Fe3O4磁性熒光傳感器檢測真菌毒素的研究進展

賀 文，郝麗坤，劉 瑋，李 寧

（濱州醫(yī)學院公共衛(wèi)生與管理學院，山東 煙臺 264003）

真菌毒素作為真菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的有毒代謝物，能夠損傷肝臟、腎臟等組織器官，還可影響神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，具有致癌性、致畸性。其分子質量小、結構穩(wěn)定，且高溫下不易被破壞，因此糧食、飼料以及農(nóng)產(chǎn)品在儲存和加工過程中易受到真菌毒素污染，毒素通過食物鏈進入人體并在人體富集，對人體健康危害巨大[1-2]。食品中真菌毒素污染已成為全球性問題，據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計，全球糧食有25%受到真菌毒素污染[3]。常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）、赭曲霉毒素（ochratoxins，OT）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、伏馬菌素（fumonisins，F(xiàn)B）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等。

目前國內(nèi)外對真菌毒素常規(guī)的檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質譜法（liquid chromatogram tandem mass spectrometry，LC-MS）、薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、免疫分析法（酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫層析法（colloidal gold immune chromategraphic assay，GICA）等）等。前兩種方法雖然在真菌毒素檢測方面具有靈敏度高、分析準確、能夠同時檢測多組分等優(yōu)點，但其通常需要大型精密儀器，且樣品前處理復雜、建立分析方法耗時、需要專業(yè)人員操作，不能滿足大批量樣品的快速檢測需求[4]。免疫分析法具有特異性強、靈敏度高的特點，目前已有商品試劑盒和試紙條投入使用，但在復雜基質中難以完全避免假陽性、假陰性等結果，且抗原抗體不易制備、易變性、儲存條件苛刻，因此在真菌毒素的檢測應用中受到限制[5-6]。生物傳感器法是利用生化識別元件對分析物進行特異性識別的一種方法，具有特異性好、靈敏度高、簡單快速、檢測成本低等特點，能夠實現(xiàn)微型化和集成化以及可實時在線監(jiān)測，是檢測復雜樣品中痕量真菌毒素的良好選擇[7-8]。

近年來，隨著納米技術的發(fā)展，各種類型的生物傳感器被廣泛應用于真菌毒素檢測領域中，例如電化學傳感器、熒光生物傳感器、磁性生物傳感器等[9-12]，納米材料的發(fā)展也有助于生物傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性的改善，其中磁性納米材料具有比表面積大、磁響應性強、生物相容性好等特點，可有效實現(xiàn)被測物與檢測探針在樣品基質中的快速分離與富集濃縮，在傳感器構建與生物即時檢測等領域均得到廣泛應用[13]。近年來生物傳感器應用于真菌毒素檢測的研究越來越多，但鮮見磁性熒光雙功能生物傳感器應用于真菌毒素檢測的綜述，因此本文主要綜述近年來Fe3O4磁性納米顆粒與有機熒光材料、量子點、上轉換納米材料顆粒（upconversion nanoparticles，UCNPs）、金屬納米簇、熒光碳納米材料相結合的磁性熒光雙功能生物傳感器在真菌毒素檢測領域應用與研究的最新進展。

1 Fe3O4磁性納米材料

磁性納米材料是以尺寸在納米至微米級別的鐵、錳、鈷、鎳及其金屬化合物為基礎的材料。相比錳、鈷、鎳的金屬化合物，鐵氧化物為核心的磁性納米材料具有良好的磁性、高兼容性、易改性和低成本的特點，最為常用[14-15]。鐵氧化物作為廣泛使用的磁性納米材料，包括磁鐵礦納米顆粒（F e3O4）、赤鐵礦納米顆粒（α-Fe2O3）、磁赤鐵礦納米顆粒（γ-Fe2O3）[16-18]。其中Fe3O4納米顆粒是由最佳配比2∶1的Fe3＋和Fe2＋構成，其反尖晶石結構由位于面心緊密堆積的O2-離子與占據(jù)8 個四面體和16 個八面體位點的鐵離子構成。由于Fe3＋離子與Fe2＋離子的電子性質，在晶體中不會相互抵消電子自旋，而且晶體由兩種陽離子所穿插的四面體和八面體的磁性子格組成，大小不同，從而產(chǎn)生磁性。Fe3O4納米顆粒在室溫條件且尺寸小于30 nm時具有超順磁性，備受研究者關注[19-20]。

