依托咪酯對(duì)心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌損傷的影響

陳祖喬,王 芳,尹濤源

缺血性心臟病具有較高的發(fā)病率和死亡率,缺血后,由手術(shù)或藥物引起的溶栓再灌注可能進(jìn)一步促進(jìn)心臟損害,這種現(xiàn)象稱(chēng)為心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)損傷[1-2]。MI/R損傷的潛在機(jī)制尚未明確,關(guān)鍵因素包括能量代謝紊亂、氧化應(yīng)激、鈣超載、心肌細(xì)胞凋亡、自噬及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[3]。在臨床上,MI/R損傷對(duì)病人的治療策略有較大影響,可能引發(fā)一系列不良并發(fā)癥,通過(guò)干預(yù)MI/R損傷后心肌內(nèi)相關(guān)反應(yīng)可延緩或減輕心肌損傷,是改善MI/R損傷的重要策略。

依托咪酯是一種非巴比妥類(lèi)靜脈鎮(zhèn)靜藥,也是咪唑衍生物靜脈麻醉劑,通過(guò)與外周α2B受體結(jié)合,引起外周血管收縮,并在誘導(dǎo)麻醉期間維持穩(wěn)定的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)[4]。依托咪酯可避免麻醉誘導(dǎo)后低血壓發(fā)生,降低心肌損傷發(fā)生率,改善心臟術(shù)后病人預(yù)后[5]。相關(guān)研究表明,依托咪酯對(duì)腦缺血再灌注與MI/R損傷均有一定的保護(hù)作用[6-7]。本研究通過(guò)構(gòu)建MI/R大鼠模型,觀察依托咪酯對(duì)MI/R大鼠心肌功能的作用基礎(chǔ)上探討可能作用的相關(guān)機(jī)制,并測(cè)定其對(duì)脂代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠65只,雄性,6～8周齡,體質(zhì)量260～300 g,由海南藥物研究所有限責(zé)任公司提供。將大鼠飼養(yǎng)于無(wú)菌動(dòng)物飼養(yǎng)箱內(nèi),環(huán)境溫度22～25 ℃,相對(duì)濕度40%～50%,12 h/12 h晝夜交替,期間大鼠自由飲水、攝食。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

依托咪酯[江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):H20020511;規(guī)格:10 mL(20 mg)];酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(R&D Systems公司);總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)定試劑盒(北京中生生物工程公司),脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物研究所);末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京博奧森生物公司);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Millipore公司);抗體Beclin-1、p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ(英國(guó)Abcam公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒和增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光(ECL)溶液(南京凱基生物有限公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物模型制備

大鼠消毒后,注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉,將其仰臥固定在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,氣管插管并連接動(dòng)物呼吸器進(jìn)行機(jī)械通氣,并進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)。在大鼠左側(cè)第3肋骨、第4肋骨處約0.5 cm處剪開(kāi)皮膚,進(jìn)行開(kāi)胸剖腹手術(shù),剪開(kāi)心包,使心臟完全暴露,使用6-0絲線穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支下約2 mm作一活結(jié)結(jié)扎,阻塞左冠狀動(dòng)脈前降支,結(jié)扎30 min,松開(kāi)結(jié)扎線后再灌注120 min,觀察缺血時(shí)心電圖出現(xiàn)ST段抬高或T波高聳,心肌組織顏色發(fā)白,呈發(fā)紺狀,缺血區(qū)在再灌注后心電圖S-T段下移50%以上,心肌顏色逐漸恢復(fù)為紅色,提示MI/R損傷模型制備成功[8],之后立即關(guān)閉胸腔,縫合腹部切口,消毒后置于無(wú)菌動(dòng)物飼養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠僅暴露心臟,不進(jìn)行結(jié)扎,其余操作均相同。術(shù)后給予大鼠注射1.5 mL/kg的硫酸慶大霉素,每日1次,持續(xù)3 d,避免傷口感染。

