禽源耐碳青霉烯大腸桿菌耐藥基因的鑒定及其耐藥性分析

杜陽洋,王文靜，文立華，楊俊，王紅兵，王慧，杜麗飛，周望平※，劉俊琦※

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南 長沙 410128）

抗生素的應(yīng)用不僅是人類抵御病原微生物感染的常用手段，同時也在食品動物生產(chǎn)中為畜禽健康養(yǎng)殖及臨床用藥提供了重要保障。但是由于抗生素在動物臨床治療及畜禽養(yǎng)殖上的不規(guī)范及不合理使用，導致許多細菌的耐藥性日益增強，特別是對碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細菌，該耐藥菌的出現(xiàn)會使碳青霉烯類抗生素失去藥效，對公共衛(wèi)生造成了嚴重威脅，已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為極重要級別急需開發(fā)新型抗生素來應(yīng)對的極為重要病原體之一[1-2]。

碳青霉烯類抗生素是臨床上有效治療多重革蘭氏陰性菌感染的重要廣譜抗生素之一[3]，但是2009年在印度新德里病人體內(nèi)檢測出了攜帶新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase，NDM）的超級細菌[4-5]，編碼該酶的基因blaNDM 已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，國內(nèi)外不少研究對其進行報道[6-8]。目前，替加環(huán)素和多黏菌素也是臨床上針對碳青霉烯耐藥菌感染的治療藥物[9-10]，然而，由于多黏菌素在臨床上的用量增加，導致碳青霉烯和多黏菌素耐藥菌株隨之增多，這意味著一旦人體或動物機體出現(xiàn)該耐藥菌感染，或?qū)⒚媾R著無藥可治的風險，超級細菌的出現(xiàn)對全球的健康發(fā)展構(gòu)成了極大的障礙。盡管碳青霉烯類藥物已經(jīng)禁止在食品動物中應(yīng)用，但是近年來仍在多個地區(qū)動物體內(nèi)檢測出含有碳青霉烯耐藥腸桿菌（Carbapenems Resistance Enterobacteria，CRE）[11-12]。隨著動物源CRE 的大量產(chǎn)生和高速傳播，對人類公共衛(wèi)生的健康發(fā)展構(gòu)成了嚴重威脅。

目前NCBI 數(shù)據(jù)庫已收錄30 多種blaNDM 亞型，且具有向更強耐藥性進化的趨勢，主要流行blaNDM-1 和blaNDM-5 亞型[13-14]，且流行率呈上升趨勢[15-18]，幾乎突破了臨床抗感染治療的最后一道防線[19-20]。腸桿菌科細菌中的大腸桿菌被譽為“耐藥基因的天然儲存庫”，擁有不斷積累耐藥基因的能力，因而具備傳播耐藥基因的可能性，使得臨床治療藥物效果減弱。關(guān)于長沙地區(qū)禽源腸桿菌科細菌攜帶blaNDM 少有報道，本研究旨在通過調(diào)查分析長沙地區(qū)家禽屠宰場中大腸桿菌的耐藥情況及耐藥基因blaNDM-1 和blaNDM-5 的攜帶情況，為禽類耐藥性調(diào)查和檢測提供試驗數(shù)據(jù)及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2023 年4 月隨機采集湖南省長沙地區(qū)家禽屠宰場A 樣本52 份和家禽屠宰場B 樣本100 份。其中，用無菌棉棒從家禽屠宰場A 采集雞糞便樣本41 份，周圍環(huán)境樣本11 份；家禽屠宰場B 采集雞糞便樣本55 份，鴿糞便樣本24 份及周圍環(huán)境樣本21 份。共計雞糞便樣本96 份、鴿糞便樣本24 份及周圍環(huán)境樣本32 份。

1.2 主要試劑

Premix TapTM 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（長沙）有限公司；Marker、瓊脂糖均購自Biosharp，美羅培南購自麥克林；麥康凱瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司；瓊脂粉、阿莫西林、噻孢霉素、替加環(huán)素、慶大霉素、氧氟沙星、頭孢吡肟、氯霉素、林可霉素等藥敏試驗藥物，均購自Solarbio。