由于單一Fe3O4磁性顆粒具有耐酸堿能力差、極易被氧化、易團聚的缺點，其應用受到限制，因此需要對Fe3O4顆粒進行修飾，例如利用二氧化硅[21]和殼聚糖[22]對磁性顆粒進行改性等，在保證超順磁性的同時提高其化學穩(wěn)定性。修飾后的Fe3O4磁性納米顆粒具有順磁性、磁響應強、化學性質穩(wěn)定、比表面積大、良好的生物相容性、低毒性等特點，在生物檢測、癌癥治療、磁共振成像等領域得以廣泛應用[23-26]。

2 熒光生物傳感器

熒光生物傳感器是指通過具有熒光效應的材料標記檢測物，根據(jù)熒光信號變化進行檢測的一類生物傳感器，由于具有高靈敏度和特異性的特點，在真菌毒素檢測中受到研究者的廣泛關注[27-28]。常見的熒光材料主要包括有機熒光染料、熒光蛋白、熒光素、量子點、上轉換納米材料、金屬納米簇、熒光碳納米材料等。傳統(tǒng)熒光材料常采用熒光染料，其激發(fā)光譜窄、發(fā)射光譜寬且不對稱、易發(fā)生光漂白、光穩(wěn)定性差、檢測靈敏度低，因此其在生物醫(yī)學領域中的應用受到限制[29]。而新型的熒光材料（量子點、上轉換納米材料、金屬納米簇、熒光碳納米材料等）與之相比具有更好的光穩(wěn)定性以及可調控的粒徑，而且有些熒光納米材料的發(fā)光在近紅外光譜范圍，在進行檢測時背景干擾小，可以提高檢測靈敏度[30-31]。由于新型熒光材料特殊的光學特性，使其在醫(yī)學和生物檢測領域受到研究者的廣泛重視。

3 Fe3O4磁性熒光傳感器的應用

3.1 Fe3O4磁性納米顆粒與有機熒光材料

傳統(tǒng)的有機熒光染料使用條件相對簡單、色彩純度高、色彩豐富，是研究者最常使用的熒光材料。苝是一種稠環(huán)芳香烴分子，苝衍生物是以苝為主體結構衍生出的一類稠環(huán)化合物。苝衍生物作為光學傳感器中的熒光探針，雖然具有高熒光量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性，但由于其芳基分子間強烈的π-π作用，形成聚集體，其熒光容易猝滅，因此Wang Bin等[32]通過有機溶劑中苝聚合體的解離建立了熒光信號放大的適配體光學傳感器，并利用其檢測黃曲霉毒素B1（af latoxins B1，AFB1）（圖1）。磁性納米材料與AuNPs通過適配體及互補DNA（complementary DNA，cDNA）鏈連接，當AFB1與適配體特異性識別并經(jīng)磁分離后，AuNPs-DNA復合物會釋放到末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxyribonucleotidyl transferase，TdT）溶液中，從而延長DNA鏈。延長的DNA鏈通過靜電作用組裝更多的苝衍生物探針（DNA-induced aggregation of a perylene probe，PAPDI），起到放大信號的作用。在乙醇中，PAPDI的π-π堆積作用減弱導致熒光恢復。通過熒光強度的變化能夠定量檢測AFB1，該方法檢測限可低至3.1 pg/mL。

圖1 基于TdT擴增策略和PAPDI聚合的AFB1適配體傳感器示意圖[32]Fig.1 Schematic illustration of aflatoxin B1 aptasensor based on TdT amplification strategy and PAPDI aggregation[32]

N-甲基中卟啉IX（N-methyl mesoporphyrin IX，NMM）作為一種水溶性的非對稱卟啉，具有優(yōu)良的光學性能，并對G-四聯(lián)體結構DNA具有高度選擇性。作為一種有機熒光染料，NMM在水溶液中只有輕微的熒光強度，但與G-四聯(lián)體結合可以起到放大熒光信號的作用[33]。因此Zhang Fuyuan等[34]構建了一種自催化核酸外切酶III（exonuclease III，Exo-III）輔助信號放大的熒光適配體傳感器，用以檢測黃曲霉毒素M1（aflatoxins M1，AFM1）（圖2）。將適配體及其cDNA鏈固定在磁珠上，AFM1存在時，先與適配體結合導致cDNA脫離出來，經(jīng)磁分離后溶液中的cDNA會在Exo-III的存在下進行下一步反應。Exo-III在這個擴增過程中作為放大生物催化劑，選擇性地水解3’端雙鏈DNA，以產(chǎn)生具有G-四聯(lián)體結構的富鳥嘌呤DNA鏈，NMM與G-四聯(lián)體結構結合后可以放大熒光信號，其方法實際檢出限為9.73 ng/kg。該方法的檢測示意圖見圖2。