1.4 動(dòng)物分組與處理

50只SD大鼠制備MI/R模型,造模過(guò)程中有5只大鼠失敗或死亡。將45只大鼠隨機(jī)分為心肌缺血再灌注組(MI/R組)、依托咪酯低劑量組和依托咪酯高劑量組,每組15只;另取15只SD大鼠制備假手術(shù)模型,作為假手術(shù)組。術(shù)后參照文獻(xiàn)[7],依托咪酯低劑量組和依托咪酯高劑量組大鼠分別腹腔注射10、20 mg/kg的依托咪酯,假手術(shù)組和MI/R組注射等體積生理鹽水,每日1次,持續(xù)14 d。

1.5 心功能指標(biāo)測(cè)定

給藥結(jié)束后,利用小動(dòng)物BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司,批號(hào):2014012)評(píng)估各組大鼠心功能參數(shù)變化。注射10%水合氯醛麻醉大鼠,將其固定在手術(shù)臺(tái)上,進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查,測(cè)定射血分?jǐn)?shù)(EF)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)及左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。

1.6 心肌損傷指標(biāo)及脂代謝指標(biāo)測(cè)定

給藥結(jié)束后,經(jīng)大鼠尾靜脈采血2 mL,室溫靜置2 h后,將采集到的各組大鼠血液置于4 ℃低溫離心機(jī)中,以4 000 r/min離心20 min,制備血清、血漿。將樣品加入各反應(yīng)孔,使用大鼠特異性ELISA試劑盒檢測(cè)血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、乳酸脫氫酶(LDH)含量;按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TC、TG、HDL-C含量及LPL、HL活性,所有步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 HE染色檢測(cè)心肌組織病理變化

采血完成后,處死各組大鼠,獲取左心室心肌組織,生理鹽水沖洗干凈,并固定在4%多聚甲醛緩沖液中,固定后乙醇脫水,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,切片機(jī)上切成厚度約為5 μm切片,切片脫蠟水化后,HE染色法觀察心肌組織病理學(xué)變化。蘇木素染色10 min,流水沖洗掉表面多余染液,1%乙醇-鹽酸分化數(shù)秒,伊紅染色1 min,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,采用SMZ745型光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)觀察各組大鼠心肌組織損傷情況并采集圖片。

1.8 TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況

將心肌組織石蠟切片在60 ℃烘箱烘烤2 h,冷卻后,置于20 μg/mL蛋白酶K中室溫孵育15 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗切片,加入50 μL TUNEL試劑液,37 ℃孵育 1 h,加入過(guò)氧化物酶轉(zhuǎn)化劑,37 ℃繼續(xù)孵育30 min,PBS清洗切片,采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min,中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光,陰性細(xì)胞不著色,顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)數(shù),TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率=(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目)×100%。

1.9 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

在無(wú)菌條件下將心肌組織剪碎,加入液氮研磨,采用預(yù)冷的RIPA緩沖液進(jìn)行裂解,提取總蛋白樣品,參照說(shuō)明書(shū)的步驟采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取等量各組蛋白樣品通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì),分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫下在5%脫脂奶粉中封閉2 h,之后加入稀釋的兔抗Beclin-1(1∶1 000)、p62(1∶1 000)、LC3-Ⅰ(1∶1 000)、LC3-Ⅱ(1∶1 000)作為一抗抗體,4 ℃孵育過(guò)夜。次日,TBST洗膜,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶5 000)作為二抗抗體,室溫下孵育1 h,TBST再次洗膜,滴加增強(qiáng)的ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光,凝膠成像系統(tǒng)拍照,通過(guò)Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件對(duì)各蛋白條帶進(jìn)行分析,以β-actin作為內(nèi)參對(duì)各蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 依托咪酯對(duì)MI/R大鼠心功能的影響

與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠EF和FS降低,LVESD和LVEDD升高(P<0.05);相較于MI/R組,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組EF、FS升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組EF、FS升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)EF、FS、LVESD及LVEDD比較(±s)

圖1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖圖像

2.2 依托咪酯對(duì)MI/R大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物水平的影響

與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH含量均升高(P<0.05);相較于MI/R組,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組血清CK-MB、cTnI、LDH含量均下降(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組CK-MB、cTnI、LDH含量均下降(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH含量比較(±s)

