ACE2對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響及其潛在機(jī)制

徐靈亞，劉 雪，曹瀟洋，張馨怡，姚 靜，王傳功，*

（1濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濰坊 261053；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272067）

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，病死率居高不下，嚴(yán)重威脅全世界女性健康[1]。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)最新癌癥統(tǒng)計(jì)資料表明，2023 年美國(guó)乳腺癌患者發(fā)病率將仍高居女性惡性腫瘤首位，占所有新發(fā)腫瘤的31%，且發(fā)病率每年仍持續(xù)增長(zhǎng)[2]。乳腺癌具有高度異質(zhì)性，根據(jù)基因表達(dá)不同，將乳腺癌分為正常乳腺樣型、Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2 陽(yáng)性型和Basal-like 型5 種亞型。根據(jù)免疫表型分為L(zhǎng)uminal A 型、Luminal B型、HER-2 陽(yáng)性型和三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）4 種臨床亞型。其中，Basallike 型與TNBC 型在組織形態(tài)、免疫表型及臨床表現(xiàn)等方面大致相似，但不等同。此外，TNBC 在基因表達(dá)層面上是一組混合型乳腺癌，又可將其分為6 種分子亞型：基底樣-1 型（basal-like-1，BL-1）、基底樣-2 型（basal-like-2，BL-2）、免疫調(diào)節(jié)型（immunomodulatory，IM）、間質(zhì)型（mesenchymal，M）、間質(zhì)干細(xì)胞型（mesenchymal stem like，MSL）及雄激素受體型（luminal androgen receptor，LAR）[3]。鑒于TNBC 的高侵襲性及對(duì)傳統(tǒng)療法的相對(duì)抵抗[4-5]，使得深入探究TNBC 發(fā)生發(fā)展機(jī)制及診治方案十分必要。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是一種Ⅰ型膜錨定鋅羧肽酶，主要位于細(xì)胞膜上，其可通過(guò)去除C端苯丙氨酸殘基將Ang II轉(zhuǎn)化為Ang(1-7)，同時(shí)也可作用于Ang I產(chǎn)生Ang(1-9)[6-7]，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system，RAS）中Ang(1-7)/MasR 軸的主要組成部分[8-9]。ACE2 除參與協(xié)調(diào)RAS 系統(tǒng)中ACE/Ang II/AT1R 和ACE2/Ang(1-7)/MasR 兩軸之間的平衡外[6,10]，還可參與調(diào)節(jié)結(jié)腸炎中色氨酸代謝，抗菌肽的表達(dá)以及腸道微生物組的功能[11-12]，并能有效改善人體內(nèi)SARS-CoV-2 感染后的葡萄糖和脂質(zhì)代謝[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ACE2 在多種腫瘤中扮演著重要的抑癌角色[14-15]。在肝細(xì)胞癌[15]及腎母細(xì)胞瘤[16]中，ACE2高表達(dá)者提示更好的預(yù)后。此外，ACE2 還可以消除腫瘤對(duì)VEGFR 抑制劑的耐藥性，為腎透明細(xì)胞癌的治療提供了新的思路[16]。在乳腺癌中，雖有文獻(xiàn)報(bào)道了ACE2 對(duì)乳腺癌血管生成的影響[17]，但其調(diào)控乳腺癌（尤其是侵襲能力較強(qiáng)的TNBC）侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為能力及調(diào)控機(jī)制研究鮮有報(bào)道。為此，本研究首先通過(guò)The Cancer Genome Atlas (TCGA)等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ACE2 在乳腺癌中的表達(dá)進(jìn)行了綜合生物信息學(xué)分析，并使用Kaplan Meier 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估ACE2 的預(yù)后價(jià)值。為了進(jìn)一步了解ACE2 在乳腺癌中的功能及致病機(jī)制，本研究進(jìn)行了體外功能實(shí)驗(yàn)及調(diào)控機(jī)制驗(yàn)證，以期揭示ACE2 對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響及其潛在機(jī)制，為更好地精準(zhǔn)治療乳腺癌提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；CCK-8 試劑（日本同仁公司）；Lipo8000?轉(zhuǎn)染試劑(上海碧云天公司)；TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑(上海飛捷生物公司)；ECL 曝光液(美國(guó)Thermo 公司)；GAPDH 抗體（美國(guó)Proteintech 公司）；ACE2、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D1 和Cyclin E2 抗體（美國(guó)CST 公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

