骨髓間充質干細胞源性外泌體促進小膠質細胞/巨噬細胞M2極化抑制急性期腦缺血大鼠炎癥反應

孫逸梅，毛詩慧，李 琳，江偉鋒，儲利勝

（浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，杭州 310053）

腦卒中是中樞神經系統(tǒng)最常見的疾病，嚴重威脅人類健康。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占所有卒中病例的70% ～ 80%[1]。腦缺血發(fā)病機制非常復雜，其中繼發(fā)性炎癥反應在腦缺血損傷中發(fā)揮重要作用[2-3]。目前，組織型纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator, tPA）是臨床治療腦缺血的唯一有效藥物，但由于治療時間窗窄和出血轉化的風險，其臨床應用受到限制[4]。神經炎癥是缺血性腦卒中的發(fā)病機制之一，主要涉及外周炎癥細胞的浸潤、小膠質細胞活化和炎癥介質的過度產生。探索炎癥的機制，尋求有效治療靶點，對腦缺血防治具有重要意義。

小膠質細胞是腦內固有的免疫細胞。在生理條件下，小膠質細胞處于靜息狀態(tài)，監(jiān)測腦內微環(huán)境維持中樞神經穩(wěn)態(tài)[5-6]。腦缺血后小膠質細胞被激活，活化的小膠質細胞主要有M1 和M2 兩種表型。其中M1 型小膠質細胞高表達CD16/32，釋放腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin 6, IL-6）等加劇神經損傷；而M2 型小膠質細胞高表達精氨酸酶-1（arginase-1, Arg-1）、CD206,釋放抗炎因子白細胞介素-10（interleukin-10, IL-10）、轉化生長因子-β（transforming growth factor β, TGF-β）等，促進炎癥消退和神經修復，發(fā)揮神經保護作用。因此，促進激活的小膠質細胞從M1 型向M2 型轉化為腦缺血的治療提供了一個新策略[7]。

近年來臨床和動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）移植治療腦缺血安全有效，具有很好的臨床應用前景[8]。早期研究認為干細胞治療是通過分化替代死亡的神經細胞。然而，最近的研究表明，間充質干細胞旁分泌的外泌體可以到達缺血部位，改善腦缺血損傷并促進神經功能恢復[9-10]。外泌體（exosomes, Exos）是細胞分泌的重要細胞囊泡，其內含有核酸、蛋白質和脂類等生物活性物質，介導細胞間通訊，在生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[11]。大量研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞源性外泌體（BMSC-Exos）對腦缺血有很好的治療作用，其作用機制包括調節(jié)細胞增殖、遷移、分化、凋亡、炎癥和代謝等生理和病理過程[12]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，BMSC-Exos促進腦缺血后小鼠血管生成減輕腦缺血損傷，然而是否能夠調節(jié)小膠質細胞/巨噬細胞M2 極化尚未清楚[13]。本研究旨在觀察BMSC-Exos 對腦缺血后3 d 小膠質細胞/巨噬細胞M1/M2極化和神經炎癥的影響。

1 材 料

1.1 試 劑

胎牛血清購于（美國Gemini公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（浙江吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、CD9 抗體（美國Bioworld 公司）；ALIX，TSG101（美國Abcam 公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2, 3, 5-triphenyltetrazole chloride, TTC）染料（上海源葉生物科技有限公司）；兔抗Iba1（日本W(wǎng)ako公司）；鼠抗CD16/32（美國BD 公司）；山羊抗CD206（美國RD 公司）；FITC 標記的羊抗兔二抗、Cy3 標記的羊抗鼠二抗、FITC 標記的驢抗羊二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Cy3標記的驢抗兔二抗（美國Jackson ImmunoResearch 公司）；Triton X-100、DIPA、羊血清（上海碧云天生物技術有限公司）；RNAiso 總RNA 提取試劑、SYBR Green?定量PCR 預混試劑、PrimeScript反轉錄預混液、無核酸酶水（大連寶生物工程有限公司）。

1.2 儀 器

HM525NX 冰凍切片機（中國賽默飛世爾科技有限公司）；H-7650 型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；DMIL 型熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；NS300 型 納米顆粒跟蹤分析儀（英國Malvern 公司）；T100TMRNA 反轉錄儀、CFX96 實時熒光定量PCR 儀、ChemiDocTMImaging System 型凝膠圖像處理系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 動 物

SPF級SD大鼠，3 ～ 4月齡，體重（280 ± 10）g，4周齡體質量（80 ± 10）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012]。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22 ± 1） ℃，相對濕度為40%～ 60%，12 h/12 h 明暗交替。本研究嚴格按照動物實驗倫理規(guī)范進行實驗（倫理審查批準號：IACUC-20181126-13）。