1.3 細菌的培養(yǎng)與保存

將細菌接種于普通培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)12～18 h，用含有30%甘油和液體培養(yǎng)基1∶1 混合存種，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細菌的分離鑒定

將樣本接種于含美羅培南1 μg/mL 的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃孵化箱中培養(yǎng)18～24 h。挑選桃粉色或紅色圓形的菌落，劃線至普通培養(yǎng)基上進行富集培養(yǎng)后純化。

1.5 耐藥基因檢測

對目的菌種采用PCR 擴增方法進行耐藥基因檢測，依據(jù)文獻[24]設(shè)計并合成引物，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：Taq 酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水8.5 μL；反應(yīng)條件為：98 ℃10 s；55 ℃30 s、72 ℃1 min，30 循環(huán)。

表1 PCR 引物序列信息

表2 CRE 分離鑒定結(jié)果

表3 耐藥基因檢測結(jié)果

1.6 藥敏試驗

采用微量肉湯稀釋法確定24 株大腸桿菌對8種抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。所測試的抗菌藥物包括：氧氟沙星（OFL）、頭孢吡肟（FEP）、林可霉素（CD）、噻孢霉素（CF）、阿莫西林（AMX）、替加環(huán)素（TGC）、慶大霉素（GEN）、氯霉素（CPL）。耐藥折點及相關(guān)操作遵循CLSI 指南，多重耐藥（MDR）分離株被定義為對3 種以上抗生素具有耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 CRE 細菌的分離鑒定

采集的152 份樣品中，一共分離到94 株CRE，包括禽源糞便樣本78 份，環(huán)境樣本16 份。屠宰場A 共21 份（檢出率為40.4%），包括雞糞便樣本18份，環(huán)境樣本3 份；屠宰場B 共73 份（檢出率為73%），包括雞糞便樣本46 份，鴿糞便樣本14 份，其他環(huán)境樣本13 份。

2.2 CRE 中NDM 耐藥基因檢測結(jié)果

94 株CRE 中共檢測出攜帶NDM 陽性基因的菌株24 株，blaNDM-1 為主要流行亞型，檢出率為66.7%（n=16），其余8 株為攜帶blaNDM-5 基因。16株blaNDM-1 基因包括7 株雞糞便樣本（屠宰場A 2 株，屠宰場5 株）、3 株鴿糞樣本和6 株環(huán)境樣本（屠宰場A 1 株，屠宰場B 5 株），而8 株攜帶blaNDM-5 基因中有5 株來源于雞糞便樣本（屠宰場A 2 株，屠宰場B 3 株），其余3 株均來自于屠宰場B 環(huán)境樣本中，未從鴿糞便及屠宰場A 周邊環(huán)境樣本中檢測出blaNDM-5 基因。

2.3 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示（圖1），83.3%（n=20）的菌株對阿莫西林的耐藥,對其他抗生素的耐藥率分別為林可霉素（70.8%，n=17）、氯霉素（37.5%,n=9）、氧氟沙星（12.5%，n=3）、頭孢吡肟（8.3%,n=2）、噻孢霉素（37.5%,n=9）、替加環(huán)素（4.2%,n=1）、慶大霉素（33.3%,n=8）。100%（n=24）的菌株至少對1 種抗生素耐藥，79.2%（n=19）的菌株對至少2 種抗菌藥物耐藥，50%（n=12）的菌株對至少3 種抗菌藥物耐藥，表現(xiàn)為多重耐藥（MDR），甚至出現(xiàn)3 株對6 種抗菌藥物耐藥，1 株對7 種抗菌藥物耐藥。