熒光定量PCR 儀（美國(guó)Millipore 公司）；Multiskan FC 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.3 細(xì) 胞

人乳腺癌細(xì)胞均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院病理科惠贈(zèng)。所有細(xì)胞均已通過(guò)短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分析鑒定。

2 方 法

2.1 基因表達(dá)與臨床病理特征分析

使用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估ACE2 在乳腺癌和正常乳腺樣本中的表達(dá)（http://timer. cistrome.org），以及TCGA-BRCA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的公共資料分析ACE2 與乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)聯(lián)性。Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)分析ACE2 表達(dá)與乳腺癌生存率之間的關(guān)系（https://kmplot.com/analysis/）。

2.2 基因富集分析

使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)選取了乳腺癌中44個(gè)與ACE2皮爾遜相關(guān)系數(shù)大于0.3的共表達(dá)基因。上傳至DAVID(https://david.ncifcrf.gov)進(jìn)行KEGG通路富集和GO 功能分析，并根據(jù)富集分?jǐn)?shù)（enrichment score）和數(shù)量（count），使用微生信(http://www.Bioinformatics.com.cn/)進(jìn)行可視化處理。

2.3 免疫浸潤(rùn)分析

基于TCGA-BRCA 隊(duì)列，本研究使用TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cis. hku. hk/TISIDB/)評(píng)估乳腺癌中ACE2 與組織亞型和免疫亞型的關(guān)系，分析ACE2表達(dá)與TIICs、趨化因子、趨化因子受體和免疫抑制分子的相關(guān)性。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒感染和siRNA轉(zhuǎn)染

MDA-MB-231 培養(yǎng)于含10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每孔約4 × 104個(gè)接種至12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至50% ～ 70%時(shí)，加入含LV-ACE2 或空載體LV-Vector 的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染液，按感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為50 將慢病毒顆粒和5 μg/mL 聚凝胺與細(xì)胞緩慢充分混勻，置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，16 h后更換為新鮮培養(yǎng)液，感染72 h 后，熒光顯微鏡觀察，采用含10%FBS和2 mg/L嘌呤霉素的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行篩選以建立穩(wěn)定感染LV-ACE2 或LVVector 的細(xì)胞系，并通過(guò)Western blot 和RT-qPCR驗(yàn)證感染效率,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用Lipo8000?將小干擾RNA(siRNA)和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后采用RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA的序列見(jiàn)表1。

Table 1 siRNA sequences used for transfection

2.5 蛋白質(zhì)印跡（Western blot，WB）檢測(cè)各細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平

采用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣本上樣量為20 μg，通過(guò)SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯薄膜，室溫封閉2 h，分別加ACE2 抗體（l∶500），Cyclin 抗體（A2、B1、D1 和E2）、MMP2 抗體和GAPDH 抗體（l∶5 000）4 ℃過(guò)夜孵育，加二抗（鼠或兔源性）室溫孵育1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光顯色、拍照。

2.6 RT-qPCR法檢測(cè)各細(xì)胞中RNA表達(dá)水平

采用TRIzol 試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。引物序列見(jiàn)表2。

Table 2 Primer sequences used for RT-qPCR

2.7 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白組（不含細(xì)胞，僅含培養(yǎng)液），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后分別在第0 ～ 4天，分別使用含10%FBS和10%CCK-8的培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，檢測(cè)450 nm處吸收度。

2.8 Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

Matrigel 膠與無(wú)FBS 培養(yǎng)基按照4∶1 的比例稀釋后，均勻鋪于24 孔Transwell 小室中。每孔按4 × 104個(gè)細(xì)胞（100 μL）加入上室，下室各加無(wú)FBS培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)結(jié)束后，PBS 清洗，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，1%結(jié)晶紫染液浸泡60 min。取膜顯微鏡下觀察，拍照。

