晉東南豬源沙門氏菌血清型調(diào)查與藥敏試驗(yàn)

申子平，倪海星※，陳星，趙慧敏，原慧斌

（1.長(zhǎng)治職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 長(zhǎng)治 046000；2.四川恒通動(dòng)物制藥有限公司，四川 內(nèi)江 641000）

沙門氏菌為豬體內(nèi)的常在菌，當(dāng)外界環(huán)境突變或豬體免疫力降低時(shí)就會(huì)引起發(fā)病[1]。大多養(yǎng)豬場(chǎng)養(yǎng)殖密度較大，造成了近幾年晉東南地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)豬沙門氏菌病的頻繁發(fā)生。許多養(yǎng)殖場(chǎng)在不知沙門氏菌血清型的情況下，亂用、濫用抗菌藥物，造成沙門氏菌耐藥性增強(qiáng)，防治效果不理想[2]。針對(duì)這種情況，試驗(yàn)先確定晉東南地區(qū)豬沙門氏菌的血清型，然后找到治療豬沙門氏菌病的敏感藥物，為該地區(qū)豬沙門氏菌病的防治提供參考。

1 材料

1.1 病料

在晉東南地區(qū)陵川、長(zhǎng)治、長(zhǎng)子、黎城、沁縣、襄垣、平順、武鄉(xiāng)、沁源和壺關(guān)等10 多個(gè)縣的養(yǎng)豬場(chǎng)采集疑似沙門氏菌病的樣品63 份，即用滅菌棉簽從病豬肛門處的直腸內(nèi)挑取大約1 g 的糞便，置于有緩沖蛋白胨水的離心管內(nèi)。離心管放置于有冰袋的保溫箱內(nèi)，密閉保存。

1.2 試劑

顯色培養(yǎng)基由北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；緩沖蛋白胨水、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基由環(huán)凱微生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)；革蘭氏染色液由常德比克曼生物科技有限公司生產(chǎn)；沙門氏菌屬定型血清由天潤(rùn)生物（寧波）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；藥敏紙片、生化鑒定管由溫州布康泰生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器

恒溫培養(yǎng)箱由景邁儀器有限公司生產(chǎn)；微量移液器由力辰儀器科技公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋由杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司生產(chǎn)；電子天平由力辰（上海）儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 病菌的分離、培養(yǎng)

將樣品拭子置于亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)20～24 h；將增菌液混勻后，用移液器吸取100 μL，置于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，涂勻，37 ℃培養(yǎng)20～24 h；用接種棒挑取顯色為紫色的單菌落于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)20～24 h；純化后，保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.2 病菌生化試驗(yàn)

挑取分離純化后的菌落，按照生化鑒定的操作流程進(jìn)行生化反應(yīng)試驗(yàn)[3]。生化試驗(yàn)項(xiàng)目有18 個(gè)：三糖鐵、甘露醇、蔗糖、氰化鉀、鳥氨酸脫羧酶、麥芽糖、吲哚、尿素、丙二酸鹽、山梨醇、鼠李糖、肌醇、脲酶、酚紅、ONPG、靛基質(zhì)試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶、葡萄糖等。

2.3 病菌血清型測(cè)定

2.3.1 病菌的O 抗原測(cè)定

對(duì)生化反應(yīng)后，確定是沙門氏菌的菌株進(jìn)行血清型鑒定。取一無(wú)菌載玻片，用接種針挑取純化好的沙門氏菌單個(gè)菌落于玻片的左右兩個(gè)區(qū)域，滴加1 滴多價(jià)診斷血清于其中的一側(cè)沙門氏菌上，另一側(cè)沙門氏菌滴加1 滴生理鹽水，作為對(duì)照[4]。混勻后，靜置1 min，觀察結(jié)果。

有凝集反應(yīng)者，再用單因子診斷血清重復(fù)以上的操作，如果有凝集便可確定該菌株的O 抗原為此單因子抗原。

2.3.2 病菌的H 抗原測(cè)定

操作步驟同2.3.1。

根據(jù)生化反應(yīng)與病菌O 抗原測(cè)定與H 抗原測(cè)定結(jié)果，確定測(cè)試株的血清型。

2.4 分離菌致病性試驗(yàn)

選取18～20 g 的小白鼠來(lái)測(cè)定分離菌的致病性。試驗(yàn)組和對(duì)照組小白鼠的分配用隨機(jī)方法，每組3 只。試驗(yàn)組每個(gè)組的小白鼠接種1 個(gè)測(cè)試菌株。測(cè)試前，將純化后的測(cè)試菌株接種至馬丁肉湯，37 ℃下培養(yǎng)20 h。試驗(yàn)組每只小白鼠采取腹腔接種的方式注射0.2 mL 菌液（5×108CFU/mL）；對(duì)照組小白鼠每只注射0.2 mL 馬丁液體培養(yǎng)基。飼養(yǎng)并觀察7 d，記錄小白鼠狀態(tài)，及時(shí)對(duì)死亡小白鼠解剖，7 d 后全部剖殺。無(wú)菌采取脾臟或肝臟，再次進(jìn)行細(xì)菌的分離和鏡檢。

2.5 分離菌藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行[5]。有17 種藥物用于測(cè)定：大觀霉素、阿莫西林/克拉維酸、黏桿菌素、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢曲松、氨芐西林、卡那霉素、磺胺異惡唑、頭孢噻呋、氧氟沙星和四環(huán)素等。

3 結(jié)果與分析

3.1 病菌分離、培養(yǎng)結(jié)果

病菌在亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)后，試管增菌液呈現(xiàn)紅色渾濁狀；紅色渾濁增菌液在顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)后，呈紫紅色的表面平滑單菌落；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)后，呈圓形的無(wú)色大菌落。通過(guò)上述分離純化后，63 份病料中有43 株疑似為沙門氏菌。

