(yùn)化功能失常及濕邪困阻脾胃所致, 脾失健運(yùn)使得水谷精微物質(zhì)的吸收和消化功能失常, 皮膚、胃腸道功能出現(xiàn)損傷, 繼而引起機(jī)體代謝功能紊亂。除濕胃苓湯加減治療脾虛濕蘊(yùn)型濕疹已獲得了明確的臨床療效, 本文現(xiàn)從血清代謝組學(xué)的角度研究其起效機(jī)制。代謝物是生物體表型的基礎(chǔ), 以此為切入點(diǎn)進(jìn)行研究, 能更直觀、有效地了解機(jī)體體內(nèi)受內(nèi)外界諸多因素干擾后發(fā)生的改變及其機(jī)制, 從而研究機(jī)體整體生物學(xué)狀況和功能調(diào)節(jié)。研究結(jié)果可見, 以患者治療前血清組出現(xiàn)顯著異常的代謝物作為潛在藥物靶點(diǎn), 篩選出的治療后較治療前顯著回調(diào)的12種代謝物中有7種是氨基酸、肽和類似物, 提示除濕胃苓湯加減治療脾虛濕蘊(yùn)型濕疹可能與調(diào)節(jié)氨基酸及其衍生物代謝相關(guān)。

進(jìn)一步的代謝通路分析得到影響最顯著和富集度最高的D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑及富集度較高的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑。谷氨酰胺是谷氨酸的酰胺, 是最基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)原料, 可由葡萄糖轉(zhuǎn)變而來, 通常作為補(bǔ)充身體儲存氨基酸的一種手段［12,13］。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸都是人體的必需氨基酸, 均為支鏈氨基酸, 它們共同促進(jìn)身體正常生長, 促進(jìn)骨骼、皮膚及受損肌肉組織的愈合, 調(diào)節(jié)血糖,并提供需要的能量［14-16］。這些主要代謝通路上的富集氨基酸在治療后均呈明顯上調(diào)趨勢。糖是人體的重要供能物質(zhì), 血糖水平能在一定程度上反映出機(jī)體能量代謝方面變化［17］。研究表明, 濕阻中焦證會影響機(jī)體葡萄糖代謝并導(dǎo)致葡萄糖代謝失衡［18］, 蒼附導(dǎo)痰湯加減方能通過調(diào)節(jié)患者的糖代謝紊亂治療痰濕型多囊卵巢綜合征合并胰島素抵抗［19］。綜合文獻(xiàn)報道和研究結(jié)果推測, 脾虛濕蘊(yùn)型慢性濕疹患者體內(nèi)存在能量代謝紊亂, 而健脾利濕辨證治療可以通過D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)能量代謝, 從而達(dá)到治療作用。

另外, 氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位, 對免疫系統(tǒng)有著重要的作用。谷氨酰胺能促進(jìn)腸道免疫功能, 為腸黏膜上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞提供能量, 在維持腸道淋巴組織及合成分泌型免疫球蛋白(SIgA)中發(fā)揮重要作用。蘇氨酸是富集于纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑中的代謝物, 是合成小腸黏液蛋白的重要成分, 具有維持機(jī)體正常生長發(fā)育及免疫調(diào)節(jié)的作用［20-22］。由于蘇氨酸的結(jié)構(gòu)中含有羥基, 對人體皮膚具有持水作用, 與寡糖鏈結(jié)合, 對保護(hù)細(xì)胞膜起重要作用。纈氨酸和異亮氨酸作為可通過轉(zhuǎn)氨基作用生成琥珀酰輔酶A, 在琥珀酸硫激酶的作用下生成琥珀酸, 琥珀酸是先天免疫信號的代謝物［23］。

綜上所述, 除濕胃苓湯加減可能通過調(diào)控氨基酸及其衍生代謝等途徑調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝和免疫功能來治療脾虛濕蘊(yùn)型慢性濕疹。除濕胃苓湯加減治療脾虛濕蘊(yùn)型慢性濕疹的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝和免疫功能有關(guān), 對進(jìn)一步靶向代謝組學(xué)及慢性濕疹不同證型研究提供一定的參考意義。