2.9 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

按每孔5 × 105個(gè)細(xì)胞均勻鋪于6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到70% ～ 80%時(shí)，每孔的中央劃井字，PBS清洗，倒置顯微鏡下觀察0、24 和48 h 各組劃痕的愈合情況并拍照記錄。

2.10 流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞周期檢測(cè)：收集各組細(xì)胞，PBS 緩沖液洗滌后75%乙醇重懸細(xì)胞，-20 ℃過(guò)夜固定。次日，細(xì)胞經(jīng)冷PBS 緩沖液沖洗后，采用碘化丙啶染色液重懸細(xì)胞，37 ℃避光溫浴30 min。采用流式細(xì)胞術(shù)分析不同細(xì)胞周期各組細(xì)胞百分率。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌3 次，每組分為4 份（空白組、單染組和雙染組），加入Annexin V-APC 和7-AAD 染色液，冰上避光，立即進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 27 和GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組組織和細(xì)胞中mRNA 表達(dá)水平符合正態(tài)分布，以±s和P表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。P＜ 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 乳腺癌組織中ACE2的表達(dá)水平

通過(guò)UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，ACE2 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組織（P＜0.05，圖1-A），且在TNBC 各亞型中的表達(dá)量存在顯著差異性（P＜ 0.05，圖1-B）。為了進(jìn)一步闡明結(jié)果，本研究收集了TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌轉(zhuǎn)錄組和臨床組數(shù)據(jù)，包含正常乳腺組織108例，乳腺腫瘤組織1 017例，其中，99例為匹配樣本。評(píng)估TCGABRCA 隊(duì)列中未配對(duì)瘤旁乳腺正常組織（44.13 ±2.28）與乳腺癌腫瘤組織（10.81 ± 0.929 5）（P＜0.05，圖1-C）和配對(duì)的腫瘤組織與瘤旁組織（P＜0.001，圖1-D）之間ACE2 的mRNA 表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常樣本相比，ACE2 在乳腺癌腫瘤樣本中的表達(dá)明顯更低。

Figure 1 Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) expression levels in breast cancer tissues (±s)

3.2 ACE2表達(dá)與臨床特征之間的相關(guān)性

本研究評(píng)估了ACE2 表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果表明ACE2 的表達(dá)與患者年齡（P＜ 0.05，圖2-C）及腫瘤轉(zhuǎn)移狀態(tài)（P＜ 0.05，圖2-F ～ G）顯著相關(guān)，而與種族、臨床分期和分級(jí)等參數(shù)之間的相關(guān)性并不顯著（圖2-A、B、D、E）。ACE2 在不同年齡段的乳腺癌患者中呈現(xiàn)差異表達(dá)趨勢(shì)，其在乳腺癌高發(fā)的61 ～ 75 歲年齡階段患者中的表達(dá)水平顯著低于0 ～ 35 歲和36 ～ 60歲年齡段患者，結(jié)果提示ACE2低表達(dá)或許是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動(dòng)因素。此外，ACE2在腫瘤M1 期和N1mi 期也呈低表達(dá)狀態(tài)，結(jié)果提示，ACE2 可能在乳腺癌轉(zhuǎn)移的早期階段發(fā)揮重要作用，其有望成為乳腺癌早期診斷的生物標(biāo)記物。

Figure 2 Correlation between the relative expression of ACE2 and clinicopathological parameters

3.3 ACE2表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后相關(guān)

本研究采用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估ACE2在乳腺癌4種主要亞型中的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果表明，在不同分子亞型乳腺癌中，ACE2 扮演著不同的預(yù)后角色：在Luminal A 型乳腺癌中，ACE2 高表達(dá)者預(yù)后更差（P＜ 0.05，圖3-A）；在TNBC 中，ACE2 高表達(dá)者則提示更好的預(yù)后（P＜ 0.05，圖3-C）。而在Luminal B 型（圖3-B）和HER2 陽(yáng)性型乳腺癌（圖3-D）中并未發(fā)現(xiàn)顯著預(yù)后意義。這些結(jié)果表明，ACE2 在乳腺癌預(yù)后中有重要的意義，是TNBC良好預(yù)后的重要分子。

