香辛料對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及理化特性的影響研究

吳建梅，汪 鈴，劉 金，王 亮*

（江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

泡菜是我國(guó)廣受消費(fèi)者喜愛(ài)的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜食品[1]。我國(guó)的泡菜歷史悠久，傳承至今，據(jù)記載，腌泡菜最早可以追溯到3 000多年前的商周時(shí)期[2]。目前泡菜生產(chǎn)大多基于家庭自制的自發(fā)發(fā)酵過(guò)程，是將大白菜、甘藍(lán)、蘿卜、菜豆、萵筍等蔬菜作為原料，用一定濃度鹽水或鹵水浸泡，然后放入泡菜壇中在室溫條件下進(jìn)行密封發(fā)酵6～10 d[3]。其中我國(guó)有名的泡菜包括四川泡菜、東北酸菜和涪陵榨菜等[4]。

泡菜的制作通常將蔬菜洗凈后直接浸泡于鹵水中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，這種開(kāi)放式的生產(chǎn)方式使得泡菜制作成為一個(gè)復(fù)雜的混菌發(fā)酵過(guò)程，原料和環(huán)境中的微生物區(qū)系利用發(fā)酵體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生代謝物，如有機(jī)酸、維生素、氨基酸、細(xì)菌素等[5-6]，成熟泡菜中還含有豐富的乳酸菌等有益菌。自然發(fā)酵的泡菜產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特，極具地域特色[7]。然而原料上的微生物并不總是受控制地生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵過(guò)程中易受食源性致病菌污染[8-9]，導(dǎo)致其發(fā)酵結(jié)果品質(zhì)不穩(wěn)定，安全性差。香辛料可以改善食品品質(zhì)[10-11]，且能抑制某些病原菌的生長(zhǎng)[12-13]，因此通常被添加到泡菜鹵水中。然而，針對(duì)香辛料對(duì)泡菜發(fā)酵中微生物多樣性的研究還比較少。

隨著脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法的進(jìn)步和優(yōu)化，高通量測(cè)序技術(shù)在食品發(fā)酵領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[14-17]。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)研究?jī)山M泡菜樣品（對(duì)照組和添加香辛料組）發(fā)酵結(jié)束時(shí)的微生物群落結(jié)構(gòu)，比較兩組樣品間微生物群落差異，同時(shí)監(jiān)測(cè)兩組泡菜在發(fā)酵過(guò)程中的pH、總酸及亞硝酸鹽含量變化，分析理化指標(biāo)與差異物種的相關(guān)性。以期確定香辛料在泡菜發(fā)酵中的潛在效益，為泡菜發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大白菜、食用鹽、白砂糖、大蒜、生姜、小紅尖椒：鎮(zhèn)江市市售；泡菜壇（800 mL）：湖南寶升塑業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、鹽酸、鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸（均為分析純）：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：南京翼飛雪生物科技有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE28pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；ZCZY-CS8V型搖床：上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)：蘇州空泰空氣技術(shù)有限公司；HY160冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；DGL-100GL高壓蒸汽滅菌鍋：浙江力辰儀器科技有限公司；UV-200紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；HH-4S型恒溫水浴鍋：上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜的制作工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料預(yù)處理：挑選新鮮的大白菜，清洗干凈，瀝干表面水分，切分為2 cm×2 cm×2 cm的小塊。

未添加香辛料組（P）（對(duì)照組）鹵水配制：將鹽300 g，白砂糖100 g加至10 L開(kāi)水中，充分浸泡，制成含3%鹽和含1%糖的鹵水，冷卻至室溫備用。

添加香辛料組（PS）鹵水配制：將鹽300 g，白砂糖100 g，大蒜400 g，生姜200 g，小紅尖椒200 g加至10 L開(kāi)水中，充分浸泡，制成含3%鹽、1%糖、4%大蒜、2%生姜和2%小紅尖椒的鹵水，冷卻至室溫備用。

裝壇：按照每壇200 g大白菜，500 mL鹵水裝壇，共制作20壇未添加香辛料泡菜（編號(hào)P1～P20）和20壇添加香辛料泡菜（編號(hào)PS1～PS20）。