圖2 基于Exo III輔助信號放大的AFM1敏感熒光檢測示意圖[34]Fig.2 Schematic representation of sensitive fluorescent detection of aflatoxin M1 based on Exo III assistant signal amplification[34]

Becheva等[35]利用不同的熒光材料及抗原與抗體之間的競爭性免疫反應原理，對赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）和葡萄球菌腸毒素A（Staphylococcalenterotoxin A，SEA）進行檢測。將OTA與雞卵白蛋白（ovalbumin，OVA）和熒光染料ATTO620偶聯(lián)的熒光結合物OTA-OVA-ATTO620與OTA抗體功能化Fe3O4磁性納米顆粒結合，SEA與異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）的熒光結合物SEA-FITC和SEA抗體功能化Fe3O4磁性納米顆粒結合。當目標毒素存在時，基于競爭性免疫反應原理導致熒光結合物與Fe3O4磁性納米顆粒分開，磁分離后熒光結合物會留在溶液中，測定不同熒光結合物的熒光信號從而實現(xiàn)對OTA和SEA的定量檢測。此法可同時對OTA和SEA進行檢測，OTA與SEA檢出限均為0.004 ng/mL，20 min可完成檢測，是一種快速有效的檢測方法。該團隊采用同樣的方法檢測AFB1，檢出限低至0.9 pg/mL，檢測時間不超過35 min[36]。

熒光素及其衍生物由于自身的高熒光特性，能夠作為熒光標記物或熒光探針應用于生物傳感器中[37]，其中羧基熒光素（carboxy-fluorescein，F(xiàn)AM）應用最為廣泛。唐淑閣[38]利用FAM建立了磁性-熒光適配體檢測AFB1的方法，即AFB1適配體修飾的Fe3O4磁性納米顆粒與FAM標記的cDNA鏈結合，AFB1存在時先與適配體反應，導致FAM標記的cDNA鏈釋放到溶液中，測定溶液中FAM熒光強度變化可實現(xiàn)對AFB1的定量檢測，檢出限為2.59 ng/mL。郭婷等[39]則根據(jù)熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）原理，利用磁性納米材料的熒光猝滅能力，制備了檢測AFM1的熒光適配體傳感器。FAM標記的AFM1適配體通過靜電作用被吸附到Fe3O4納米顆粒表面，導致FAM熒光猝滅。AFM1存在時，F(xiàn)AM標記的適配體遠離Fe3O4磁性納米顆粒，F(xiàn)AM熒光信號恢復，可根據(jù)熒光信號恢復程度對AFM1進行定量檢測，該方法檢測限為0.02 μg/L。Ma Liang等[40]同樣基于FRET原理構建了熒光生物傳感器，用以檢測展青霉素（patulin，PAT）（圖3）。FAM標記的PAT適配體通過π-π疊加作用被吸附到磁化還原氧化石墨烯（rGO-Fe3O4）表面，F(xiàn)AM熒光被猝滅。FAM標記的PAT適配體在與加入的PAT結合后遠離rGO-Fe3O4，F(xiàn)AM熒光信號恢復，PAT與適配體復合物在脫氧核糖核苷酸酶I（DNase I）的作用下參與循環(huán)裂解反應，進一步放大FAM熒光信號。DNase I的加入只裂解PAT與適配體的復合物，裂解出來的PAT會繼續(xù)參與反應，讓更多的FAM得以釋放，熒光信號增強，該方法的檢出限為0.28 μg/L，靈敏度比不使用DNase I策略高13 倍。

圖3 基于核酸適配體的熒光PAT檢測示意圖[40]Fig.3 Schematic illustration of aptamer-based fluorescent patulin detection[40]