Figure 3 Correlation between ACE2 expression and prognosis

3.4 基因富集分析

一般而言，共表達(dá)基因具有相似的功能和作用。本研究利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選TCGABRCA 隊(duì)列中的ACE2 共表達(dá)基因，進(jìn)行KEGG 通路富集分析和GO 功能分析。KEGG 通路富集主要是色氨酸代謝和花生四烯酸代謝相關(guān)通路等（圖4-A）。GO 功能分析中關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程（BP）包含脂多糖代謝、細(xì)胞周期、電子傳遞和免疫調(diào)節(jié)等。關(guān)鍵細(xì)胞組分（CC）為線粒體和細(xì)胞外泌體的組成部分。分子功能（MF）包括谷胱甘肽水解酶活性、肽基轉(zhuǎn)移酶活性、長(zhǎng)鏈脂肪酸-CoA 連接酶活性、氧化還原酶活性和脂質(zhì)合成等（圖4-B）。以上結(jié)果表明ACE2 主要與乳腺癌中代謝酶活性、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期，以及色氨酸和花生四烯酸代謝過(guò)程有關(guān)，這些過(guò)程對(duì)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

Figure 4 Gene enrichment analysis

3.5 乳腺癌中ACE2的表達(dá)與免疫微環(huán)境的關(guān)系

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞組成的異質(zhì)性復(fù)雜組織，其中免疫浸潤(rùn)細(xì)胞、趨化因子、趨化因子受體和免疫因子等構(gòu)成免疫微環(huán)境。腫瘤免疫集群分為6 種免疫亞型，分別為C1：傷口愈合型，C2：IFN-γ 主導(dǎo)型，C3：炎癥型，C4：淋巴細(xì)胞消減型，C5：免疫靜默型和C6：TGF-β 主導(dǎo)型。在TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，ACE2 與乳腺癌患者組織學(xué)亞型和免疫學(xué)亞型顯著相關(guān)（圖5-A）。

免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞在抑制或促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要作用，趨化因子和趨化因子受體在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用，它們可以將免疫細(xì)胞招募到TME 中，并影響腫瘤進(jìn)展。隨后使用TISIDB 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估ACE2 與乳腺癌TIICs以及趨化因子的關(guān)系。結(jié)果表明，ACE2表達(dá)與乳腺癌中ACT-B、Th1、NKT、Tfh、Th17、Th2 和Tem-CD8 等細(xì)胞呈正相關(guān)（圖5-B）。ACE2與乳腺癌趨化因子CX3CL1、CXCL1和CXCL6等表達(dá)呈正相關(guān)，與CXCL14表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。ACE2與乳腺癌趨化因子受體分子CXCR6、CXCR4、CXCR5和CXCR3等表達(dá)呈正相關(guān)，與CXCR1 和CX3CR1 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。目前，腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）的使用改變了腫瘤治療的格局。ICIs 是通過(guò)阻斷免疫檢查點(diǎn)來(lái)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究使用TISIDB 數(shù)據(jù)庫(kù)分析乳腺癌中，ACE2 與免疫抑制因子之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，ACE2 與免疫抑制因子IDO1（rho = 0.367，P＜ 0.05）、PDCD1（PD-1）（rho = 0.271，P＜ 0.05）和CTLA4（rho = 0.323，P＜ 0.05）等表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖5-C）。

Figure 5 Relationship between ACE2 and the immune microenvironment

3.6 過(guò)表達(dá)和敲低ACE2 細(xì)胞系的構(gòu)建和效果驗(yàn)證

為了闡明ACE2 在乳腺癌進(jìn)展中的作用，本研究首先檢測(cè)了ACE2 在不同乳腺癌細(xì)胞系中蛋白表達(dá)水平（圖6-A）。結(jié)果顯示，在TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231中，ACE2的表達(dá)水平呈低表達(dá)狀態(tài)。而前文結(jié)果表明，ACE2 高表達(dá)的TNBC 患者預(yù)后更好，這將為TNBC 這一難治性亞型乳腺癌的探索帶來(lái)新思路。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ACE2在TNBC細(xì)胞系中的功能作用，本研究建立了ACE2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和敲低細(xì)胞系。過(guò)表達(dá)ACE2 后，ACE2 的蛋白水平（P＜ 0.05，圖6-B）和RNA 水平（P＜ 0.05，圖6-D）均有顯著的增加；反之，敲低ACE2 后，ACE2 的蛋白水平（P＜ 0.05，圖6-C）和RNA 水平（P＜0.05，圖6-E）均呈現(xiàn)顯著的下調(diào)。