2 方 法

2.1 BMSCs的分離和培養(yǎng)

參照實驗室前期報道的方法[14-15]。簡言之，收集細胞懸液后離心10 min，用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后放入CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)至第3 ～ 5 代的細胞用于后續(xù)實驗。

2.2 BMSC-Exos的分離提取

收集骨髓間充質干細胞上清液，在4 ℃條件下，94 r/min 離心10 min，624 r/min 離心10 min，3 120 r/min 離心30 min，棄沉淀，用0.22 μm 微孔濾膜過濾后，4 ℃，31 200 r/min 超高速離心2 h，使用預冷的PBS重懸，放置于-80 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 BMSC-Exos的鑒定

透射電鏡（transmission electron microscope,TEM）觀察BMSC-Exos 形態(tài)：取20 μL BMSCs-Exos懸液滴加到載樣網(wǎng)上，滴加1%醋酸雙氧鈾溶液在室溫下負染1 min，干燥后放入樣品室內，觀察并拍攝照片。免疫印跡法檢測CD9、CD63、TSG101、ALIX、GAPDH 的蛋白表達：懸液經凝膠電泳后轉膜、封閉后，加入一抗CD9、CD63、TSG101、ALIX、GAPDH（1∶1 000）孵育過夜。加入二抗（1∶2 000）孵育2 h，洗滌后化學發(fā)光顯色并置于凝膠圖像處理系統(tǒng)下拍攝并使用Image J 軟件進行灰度分析。納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）測定BMSC-Exos 粒徑大?。築MSC-Exos 懸液置于樣本池內，NTA分析儀測定BMSC-Exos粒徑。

2.4 大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型制備

參照改良的Longa 等[15]建立MCAO 模型。大鼠麻醉后分別將頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈分離，將頸外動脈結扎并剪斷，剪一個小口，將4-0單絲尼龍線從頸外動脈缺口處插入并推至頸內動脈中18 ～ 20 mm，缺血90 min后將尼龍線拔出。假手術組的尼龍線僅插入5 mm。

2.5 實驗分組

大鼠隨機分為假手術組（Sham 組）、模型組（MCAO 組）、骨髓間充質干細胞源性外泌體組（BMSC-Exos 組）每組15 只。BMSC-Exos 組大鼠在缺血90 min 后立即經尾靜脈注射BMSC-Exos（100 μg，500 μL），假手術組和模型組大鼠注射等容積PBS。

2.6 神經功能評分

缺血后第1、2、3 天，分別參照Longa 評分[11]和角實驗[12]檢測大鼠神經功能缺損。Longa 評分標準：0——無缺損；1——懸尾時對側前肢屈曲；2——向損傷側轉圈；3——向損傷對側傾倒；4——意識不清，無法正常行走。角實驗是將兩塊（30 cm × 20 cm × 1 cm）木板以30°夾角相互連接，在交接處留出間隙并將大鼠放在夾角正中央。觀察大鼠左右轉的次數(shù)，重復10次并記錄。

2.7 梗死體積檢測

大鼠麻醉后斷頭取腦，將大鼠大腦冷凍，切成6 個冠狀切片，浸泡在2% TTC 染液中孵育20 min，用4%多聚甲醛固定后拍照。使用Image J 軟件計算梗死面積，并按如下公式校正：梗死體積百分比（%）=[左半腦體積 - （右半腦體積 - 梗死體積）]/左半腦體積 × 100。

2.8 免疫熒光雙標檢測M1/M2 型小膠質細胞/巨噬細胞

缺血后第3 天，各組大鼠經左心室插管注入0.9%氯化鈉溶液（400 mL）快速沖洗，用4%多聚甲醛溶液灌流和固定。取腦后將大腦置于4%多聚甲醛固定，然后分別經20%和30%的蔗糖溶液脫水。對所需腦區(qū)進行冰凍切片制備10 μm腦片。使用0.3% Triton X-100 破膜25 min；5%山羊血清/驢血清室溫封閉1 h，分別加入兔抗Iba1/鼠抗CD16/32（1∶100），兔抗Iba1/山羊抗CD206（1∶100），孵育48 h 后加入相對應的熒光二抗（1∶100），室溫避光孵育1 h，封片，在熒光顯微鏡下拍照，Image J 軟件計數(shù)雙標陽性細胞數(shù)。