密封發(fā)酵：將泡菜壇密封蓋嚴(yán)，置于20 ℃搖床恒溫發(fā)酵6 d，即得泡菜成品。

1.3.2 樣品采集

發(fā)酵時(shí)間設(shè)為0、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d。每天取樣，在每壇泡菜中任選四個(gè)位置，各吸取5 mL，每次每壇共取20 mL泡菜汁混勻，從混勻后的泡菜汁中吸取5 mL放入無(wú)菌離心管，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集沉淀，-80 ℃冰箱保存，直至測(cè)序。剩余15 mL泡菜汁用于pH、總酸、亞硝酸鹽的測(cè)定。

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

采用pH計(jì)直接測(cè)定樣品的pH；參照GB/T12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》[18]測(cè)定樣品的總酸含量；參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》[19]中分光光度法測(cè)定樣品的亞硝酸鹽含量。

1.3.4 DNA提取及測(cè)序

從未添加香辛料組（P）和添加香辛料組（PS）中各選取5個(gè)產(chǎn)酸高的樣品和5個(gè)產(chǎn)酸低的樣品進(jìn)行測(cè)序。采用基因組DNA提取試劑盒提取泡菜樣本的DNA，細(xì)菌通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)16S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。用特異引物515F-806R擴(kuò)增16S rRNA V4區(qū)基因。PCR擴(kuò)增體系：MasterMix15μL、正反向引物0.2μmol/L、模板DNA 10 ng。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃初變性1 min，然后98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃，5 min，共30個(gè)循環(huán)。本研究中的泡菜樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成Miseq文庫(kù)構(gòu)建，采用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)Illumina Miseq測(cè)序后所得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、去雜、優(yōu)化后得到有效序列。使用Uparse對(duì)所有序列按97%相似水平進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的劃分，再將OTU的代表序列與SILVA（132.8版本）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種注釋分析。使用R中vegan包計(jì)算Chao1和Shannon指數(shù)，并計(jì)算組間貝葉斯距離（Bray-Curtis）進(jìn)行β多樣性分析，基于在線網(wǎng)站（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）進(jìn)行組間線性判別分析效應(yīng)大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）。本研究中統(tǒng)計(jì)分析及繪圖主要在R軟件（R 4.2.0）中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組泡菜理化指標(biāo)分析

P組和PS組泡菜在第6天的理化指標(biāo)見(jiàn)表1。由表1可知，P2、P11、P12、P13、P19為P組發(fā)酵結(jié)束（第6天）的高酸樣品，P1、P14、P5、P7、P17為P組低酸樣品；PS1、PS2、PS4、PS5、PS9為PS組發(fā)酵結(jié)束（第6天）的高酸樣品，PS10、PS12、PS13、PS14、PS20為PS組低酸樣品。總酸是泡菜發(fā)酵過(guò)程中標(biāo)志成熟的重要參數(shù)，研究表明，發(fā)酵成熟的泡菜中鹵水pH值＜4.0，可滴定酸含量＞0.3 g/100 g[4]。P組中樣本P5、P7、P14、P17在發(fā)酵第6天均未達(dá)到成熟時(shí)總酸含量0.3 g/100 g。而PS組中所有樣本在發(fā)酵第6天總酸含量均達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)0.3 g/100 g。與對(duì)照組（P組）相比，添加香辛料后同一批樣品中的pH和總酸含量波動(dòng)較小，且都達(dá)到泡菜成熟標(biāo)準(zhǔn)。亞硝酸鹽積累是發(fā)酵蔬菜中常見(jiàn)的安全問(wèn)題，攝入過(guò)量的亞硝酸鹽會(huì)危害人體健康，誘發(fā)多種癌癥[20]。P組中P5、P7、P14、P15亞硝酸鹽含量已超過(guò)安全限值20 mg/kg[19]，PS組中樣本的亞硝酸鹽含量為0.571～1.796 mg/kg，差異較小，單因素方差分析表明兩組樣品間亞硝酸鹽含量存在顯著差異（P＜0.05）。

表1 不同處理組泡菜在發(fā)酵第6天的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of pickles in different treatment groups on the 6th day of fermentation