圖1 禽源大腸桿菌對8 種抗菌藥物的耐藥率

3 討論

自從抗生素應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)以來，對動物臨床防治和健康養(yǎng)殖，乃至對我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的確是一大福音，但是由于多企業(yè)不規(guī)范使用、濫用抗生素導致細菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播，造成多重耐藥普遍化。對整個社會來說，這無疑是一大安全威脅，已成為全行業(yè)需要面對且較為棘手的問題。本試驗對24株CRE 進行8 種抗菌藥物的藥敏試驗，結(jié)果顯示，試驗菌株對阿莫西林的耐藥率高達83.3%，8 種抗菌藥物均出現(xiàn)耐藥菌株，100%菌株出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。替加環(huán)素作為治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的特效藥也出現(xiàn)了1 株耐藥菌，表明長沙地區(qū)禽源大腸桿菌耐藥很嚴重。而這些耐藥基因的絕大部分宿主是被稱為“耐藥基因的天然儲存庫”的大腸桿菌，其具備不斷累積耐藥基因的能力，會加快耐藥基因的傳播，導致人用和獸用藥物效果減弱甚至失效。

本試驗對湖南長沙地區(qū)2 個家禽屠宰場隨機采樣，共收集樣本152 份，包括禽糞便以及環(huán)境中的水源、食物、地面的樣品采集，結(jié)果顯示，CRE 檢出率為61.8%（n=94），A 場、B 場的CRE 檢出率分別為40.4%、73%，說明B 場的大腸桿菌耐碳青霉烯更為嚴重。這可能是由于屠宰場B 養(yǎng)殖管理不規(guī)范，較封閉的空間導致群體動物感染性疾病的流行，造成耐藥基因傳播導致。值得注意的是，在屠宰場A 和屠宰場B 中的禽源糞便及其周邊環(huán)境中均檢測出攜帶blaNDM 耐藥基因的菌株，提示動物與環(huán)境之間存在相互傳播，且有進一步傳染到人體的可能性，對人類公共衛(wèi)生產(chǎn)生嚴重影響。這與國內(nèi)研究blaNDM 耐藥基因的流行研究觀點一致[21]。因此，各類屠宰場應(yīng)該制定并完善管理條例并嚴格執(zhí)行，設(shè)立病畜隔離間及急宰間，做好動物的健康監(jiān)測，正確處理排放廢水或污水，做好環(huán)境保障工作。

在鴿糞便樣品中未檢測出攜帶blaNDM-5 耐藥基因，檢測出的3 株陽性基因均為blaNDM-1耐藥基因，說明CRE 在長沙地區(qū)部分鴿群中的傳播較雞群更為保守，暫未出現(xiàn)變異體。本試驗中禽源CRE 中攜帶blaNDM 耐藥基因主要以blaNDM-1（檢出率為66.7%）為主，這與王警等人研究江蘇某奶牛場中blaNDM 流行情況一致[21]，但與王可等人研究山東青島地區(qū)雞源blaNDM 流行情況有所不同[22]?？梢姴煌貐^(qū)、不同物種中同一種屬細菌耐藥基因流行情況也存在一定差異，這可能與不同地區(qū)禽類養(yǎng)殖的用藥習慣、飼養(yǎng)管理的不同相關(guān)。

碳青霉烯類抗菌藥物在人醫(yī)臨床治療中廣泛應(yīng)用使耐藥基因快速傳播，即使該類藥物已禁止用于動物養(yǎng)殖與臨床治療中，但是相關(guān)耐藥基因仍可以通過蒼蠅等環(huán)境媒介進入養(yǎng)殖場[23]，攜帶耐藥基因的動物糞便也可相互傳播，甚至污染水源、環(huán)境，通過食物鏈傳播到人類中，導致其在動物和人類中流行傳播。blaNDM 的出現(xiàn)與傳播引起社會人醫(yī)和獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注，其所導致的使碳青霉烯類抗生素藥效失效的結(jié)果可能會導致人類和動物出現(xiàn)相關(guān)疾病陷入無藥可治的境地。耐藥菌株的不斷出現(xiàn)對公共衛(wèi)生安全和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來的惡性影響越來越嚴重，足以引起我們的重視。