2.9 RT-qPCR 檢測M1/M2 型小膠質細胞/巨噬細胞相關標志物mRNA表達

Trizol 法提取大鼠腦缺血周邊區(qū)組織的總RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒說明書進行反轉錄。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR。反應體系：2 × SYBR Premix Ex TaqⅡ 5.0 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 1.2 μL、雙蒸水3.0 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH），采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

Table 1 Primer sequences for real-time

2.10 統(tǒng)計學分析

在SPSS 25.0 軟件中進行數(shù)據(jù)分析，實驗結果以±s表示。先進行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，Longa 評分和角實驗數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis 檢驗進行分析，滿足正態(tài)分布以及方差齊性樣本采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。P＜ 0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 BMSC-Exos的鑒定

在TEM 下觀察BMSC-Exos 的形態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)BMSC-Exos 茶托樣或凹半球樣，具有雙層膜結構，符合外泌體的特征性結構。NTA結果顯示，BMSCExos 的平均粒徑大小為107.4 nm。使用Western blot 對BMSC-Exos 標志性蛋白表達進行檢測，結果表明，與BMSCs比較，BMSC-Exos幾乎不表達GAPDH，而高表達外泌體標記蛋白CD9、CD63、TSG101和ALIX。超離所得上清液中不含有GAPDH、CD9、CD63、TSG101、ALIX，這些結果表明所提取的BMSC-Exos純度較高，可用于后續(xù)實驗（圖1）。

Figure 1 Identification of BMSC-Exos

3.2 BMSC-Exos對急性期腦缺血大鼠神經功能的影響

腦缺血后第1、2、3天，模型組大鼠均呈現(xiàn)嚴重的神經功能缺損，說明腦缺血大鼠模型成功建立；腦缺血后第2、3 天，與模型組比較，BMSC-Exos 組大鼠神經功能評分顯著降低（P＜ 0.01 或P＜0.05），右轉次數(shù)顯著減少（P＜ 0.01 或P＜ 0.05）,見圖2。

Figure 2 Neurological deficits of the rats in each group (±s, n = 15)

3.3 BMSC-Exos對急性期腦缺血大鼠梗死體積的影響

與假手術組相比，模型組腦缺血大鼠腦梗死體積顯著增加（P＜ 0.01）；與模型組相比較，BMSC-Exos 組腦缺血大鼠腦梗死體積顯著減?。≒＜ 0.05），見圖3。

Figure 3 Comparison of cerebral infarct volume in each group (xˉ±s, n = 6)

3.4 BMSC-Exos 對急性期腦缺血大鼠小膠質細胞/巨噬細胞M1極化的影響

與假手術組相比，模型組CD16/32+/Iba1+陽性細胞數(shù)量顯著增加（P＜ 0.01）；與模型組比較，BMSC-Exos 組CD16/32+/Iba1+陽性細胞數(shù)量顯著減少（P＜ 0.01）（圖4）。

Figure 4 Effect of BMSC-Exos on M1 polarization of microglia/macrophage in rats with cerebral ischemia (±s, n = 6)

3.5 BMSC-Exos 對急性期腦缺血大鼠小膠質細胞/巨噬細胞M2極化的影響

與假手術組相比，模型組小膠質細胞/巨噬細胞分支縮短，胞體增大；與模型組比較，BMSC-Exos組CD206+/Iba1+陽性細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01），見圖5。

Figure 5 Effect of BMSC-Exos on M2 polarization of microglia/macrophage in rats with cerebral ischemia (±s, n = 6)

3.6 BMSC-Exos 對急性期腦缺血大鼠M1 型小膠質細胞/巨噬細胞標志物mRNA的影響

與假手術組相比，模型組M1型小膠質細胞/巨噬細胞標志物 iNOS、CD86、TNF-α 的mRNA 表達顯著增加（P＜ 0.01）；與模型組相比，BMSC-Exos組M1型小膠質細胞/巨噬細胞標志物iNOS、CD86、TNF-α 的mRNA 表達顯著減少（P＜ 0.01 或P＜0.05），見圖6。

Figure 6 Effect of BMSC-Exos on the mRNA expression of M1 microglia/macrophage markers after cerebral ischemia in rats (±s, n = 3)