熒光蛋白作為一種新型有機熒光材料，克服了傳統(tǒng)有機染料背景干擾高、易猝滅的缺點，幾乎能夠覆蓋所有可見光范圍，作為熒光探針和熒光標記物廣泛應用于生物醫(yī)藥領域[41-42]。孫亞寧等[43]以DON為目標物，將Fe3O4磁性納米顆粒與綠色熒光蛋白以及DON單克隆抗體進行偶聯(lián)，制成磁熒光抗體探針，用于制備磁熒光免疫層析試紙。該方法制作的DON磁熒光免疫層析試紙檢測限為1.089 ng/mL，相較于膠體金免疫層析試紙的檢測限（11.94 ng/mL），靈敏度提高了11.6 倍。

3.2 Fe3O4磁性納米顆粒與量子點

量子點又稱半導體納米晶，是由II～IV族（CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等）或者III～IV族元素（InP、InAs等）組成的三維尺寸在納米級的粒子，依靠半導體間隙的量子限制效應發(fā)光。當前研究較多的是鎘元素量子點CdX（X＝S、Se、Te）、碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）與石墨烯量子點（graphene quantum dots，GQDs）。量子點具有量子產(chǎn)率較高、吸收光譜寬等特性，其優(yōu)異的發(fā)光性能使其能夠作為熒光探針應用于生物傳感器中[44]。

李響[45]將OTA適配體修飾的Fe3O4磁性納米顆粒與cDNA鏈修飾的CdTe量子點結合并對OTA進行檢測。OTA的存在致使Fe3O4磁性納米顆粒與CdTe量子點分離，磁分離后檢測上清液中量子點的熒光強度可以實現(xiàn)對OTA的定量檢測，檢出限為5×10-11g/mL。此外，還可利用磁性量子點檢測AFB1、T-2毒素等真菌毒素[46-47]。

同一激發(fā)光源下能夠對多個量子點進行激發(fā)，可以同時檢測多種目標物。李響[48]利用此性質，將不同發(fā)射波長的CdTe發(fā)光量子點分別標記于AFB1、OTA的抗體上作為熒光指示探針，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子與AFB1、OTA抗原結合形成捕獲探針，抗體抗原相互結合使量子點與磁性顆粒連接在一起。當AFB1和OTA存在時基于競爭性免疫反應原理，量子點與Fe3O4磁性納米粒子分離，磁分離后檢測上清液中不同發(fā)射波長量子點的熒光信號強度可實現(xiàn)對AFB1和OTA的定量檢測。AFB1與OTA的檢出限分別為1.0×10-10g/mL和5×10-11g/mL。相比之下，Qian Jing等[49]所研制的同時測定OTA和AFB1的磁控熒光適配體傳感器，利用金殼包覆的Fe3O4磁性納米材料可與硫代適配體通過Au-S鍵結合，且適配體對目標真菌毒素的選擇性更強，具有更高的靈敏度。OTA和AFB1適配體通過Au-S共價鍵連接到Fe3O4@Au磁珠上，與OTA、AFB1適配體互補的cDNA分別修飾SiO2包覆的綠色CdTe量子點與紅色CdTe量子點，經(jīng)適配體與cDNA雜交后，量子點與Fe3O4@Au磁珠結合。加入目標物OTA和AFB1并經(jīng)磁分離后，溶液中剩下量子點，通過檢測不同顏色量子點的熒光信號可實現(xiàn)對OTA和AFB1的定量檢測。該方法對OTA與AFB1檢測限分別低至0.67 pg/mL和1.70 pg/mL。該方法操作簡單、檢測時間短、選擇性好、靈敏度高，為高通量篩選雙真菌毒素提供了新的途徑。

相較于利用鎘元素制備的量子點，CQDs和GQDs具備無毒害作用、對環(huán)境影響小、生物相容性好、發(fā)光性能優(yōu)異，且更易進行功能化修飾等優(yōu)點[50-51]。曾云龍等[52]以自組裝方式制備Au@Fe3O4/核酸適配體/氨基-CQDs磁性納米復合物（Au@Fe3O4NPs/Apt/N-CQDs）用于檢測AFB1，檢測限為0.3 pg/mL。Wang Chengke等[53]建立了一種雙磁分離輔助熒光法檢測OTA的方法，將OTA適配體功能化的Fe3O4磁性納米材料（Fe3O4-Aptamer）與cDNA鏈偶聯(lián)的氮摻雜石墨烯量子點（NGQDs-cDNA）結合，第一次磁分離去除未結合的NGQDs-cDNA。OTA加入后與適配體反應，NGQDs-cDNA釋放到溶液中，通過第二次磁分離去除未結合的復合物和已反應的Fe3O4-Aptamer以減少背景干擾，通過測定溶液中NGQDs熒光強度實現(xiàn)對OTA的定量檢測，檢出限為0.66 nmol/mL。