Figure 6 Identification of ACE2 expression level (± s, n = 3)

3.7 ACE2抑制TNBC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移

前期數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果表明，ACE2 與TNBC 患者預(yù)后顯著相關(guān)，其高表達(dá)者患者預(yù)后更好。而TNBC作為侵襲能力較強(qiáng)的乳腺癌亞型，關(guān)注ACE2 在這種亞型中的角色和作用十分必要。為此，本研究選擇TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231 進(jìn)行相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，ACE2 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著減弱（圖7）。反之，敲低ACE2 后，MDA-MB-231 細(xì)胞增殖活力反而提升（P＜ 0.05，圖7-B）。結(jié)果表明ACE2能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

Figure 7 ACE2 inhibits the proliferation, invasion and migration of TNBC cells (±s, n = 3)

為進(jìn)一步研究ACE2 抑制MDA-MB-231 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的機(jī)制，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和WB 實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞周期停滯情況（圖8-A）和凋亡數(shù)量（圖8-B）及相關(guān)周期蛋白Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D1 和Cyclin E2 的表達(dá)（圖8-C）。結(jié)果表明，ACE2 并非通過(guò)細(xì)胞凋亡和周期停滯途徑抑制TNBC 細(xì)胞增殖。前文結(jié)果表明，ACE2 與乳腺癌的早期轉(zhuǎn)移有關(guān)。而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是鋅依賴性蛋白水解金屬酶，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，抑癌基因miR-526b-3p的表達(dá)可通過(guò)下調(diào)MMP 家族中重要成員MMP2的表達(dá)，進(jìn)而抑制HeLa 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)，ACE2 過(guò)表達(dá)后的MDA-MB-231 細(xì)胞中MMP2 的表達(dá)水平顯著降低（圖8-C）。結(jié)果提示，ACE2 可能通過(guò)影響MMP2 而抑制TNBC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

Figure 8 Effect of ACE2 on cell cycle, apoptosis and matrix metalloproteinase 2 (MMP2) (±s, n = 3)

3.8 ACE2通過(guò)MMP2途徑抑制TNBC細(xì)胞的侵襲

為進(jìn)一步驗(yàn)證ACE2 是否通過(guò)MMP2 途徑抑制TNBC 細(xì)胞的侵襲。本研究將siACE2 轉(zhuǎn)染到231-lenti-ACE2 細(xì)胞中觀察MMP2 的表達(dá)情況，并通過(guò)Invasion 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了siACE2 的231-lenti-ACE2 細(xì)胞的侵襲能力較231-lenti-ACE2 組顯著增強(qiáng)（圖9）。以上結(jié)果說(shuō)明ACE2可以通過(guò)MMP2途徑抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。

Figure 9 ACE2 affects cell invasion through MMP2 (±s, n = 3)