3.7 BMSC-Exos 對急性期腦缺血大鼠M2 型小膠質細胞/巨噬細胞標志物mRNA的影響

與模型組相比，BMSC-Exos 組M2 型小膠質細胞/巨噬細胞標志物Arg-1、TGF-β、IL-10 的mRNA表達顯著增加（P＜ 0.05），見圖7。

4 討 論

BMSCs 衍生的外泌體由于其免疫調節(jié)和再生特性，是治療急性中樞神經系統(tǒng)損傷的有前途的治療劑，其作用機制包括調節(jié)細胞凋亡[16]、血管生成[17]以及神經發(fā)生[18]等。然而，BMSC-Exos 是否能夠調節(jié)腦缺血后第3 天小膠質細胞/巨噬細胞從M1 向M2 極化來抑制急性神經炎癥鮮有文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)BMSC-Exos促進小膠質細胞/巨噬細胞從M1 表型轉化為M2 表型來抑制腦缺血后神經炎癥,改善急性腦缺血損傷。

在生理狀態(tài)下，小膠質細胞通過監(jiān)測病原體和與損傷相關的分子模式，吞噬凋亡神經元維持體內平衡。小膠質細胞根據(jù)微環(huán)境信號不同調整其表型，包括經典激活的M1 型和替代激活的M2型[19]。M1 型小膠質細胞膜上高表達CD16/32，釋放大量促炎因子如TNF-α、iNOS 等對神經元產生毒性加劇腦損傷。M2 型小膠質細胞膜上高表達CD206，分泌抗炎因子，如TGF-β、Arg-1 等，同時釋放IGF-1 和腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）等神經營養(yǎng)因子，促進炎癥消退和神經修復。因此，本研究選取了CD16/32、CD86、iNOS、TNF-α、CD206、Arg-1、IL-10 和TGF-β等作為M1型/M2型小膠質細胞/巨噬細胞標志物。

在腦缺血急性期，缺血核心區(qū)和梗死周圍區(qū)均可檢測到激活的小膠質細胞[20-21]。Hu 等[22]在小鼠局灶性腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，在缺血后3 d M1 型小膠質細胞/巨噬細胞數(shù)量逐漸增加，持續(xù)增加到缺血后14 d；而M2型小膠質細胞/巨噬細胞在缺血后1 ～ 3 d 開始增加，3 ～ 5 d 達到高峰。因此，本實驗選擇腦缺血后第3 天檢測BMSC-Exos 對小膠質細胞/巨噬細胞M1/M2極化的影響。

BMSCs被證實可調控腦內小膠質細胞/巨噬細胞激活以及炎癥反應。Bai 等[23]發(fā)現(xiàn)將BMSCs 移植到MCAO 大鼠腦組織中能夠顯著增加CD206 陽性細胞數(shù)，降低TNF-α 陽性細胞數(shù)。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 移植能夠調節(jié)MCAO 大鼠模型中小膠質細胞從M1 型轉化為M2 型，減輕神經炎癥，促進神經功能恢復[24]。早期研究認為干細胞治療是通過分化替代死亡的神經細胞，發(fā)揮神經修復作用。然而，最近的研究表明，干細胞主要通過旁分泌作用發(fā)揮作用。

外泌體是BMSCs 旁分泌的活性成分之一。BMSC-Exos 被證實能夠調節(jié)小膠質細胞/巨噬細胞表型從而在急性中樞神經損傷中發(fā)揮抗炎作用[25]。Wang等[26]證實骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基通過抑制M1 小膠質細胞/巨噬細胞緩解脊髓損傷。Wen 等[27]提出BMSC-Exos 調節(jié)小膠質細胞表型來抑制創(chuàng)傷性腦損傷后的神經炎癥。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，BMSC-Exos促進腦缺血小鼠血管生成發(fā)揮神經保護作用[13]。這些結果提示BMSC-Exos 可能對小膠質細胞/巨噬細胞M2 極化同樣存在調節(jié)作用。本研究通過免疫熒光雙標實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血后第3 天，與假手術組相比，模型組小膠質細胞/巨噬細胞分支縮短，胞體變大，出現(xiàn)典型的阿米巴樣巨噬細胞形態(tài)特征。BMSC-Exos 治療后小膠質細胞/巨噬細胞M1 型標志物CD16/32 減少，M2型標志物CD206 增多。RT-qPCR 結果進一步發(fā)現(xiàn)，BMSC-Exos 減少iNOS、CD86、TNF-α 釋放，促進Arg-1、TGF-β、IL-10 釋放。上述結果提示，BMSCExos 促進大鼠腦缺血后第3 天小膠質細胞/巨噬細胞從M1 型向M2 型轉化，抑制腦缺血后急性炎癥反應。

綜上所述，本研究結果提示BMSC-Exos 促進腦缺血后小膠質細胞/巨噬細胞M2型極化，從而抑制腦缺血再灌注損傷引起的急性炎癥反應，然而BMSC-Exos 對急性期腦缺血后小膠質細胞/巨噬細胞極化的分子機制的調控尚待進一步研究。