3.3 Fe3O4磁性納米顆粒與上轉換納米材料

上轉換納米材料是由無機納米基質和摻雜的鑭系稀土元素組成粒徑小于100 nm的材料，與其他熒光材料不同的是，其遵循Anti-Stokes發(fā)光規(guī)律，能夠在紅外線激發(fā)下發(fā)出可見光。上轉換納米材料由于具有良好的光穩(wěn)定性、Anti-Stokes位移大、熒光背景低、發(fā)射波長窄等特點，有利于其在生物檢測、醫(yī)學成像、腫瘤治療等領域的應用[54-55]。

規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）蛋白在基因編輯領域中具有重要的影響，其中CRISPR-Cas12a蛋白不僅具有靶向切割雙鏈DNA和單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）的順式切割能力，還具有反式切割任何ssDNA的切割活性。Mao Zefeng等[56]利用CRISPR-Cas12a蛋白對DNA鏈獨特的切割能力建立了CRISPR-Cas12a熒光生物傳感系統(tǒng)，并用于檢測OTA（圖4）。OTA存在時，優(yōu)先與適配體反應，導致其cDNA鏈脫離，通過CRISPR-Cas12a識別后，對UCNPs-ssDNA-Fe3O4熒光探針中的ssDNA進行切割，導致熒光探針斷裂，經(jīng)磁分離后，測定上清液中UCNPs熒光強度變化從而實現(xiàn)對OTA的定量檢測，線性檢測范圍和檢出限分別為5～100 ng/mL和0.83 ng/mL。UCNPs-ssDNA-Fe3O4熒光探針與傳統(tǒng)CRISPR-Cas12a熒光探針相比具有更寬的線性檢測范圍和更低的檢出限，以及更穩(wěn)定的樣品回收率。

圖4 上轉換介導的CRISPR-Cas12a生物傳感器檢測OTA示意圖[56]Fig.4 Schematic diagram of up-conversion-mediated CRISPR-Cas12a biosensor for detection of ochratoxin A[56]

UCNPs一般由基質材料、激活劑（發(fā)光中心）以及敏化劑構成，通過調節(jié)UCNPs所摻雜鑭系元素離子濃度可制備多色可調的UCNPs。Li Jingzhi等[57]同樣基于競爭性免疫反應原理建立了一種磁性熒光傳感器同時檢測伏馬菌素（fumonisin B1，F(xiàn)B1）和ZEN。結合FB1和ZEN抗原的UCNPs分別與FB1和ZEN抗體功能化Fe3O4磁性納米粒子結合。當FB1和ZEN存在時，基于競爭性免疫反應原理使得UCNPs脫落，在980 nm波長近紅外光激發(fā)下，分別在發(fā)射波長480 nm和550 nm處對FB1和ZEN進行檢測，檢出限分別為0.016 ng/mL和0.012 ng/mL。還可利用多色UCNPs同時檢測噬菌靈和OTA[58]，也可以同時檢測OTA和ZEN[59]。利用UCNPs的多色標記特性，有望進一步實現(xiàn)多組分同時檢測，多色UCNPs在食品安全和傳感領域中有巨大的應用潛力。

3.4 Fe3O4磁性納米顆粒與金屬納米簇

金屬納米簇通常由幾個到幾十個金屬原子組成，粒徑通常小于2 nm，尺寸與費米波長相當，在該尺寸范圍內(nèi)金屬納米簇具有半導體的特征，自由電子的強量子限域效應導致電子能級從連續(xù)態(tài)分裂成分立能級，金屬納米簇不再具有明顯的表面等離子共振吸收，從而能夠在可見光到近紅外區(qū)域強烈發(fā)光[60]。金屬納米簇主要包括金納米簇（AuNPs）、銀納米簇（AgNPs）、銅納米簇（CuNPs）等以及各種合金納米簇。金屬納米簇具有合成方法簡單、易于進行表面功能化、生物相容性良好、穩(wěn)定性好、毒性低、發(fā)光能力強等特點。由于金屬納米簇極佳的熒光性能，在生物傳感領域具有廣闊的應用前景[61]。