綜合上述結(jié)果，添加香辛料批次的泡菜與對(duì)照組相比呈現(xiàn)出更快的產(chǎn)酸速率，且PS組的各個(gè)樣品間理化指標(biāo)差異小于對(duì)照組，在發(fā)酵第6天的亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)限值，表明香辛料添加不僅能縮小樣品間的差異，也表現(xiàn)出良好的食用安全性。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)及OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果

兩組泡菜樣本經(jīng)測(cè)序得到的原始下機(jī)序列、有效序列及OTU數(shù)目見(jiàn)表2。去除原始序列的接頭信息以及低質(zhì)量堿基等干擾信息后，所有樣本的有效序列條數(shù)在67 319～87 021之間，每個(gè)樣本的平均有效序列數(shù)為78 093。由表2可知，將兩組中的有效序列進(jìn)行物種注釋，所有樣本共獲得931個(gè)OTU，P組各樣本中OTU數(shù)為47～239個(gè)，由此可見(jiàn)P組10個(gè)樣本間的OTU數(shù)存在較大差異，而PS組各樣本中OTU數(shù)為45～64個(gè)，差異較小。由表2亦可知，覆蓋率（Good's coverage）均大于0.99，覆蓋率越高，說(shuō)明所有樣本中序列未被測(cè)出的概率很低。結(jié)合稀疏性曲線（圖1）可得，隨著測(cè)序深度加深，物種數(shù)先快速上升后趨于平緩，表明本次樣品測(cè)序的質(zhì)量和深度足夠反映絕大多數(shù)的微生物物種信息。

圖1 泡菜樣本稀疏性曲線Fig.1 Rarefaction curves of pickles samples

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)

兩組泡菜樣品在門水平及屬水平上相對(duì)豐度前十的微生物群落組成見(jiàn)圖2。由圖2a可知，厚壁菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteobacteria）是兩組泡菜樣品中共同的優(yōu)勢(shì)門（相對(duì)豐度＞1%），此結(jié)果與其他發(fā)酵蔬菜的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門相同[3，21]，證明各發(fā)酵蔬菜微生物間存在共性。厚壁菌門在PS組中相對(duì)豐度更高，達(dá)到76.41%，在P組中為34.52%。變形桿菌門在P組和PS組中分別占62.74%和20.96%。

圖2 不同處理組泡菜樣本中門（a）和屬（b）水平上微生物群落結(jié)構(gòu)比較Fig.2 Comparison of microbial community structure of pickles samples with different treatment groups at phylum (a) and genus (b) level

由圖2b可知，在屬水平上，兩組泡菜樣品中的優(yōu)勢(shì)屬種類大體相同，但同一細(xì)菌屬在兩組泡菜樣品中的相對(duì)豐度存在差異。P組中的優(yōu)勢(shì)屬（相對(duì)豐度＞1%）為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）下的未鑒定屬（46.34%）、明串珠菌（Leuconostoc，18.25%）、乳球菌（Lactococcus，9.76%）、假單胞菌（Pseudomonas，4.22%）、弧菌屬（Vibrio，1.95%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，1.92%）、泛菌屬（Pantoea，1.12%）、氣單胞菌（Aeromonas，1.09%）。PS組中的明串珠菌屬（Leuconostoc，70.26%）豐度最高，其次是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）下的未鑒定屬（8.30%）、乳球菌（Lactococcus，2.22%）、弧菌屬（Vibrio，2.19%）、假單胞菌（Pseudomonas，1.66%）、希瓦氏菌（Shewanella，1.31%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，1.30%）和泛菌屬（Pantoea，1.17%）。

各細(xì)菌屬中，腸桿菌是P組中占比最大的優(yōu)勢(shì)屬，此外還檢測(cè)出了低豐度的假單胞菌、弧菌屬、泛菌屬、氣單胞菌屬，有研究表明，這些細(xì)菌屬在新鮮蔬菜及腌漬蔬菜中被檢測(cè)出[22-23]，推測(cè)其來(lái)源于發(fā)酵原料或者制作過(guò)程中的環(huán)境因子如發(fā)酵容器、刀具等，但隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，這些潛在病原微生物的生長(zhǎng)受到抑制甚至在發(fā)酵后期完全消失[24]。假單胞菌和腸桿菌科是發(fā)酵蔬菜中常見(jiàn)的病原菌，有研究表明假單胞菌和腸桿菌科細(xì)菌代謝利用氨基酸，產(chǎn)生刺激性氣味，加速食品腐敗[25]，腸桿菌的存在會(huì)與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)發(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并促進(jìn)亞硝酸鹽的產(chǎn)生[26]。以上結(jié)論證實(shí)了家庭自制泡菜中容易受到食源性致病菌的污染[27]。