用疑似菌涂片、染色后鏡檢，可見(jiàn)細(xì)菌為兩端鈍圓、沒(méi)有莢膜、也沒(méi)有芽孢的革蘭氏陰性菌。

3.2 病菌生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)43 株疑似沙門氏菌的菌株進(jìn)行了生化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 43 株疑似菌生化鑒定結(jié)果

由表1 可知，三糖鐵、甘露醇、鳥氨酸脫羧酶、鼠李糖和葡萄糖等幾個(gè)生化試驗(yàn)項(xiàng)目的陽(yáng)性反應(yīng)比例為100%；而在蔗糖、氰化鉀、麥芽糖、吲哚、山梨醇、丙二酸鹽、肌醇和脲酶幾個(gè)項(xiàng)目的陽(yáng)性反應(yīng)比例為0。因此，43 株疑似菌符合沙門氏菌的特性。

3.3 分離菌血清型鑒定結(jié)果

從表2 可知，43 株病菌有41 株確定了抗原類型，有2 株未能確定抗原類型。

表2 43 株分離菌抗原鑒定結(jié)果

41 株分離菌的抗原血清型屬B、C1 和E1 群。其中鼠傷寒沙門氏菌有18 株，占到了41.86 %；其次是里森沙門氏菌，占25.58 %；倫敦沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌各占9.3%；姆班達(dá)卡和妞蘭沙門氏菌各占4.65 %。

3.4 致病性測(cè)定結(jié)果

給小鼠接種后進(jìn)行觀察，對(duì)照組7 d 內(nèi)沒(méi)有異常表現(xiàn)，7 d 后剖檢也沒(méi)發(fā)現(xiàn)病理變化；其余43 個(gè)試驗(yàn)組的小白鼠均在72 h 內(nèi)表現(xiàn)出沙門氏菌病的臨床癥狀或發(fā)生死亡情況。癥狀有被毛散亂、食欲不振、精神萎靡、呼吸困難、糞軟有黏液。解剖病變以肝臟和脾臟病變?yōu)橹鳎?、脾腫大，肝表面有明顯的壞死灶；淋巴結(jié)腫大；腸內(nèi)充滿氣體和液體，腸黏膜腫脹充血。

從剖檢鼠的脾臟、肝臟中均分離到了沙門氏菌。表明試驗(yàn)分離到的43 株病菌，無(wú)論有沒(méi)有定型都有較強(qiáng)致病性。

3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可見(jiàn)，本次試驗(yàn)分離到的沙門氏菌對(duì)黏桿菌素敏感性最強(qiáng)（敏感率95.35 %），其次是頭孢噻呋、氧氟沙星和頭孢曲松（敏感率93.02 %）；中敏感的藥物是諾氟沙星（敏感率72.09 %）；而對(duì)阿莫西林/克拉維酸耐藥性最強(qiáng)，其次是四環(huán)素、大觀霉素和磺胺異惡唑。

表3 43 株細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

4.1 細(xì)菌血清型

試驗(yàn)除了2 株未定型菌株外，鑒定出的血清型有鼠傷寒沙門氏菌、里森沙門氏菌、德爾卑、倫敦沙門氏菌、姆班達(dá)卡和妞蘭沙門氏菌?？梢?jiàn)，在晉東南地區(qū)流行的沙門氏菌有多種血清型。在流行的血清型中，鼠傷寒和里森沙門氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型，占到了該試驗(yàn)中定型菌株的70.73 %，是該地區(qū)的主要血清型。該地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)在預(yù)防豬沙門氏菌時(shí)，應(yīng)以鼠傷寒沙門氏菌和里森沙門氏菌為主要對(duì)象。

4.2 細(xì)菌致病性

在細(xì)菌致病性試驗(yàn)中，43 株沙門氏菌均引起小白鼠的臨床癥狀，或發(fā)生器官的病理變化，或引起死亡。所以，在晉東南地區(qū)流行的豬源沙門氏菌毒力較大，有較強(qiáng)的致病性，應(yīng)該引起養(yǎng)殖人員的重視，以防沙門氏菌病的發(fā)生。

4.3 細(xì)菌耐藥性

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，晉東南地區(qū)豬源沙門氏菌對(duì)黏桿菌素敏感性最高，其次是頭孢噻呋、氧氟沙星和頭孢曲松，所以，在晉東南地區(qū)治療豬沙門氏菌病時(shí)，應(yīng)首先選用這幾種藥物；少用諾氟沙星；禁用四環(huán)素、磺胺異惡唑、大觀霉素等藥物。

我國(guó)生豬生產(chǎn)密度大，沙門氏菌傳染性又較強(qiáng)，很容易造成豬群感染，控制不及時(shí)還會(huì)造成人的感染，后果嚴(yán)重[6]。在晉東南地區(qū)，近幾年豬沙門氏菌病頻繁發(fā)生，這主要是沙門氏菌有致病性的血清型較多，養(yǎng)殖人員在沒(méi)有弄清流行血清型的情況下就進(jìn)行預(yù)防，效果很差[7]。本次試驗(yàn)找出了該地區(qū)豬場(chǎng)流行的沙門氏菌血清型，供養(yǎng)殖場(chǎng)在預(yù)防該病時(shí)參考，并建議豬場(chǎng)用本場(chǎng)流行的血清型自制疫苗預(yù)防。試驗(yàn)也找出了該地區(qū)流行的豬源沙門氏菌的敏感藥物，供豬場(chǎng)在治療豬沙門氏菌病時(shí)參考。