2.3 依托咪酯對(duì)MI/R大鼠心肌組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞核排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰,心肌纖維緊密,未觀察到心肌纖維或膠原組織增生;MI/R組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,心肌纖維變大,膠原組織增生,多數(shù)心肌纖維斷裂,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與MI/R組比較,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組心肌細(xì)胞和心肌纖維損傷程度均減輕,其中依托咪酯高劑量組大鼠心肌組織病理現(xiàn)象改善更顯著。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化(HE染色)

2.4 依托咪酯對(duì)MI/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠心肌組織染色細(xì)胞較多,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例升高(P<0.05),說(shuō)明凋亡細(xì)胞增加;與MI/R組比較,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組大鼠心肌組織中染色細(xì)胞減少,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例均下降(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組染色細(xì)胞減少,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例下降(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡圖

圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率比較的柱狀圖(MI/R組與假手術(shù)組比較,＊P<0.05;與MI/R組比較,#P<0.05;與依托咪酯低劑量組比較,△P<0.05)

2.5 依托咪酯對(duì)MI/R大鼠心肌組織自噬的影響

與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠心肌組織中Beclin-1蛋白表達(dá)上調(diào),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,p62蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05);與MI/R組比較,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組大鼠心肌組織中Beclin-1蛋白表達(dá)下調(diào),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,p62蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組心肌組織中Beclin-1蛋白表達(dá)下調(diào),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降(P<0.05)。詳見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)(A為各組自噬相關(guān)蛋白條帶圖;B為各組Beclin-1蛋白表達(dá)比較柱狀圖;C為各組p62蛋白表達(dá)比較柱狀圖;D為各組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較柱狀圖。a為假手術(shù)組;b為MI/R組;c為依托咪酯低劑量組;d為依托咪酯高劑量組。與假手術(shù)組比較,＊P<0.05;與MI/R組比較,#P<0.05;與依托咪酯低劑量組比較,△P<0.05)

2.6 依托咪酯對(duì)MI/R大鼠脂代謝的影響

與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠血清TC、TG濃度升高,HDL-C濃度、血漿LPL和HL含量降低(P<0.05);與MI/R組比較,依托咪酯低劑量組和依托咪酯高劑量組大鼠血清TC、TG濃度降低,HDL-C濃度、血漿LPL和HL含量升高(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組大鼠血清TC、TG濃度降低(P<0.05),HDL-C濃度、血漿LPL和HL含量升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠TC、TG、HDL-C、LPL、HL含量比較(±s)

3 討 論

MI/R是一種常見(jiàn)的病理現(xiàn)象,涉及心肌代謝紊亂和結(jié)構(gòu)重塑。闡明MI/R的潛在機(jī)制并探索MI/R的有效治療策略,是臨床中攻克的難點(diǎn)之一。本研究通過(guò)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法構(gòu)建MI/R大鼠模型,觀察依托咪酯在大鼠MI/R損傷中的作用,并初步探究其機(jī)制。

大量研究表明,依托咪酯在多種疾病手術(shù)中發(fā)揮著有益作用。Li等[9]在脛骨骨折手術(shù)中使用依托咪酯進(jìn)行麻醉,可抑制下肢缺血/再灌注損傷所致的氧化應(yīng)激反應(yīng),并降低炎性因子水平。徐召溪等[10]研究顯示,依托咪酯可增加大鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活,其機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、抑制蛋白激酶C(PKC)/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路相關(guān)。已有研究表明,依托咪酯對(duì)缺血再灌注大鼠的心肌損傷可發(fā)揮保護(hù)作用[7]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)依托咪酯治療的MI/R大鼠EF、FS升高,LVESD、LVEDD降低,血清心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnI及LDH含量均下降,心肌病理學(xué)改變得到改善,進(jìn)一步明確依托咪酯具有減輕MI/R損傷、改善心功能的作用。