4 討 論

在本研究中，首先進(jìn)行了綜合生物信息學(xué)分析，以研究ACE2 在乳腺癌中的表達(dá)量、預(yù)后價(jià)值、生物學(xué)功能和潛在的調(diào)控途徑。這些生物信息學(xué)分析和基礎(chǔ)研究將為進(jìn)一步了解乳腺癌患者的預(yù)后和治療奠定基礎(chǔ)。基于生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ACE2 在乳腺癌中表達(dá)低于正常組織，并與患者年齡、M 分期和N1mi 期相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ACE2 與乳腺癌的分子亞型密切相關(guān)，ACE2 高表達(dá)預(yù)示著Luminal 型乳腺癌的生存時(shí)間更短，而TNBC 的生存時(shí)間更長(zhǎng)。近期研究發(fā)現(xiàn)，ACE2 通過(guò)與新冠病毒表面S 蛋白結(jié)合誘導(dǎo)人體細(xì)胞發(fā)生病毒感染[19]，ACE2 靶向藥物的研制成為治療新冠的關(guān)鍵。其中，靶向ACE2 的霧化吸入劑臨床試驗(yàn)顯示了良好的安全性和耐受性。另有文獻(xiàn)報(bào)道[20]，轉(zhuǎn)移性TNBC 患者感染新冠的可能性更高，其主要原因是該類患者的癌細(xì)胞更易發(fā)生病毒感染，以上結(jié)果提示新冠相關(guān)分子ACE2 在乳腺癌進(jìn)展中扮演重要角色。為此提出大膽的設(shè)想，是否ACE2 靶向藥物也能使部分乳腺癌患者從中獲益？尤其是ACE2表達(dá)高而預(yù)后差的Luminal 型乳腺癌患者以及ACE2表達(dá)低預(yù)后差的TNBC 患者這類亞群能否從中獲益值得深入思考和探索。以上結(jié)果及推論將為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供新的思路。

代謝重編程是腫瘤的關(guān)鍵標(biāo)志。2022 年，Xiao 等[21]通過(guò)構(gòu)建TNBC 新型代謝組學(xué)，將TNBC分為3 個(gè)不同的代謝組學(xué)亞組：C1，其特征在于神經(jīng)酰胺和脂肪酸的富集；C2，特征在于與氧化反應(yīng)和糖基轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝物的上調(diào)；C3，具有最低水平的代謝失調(diào)。而在TNBC 轉(zhuǎn)錄組亞型中，LAR 亞型與代謝組學(xué)C1 亞型幾乎重疊；BLIS、IM 和MES亞型主要分為代謝組學(xué)C2 亞型和C3 亞型。本研究發(fā)現(xiàn)，與其他TNBC亞型相比，ACE2在LAR亞型中高表達(dá)，這提示ACE2 可能與C1 亞型的神經(jīng)酰胺和脂肪酸代謝有關(guān)。而且通過(guò)基因富集分析，也發(fā)現(xiàn)ACE2參與脂肪酸代謝途徑。并且ACE2高表達(dá)的TNBC 患者的預(yù)后較好。由此推測(cè)，在不同代謝組學(xué)的TNBC 亞型中，針對(duì)ACE2 的治療可能會(huì)有不同的療效。

為進(jìn)一步明確ACE2 在TNBC 中的功能作用，本研究首先進(jìn)行了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE2 可以有效抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖能力，但并未發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞凋亡能力的影響。數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析發(fā)現(xiàn)ACE2 與乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而又有文獻(xiàn)證明了ACE2 可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，這些結(jié)果均提示ACE2 在乳腺癌轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，但具體機(jī)制尚不清楚。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移在很大程度上取決于多種MMPs 的蛋白水解活性，這些酶通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分和釋放基質(zhì)因子、細(xì)胞表面結(jié)合的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或其受體，參與基質(zhì)破壞、新生血管形成和轉(zhuǎn)移[22]。MMPs 家族含有許多成員，其中MMP2 是一種Zn2+-依賴性金屬蛋白酶[23]。眾所周知，MMP2 在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。而本研究也發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ACE2 后，MMP2 的表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)果提示ACE2 可能通過(guò)下調(diào)MMP2 的表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，ACE2 是如何調(diào)控MMP2 的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入探索。以上發(fā)現(xiàn)，為深入研究ACE2 調(diào)控乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。

綜上所述，ACE2 可能是TNBC 的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物，并可能參與了氨基酸和脂肪酸代謝，以及腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控。同時(shí)，ACE2 可能通過(guò)下調(diào)MMP2 的表達(dá)而非依賴細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯途徑抑制TNBC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果表明，ACE2在調(diào)節(jié)TNBC細(xì)胞的惡性行為中發(fā)揮著重要作用，這將為TNBC的診治提供新的思路。