DNA的磷酸骨架與金屬離子之間具有靜電作用，含氮堿基（腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C））與金屬之間有較強的配位作用，可通過金屬離子與配位點結合并在還原劑的作用下制備尺寸可調、熒光發(fā)射波長和強度可調、光穩(wěn)定性高的金屬納米團簇，例如金、銀、銅均能夠以DNA作為模板合成金屬納米簇[62-63]。有研究表明引物DNA在TdT與脫氧胸苷三磷酸（2’-deoxythymidine 5’-triphosphate，dTTP）存在時，TdT可直接催化短寡核苷酸片段從5’端到3’端延伸形成多聚胸腺嘧啶序列，且當TdT濃度增加時，多聚胸腺嘧啶序列變長，CuNPs尺寸增加，熒光也會發(fā)生變化[64]。He Yue等[65]利用該方法制備熒光傳感器來檢測OTA。將OTA的適配體及其cDNA鏈固定在磁珠上，OTA存在時，先與適配體結合，此時暴露cDNA。經(jīng)過磁分離后的cDNA作為引物觸發(fā)TdT與dTTP介導的聚合反應，此過程會形成多聚胸腺嘧啶，其能夠作為合成CuNPs的模板，通過合成的CuNPs熒光強度變化，對OTA進行定量檢測。該方法靈敏度高，檢測限為2.0 nmol/L。AgNPs同樣能夠與DNA結合作為生物傳感器對真菌毒素進行檢測。Zhang Man等[66]采用適配體生物傳感器對T-2毒素進行檢測（圖5）。將T-2毒素的適配體及其cDNA鏈固定在磁珠上，T-2毒素存在時，會與修飾在磁珠上的適配體優(yōu)先結合，導致cDNA脫落。磁分離獲得的cDNA能夠作為引物觸發(fā)指數(shù)等溫擴增反應（exponential isothermal amplification reaction，EXPAR）獲得ssDNA，富含堿基的ssDNA結合并還原Ag離子形成AgNPs，可通過測定其熒光變化來檢測T-2毒素，檢出限低至30 fg/mL。

圖5 基于EXPAR和AgNC擴增策略檢測T-2毒素示意圖[66]Fig.5 Schematic diagram of detection of T-2 toxin based on exponential isothermal amplification reaction (EXPAR) and AgNC amplification strategy[66]

3.5 Fe3O4磁性納米顆粒與熒光碳納米材料

熒光碳納米材料主要包括多壁碳納米管、氧化石墨烯納米材料、CQDs和石墨烯量子點等。此類納米材料由于具有低毒性、生物兼容性好的特征，在生物檢測領域具有潛在的應用價值[67-70]。

石墨烯材料由于其特殊的熒光特性和熒光猝滅效應，經(jīng)常被用來構建熒光生物傳感器，在傳感過程中擔任FRET受體猝滅劑的角色[71-72]。氧化石墨烯與還原氧化石墨烯作為石墨烯的衍生物，同樣具有猝滅劑的效果。Wang Chengquan等[73]提出了一種多路FRET適配體傳感器，用于檢測AFB1和FB1。以磁控氧化石墨烯（GO/Fe3O4）為能量受體，AFB1和FB1的適配體修飾的綠色和紅色CdTe量子點作為雙能量供體，通過適配體與GO/Fe3O4的π-π疊加作用發(fā)生FRET猝滅量子點熒光。目標物存在時與適配體反應，量子點與GO/Fe3O4分離，熒光信號恢復，通過測定溶液中不同發(fā)射峰量子點熒光信號的變化可對AFB1和FB1進行定量檢測。與傳統(tǒng)基于GO猝滅劑的FRET系統(tǒng)相比，GO/Fe3O4作為單一能量受體，不僅可以同時猝滅不同發(fā)射峰綠色和紅色量子點的熒光，還可以通過有效的磁分離去除背景干擾。加入的GO/Fe3O4與綠色量子點和紅色量子點標記的適配體之間存在π-π疊加作用，使量子點原本熒光猝滅。AFB1和FB1的檢出限分別為6.7 pg/mL和16.2 pg/mL。Zhang Xiya等[74]利用單克隆抗體（mAb）功能化磁性還原氧化石墨烯（rGO-Fe3O4-mAb）作為能量受體，以四甲基異硫氰酸羅丹明標記的AFB1（AFB1-TRCA）作為能量供體，通過抗體抗原相互結合發(fā)生FRET猝滅TRCA熒光。AFM1存在時，基于競爭性免疫反應原理導致AFB1-TRCA脫離能量受體，F(xiàn)RET消失，TRCA熒光恢復，利用熒光變化檢測AFM1，檢出限為3.8 ng/L，低于使用相同免疫試劑的熒光免疫分析法，并可在10 min內(nèi)完成檢測。