自噬是一種高度保守的機(jī)制,在代謝壓力下觸發(fā)降解細(xì)胞質(zhì)大分子物質(zhì)或細(xì)胞器,可為自身提供能量,是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)的主要組成部分之一,也是細(xì)胞中普遍存在的降解機(jī)制,可去除受損的細(xì)胞器,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[11]。在各種病理情況下,包括各種缺血再灌注損傷,相關(guān)器官組織可迅速誘導(dǎo)自噬發(fā)生。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,自噬可維持心肌細(xì)胞的活性與結(jié)構(gòu),從而維持心臟發(fā)揮正常功能。短暫的缺氧應(yīng)激可誘導(dǎo)自噬增強(qiáng),通過(guò)回收受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞存活。然而,長(zhǎng)時(shí)間缺氧和再灌注導(dǎo)致過(guò)度自噬,引起心肌細(xì)胞死亡[12-13],因此,抑制MI/R引起的過(guò)度自噬可能是預(yù)防MI/R損傷的有效目標(biāo)。Luo等[14]研究顯示,京尼平苷可減小大鼠心肌梗死面積,改善心功能,其機(jī)制可能與抑制自噬與激活蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路有關(guān)。Zuo等[15]研究顯示,川芎嗪降低了MI/R大鼠和H/R心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1表達(dá),通過(guò)調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Bcl-2信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),緩解自噬功能障礙,從而對(duì)MI/R發(fā)揮保護(hù)作用。Beclin-1是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,在其啟動(dòng)和進(jìn)程中均發(fā)揮著重要作用,通過(guò)激活各種細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控自噬發(fā)生。存在于細(xì)胞質(zhì)中的p62與經(jīng)泛素化蛋白結(jié)合,與LC3-Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物,在溶酶體內(nèi)發(fā)生降解。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致,經(jīng)過(guò)依托咪酯治療后,MI/R大鼠中Beclin-1表達(dá)下調(diào),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,且p62蛋白表達(dá)上調(diào),說(shuō)明依托咪酯抑制了MI/R后誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞過(guò)度自噬,從而發(fā)揮心肌保護(hù)功能。

越來(lái)越多的研究表明,MI/R損傷涉及多項(xiàng)生物過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)途徑,如細(xì)胞內(nèi)鈣超載、活性氧積累、心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)等。MI/R損傷發(fā)生后,在缺血缺氧刺激下,細(xì)胞核內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白基因呈高表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[16]。心肌細(xì)胞正常的凋亡程序被擾亂,導(dǎo)致心臟重塑,引起心功能衰竭[17],因此,在改善MI/R損傷中抑制心肌細(xì)胞凋亡是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果顯示,通過(guò)依托咪酯治療的MI/R大鼠心肌組織內(nèi)TUNEL染色細(xì)胞減少,說(shuō)明依托咪酯可能抑制了MI/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

在心肌缺血條件下,由于管腔變窄及心臟對(duì)氧氣需求的增加,可能引起心肌代謝變化,脂代謝紊亂是MI/R過(guò)程中出現(xiàn)的現(xiàn)象之一。心肌缺血可抑制脂肪酸代謝,而非酯化脂肪酸水平升高。隨著有害產(chǎn)物的積累,脂酰輔酶A合成酶受到抑制,心肌組織內(nèi)脂肪酸水平上升,脂肪酸攝取下降[18-19]。有研究顯示,心肌缺血后血清非酯化脂肪酸增高,心肌組織內(nèi)含量隨之升高[20]。本研究結(jié)果顯示,MI/R大鼠經(jīng)過(guò)依托咪酯治療后,血清TC、TG濃度降低,HDL-C濃度、血漿LPL和HL含量升高。LPL和HL為脂蛋白代謝過(guò)程中關(guān)鍵的兩種酶,LPL活性升高可降低TG、LDL水平以預(yù)防高脂血癥;LPL和HL均可催化水解微粒中的TG[21-22]。

綜上所述,依托咪酯通過(guò)抑制大鼠MI/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞過(guò)度自噬,改善心肌功能,減少心肌損傷,調(diào)節(jié)血脂代謝。這些發(fā)現(xiàn)為臨床應(yīng)用依托咪酯治療MI/R損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)于依托咪酯對(duì)MI/R的保護(hù)機(jī)制需在今后的工作中繼續(xù)深入探討。