3.6 鑭系元素及其螯合劑

除以上熒光材料外，還可利用鑭系元素及其螯合劑作為熒光標記物。時間分辨熒光分析技術便是依靠鑭系元素的熒光壽命長、Stokes位移大、熒光發(fā)射峰窄和激發(fā)光譜寬等熒光性質，具有高效率、高特異性和高靈敏度的檢測方法[75]，常用的鑭系元素有銪（Eu）和鋱（Tb）。Niazi等[76]利用時間分辨熒光技術制備了檢測ZEN的適配體傳感器，即適配體修飾的Fe3O4磁性納米粒子與cDNA鏈修飾的時間分辨熒光納米顆粒（NaYF4: Ce/Tb）結合，目標物存在且磁分離后，檢測上清液中熒光強度實現(xiàn)對ZEN的定量檢測，檢出限為0.21 pg/mL。該團隊也利用時間分辨熒光分析技術制備了能夠同時檢測玉米中的OTA和FB1適配體傳感器，OTA和FB1的檢出限分別為0.015 pg/mL和0.019 pg/mL[77]。但利用鑭系元素及其螯合劑作為熒光標記物，具有放射性，對人體健康有害。近年來，基于磁性熒光雙功能生物傳感器檢測真菌毒素的相關研究基本信息見表1。

表1 磁性熒光雙功能生物傳感器在真菌毒素檢測中的應用Table 1 Applications of magnetic and fluorescent biosensors in the analysis of mycotoxins

4 結語

綜上所述，大部分磁性熒光雙功能生物傳感器的識別元件以抗體-抗原、適配體為主，以熒光納米材料作為信號探針。但抗體-抗原制備成本高、不易保存、儲存條件嚴格等缺點限制了其應用，應注重發(fā)展制備成本低，結構穩(wěn)定的抗體識別元件。適配體與抗體相比，具有分子質量小、易合成、成本低、結構穩(wěn)定等特點，更適合作為生物傳感器的識別元件，基于適配體及其互補DNA鏈的酶輔助信號放大和DNA擴增技術等方法，可以為熒光生物傳感器提供更高的靈敏度。將磁性納米材料引入熒光生物傳感器中，可憑借磁性納米材料的高比表面積使競爭反應能夠高效進行，并且通過外部磁場可有效地分離或富集競爭反應產(chǎn)物或未反應的檢測探針，用于熒光信號檢測，能夠有效排除背景干擾，提高檢測靈敏度和檢測速度。

目前雖已研究出靈敏度較高的磁性熒光雙功能生物傳感器，但也存在一些問題：1）基于適配體的DNA擴增反應以及酶輔助信號放大的方法，往往需要專業(yè)設備，而且操作復雜，不適用于大規(guī)?，F(xiàn)場快速檢測；2）量子點和稀土元素的熒光強度雖然高，但由于量子點合成成分中含有鎘等重金屬元素以及稀土元素具有的放射性，對人體有害，因此在應用過程中應注意防護以及回收處理；3）大多數(shù)常用熒光團的熒光壽命較短，且不穩(wěn)定；4）樣品基質復雜、干擾因素多，會影響靈敏度。

未來需對納米材料的化學穩(wěn)定性進行研究，特別是提高納米材料的熒光穩(wěn)定性，面對多種污染物復雜的情況可以開發(fā)多種真菌毒素檢測的平臺。納米材料以及納米技術的發(fā)展能夠為多種模式同時檢測（電化學檢測、熒光檢測等）提供幫助，提高樣品基質的抗干擾能力，同時可開發(fā)基于DNA擴增技術的簡便儀器，為大規(guī)?，F(xiàn)場篩查提供可能。磁性熒光雙功能生物傳感器中的磁性不僅僅可以用于磁分離，還可以作為磁信號探針使用，其穿透力強、受樣品基質干擾小，可作為一種檢測手段。