香辛料的加入使得腸桿菌相對(duì)豐度從之前的46.34%下降至8.30%，假單胞菌也降低至1.66%，這降低了泡菜發(fā)酵中的致病性。另外明串珠菌從豐度18.25%上升至70.26%，成為PS組的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，劉麗宅等[28]研究也表明，明串珠菌是泡菜發(fā)酵中優(yōu)勢(shì)菌。此外，乳酸桿菌、片球菌屬、魏斯氏菌、腸球菌、乳球菌等乳酸菌也是泡菜中常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)屬[29]。大量研究表明乳酸菌主要通過(guò)碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，該化合物有助于防止病原微生物和腐敗微生物的生長(zhǎng)，因而在傳統(tǒng)泡菜中廣泛存在[30]。

綜上，香辛料可以顯著提高泡菜發(fā)酵體系中乳酸菌的相對(duì)豐度，減少有害微生物污染，從而降低許多健康風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 微生物群落多樣性分析

2.4.1 微生物群落α多樣性分析

微生物的α多樣性指數(shù)反映了群落內(nèi)物種數(shù)量及其相對(duì)豐度，Chao1指數(shù)常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，Chao1指數(shù)越大，OTU數(shù)目越多，樣本物種數(shù)比較多。Shannon指數(shù)綜合考慮了物種的豐富度和分布的均勻度，其中Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。

兩組泡菜樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)分析見(jiàn)圖3。由圖3可知，經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)，兩組樣品間Chao1指數(shù)無(wú)明顯差異，PS組中Chao1指數(shù)較高，平均為111.46±52.38，表明PS組泡菜中的物種豐富度大。Shannon指數(shù)在PS組中更高，平均為2.48±0.76，顯著高于P組（P＜0.05），表明添加香辛料后增大了泡菜中的微生物多樣性。

圖3 不同處理組泡菜樣本中Chao 1（a）和Shannon（b）指數(shù)Fig.3 Chao1 (a) and Shannon (b) indexes of pickles samples with different treatment groups

2.4.2 微生物群落β多樣性分析

基于Bray-Curtis距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）以表征兩組泡菜中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，PCoA1和PCoA2分別解釋了微生物群落結(jié)構(gòu)總變異的50.43%和13.59%。除PS1樣本外，PS組各樣本聚集性較高，說(shuō)明PS組中微生物群落構(gòu)成差異較小。而P組中樣品間距離較遠(yuǎn)，表明P組各樣本空間距離較大。這可能與PS組中明串珠菌占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而非優(yōu)勢(shì)菌不能大量生長(zhǎng)有關(guān)，因此PS組中細(xì)菌種類分散度較小，且PERMANOVA 檢驗(yàn)組間差異極顯著（P＜0.01），表明香辛料對(duì)泡菜中微生物菌群結(jié)構(gòu)有一定影響，未添加香辛料的同一批泡菜樣本微生物群落結(jié)構(gòu)差別較大，而添加香辛料可以縮小同批次中樣本間的差異，后者工藝更利于泡菜發(fā)酵體系的穩(wěn)定。

圖4 不同處理組泡菜樣本的主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.4 Principal coordinate analysis results of pickles samples with different treatment groups

2.5 微生物群落差異性分析

2.5.1 LefSe分析及生物標(biāo)志物

利用LefSe分析找到兩組泡菜樣品在豐度上有顯著差異的物種，圖5展示了LDA分值大于4.0的物種，分別作為P組和PS組的生物標(biāo)志物，圖中柱形圖長(zhǎng)度代表LDA分值的大小，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，LDA分值越高，即該物種豐度對(duì)兩組間差異效果影響大。由圖5可得，LefSe分析共檢驗(yàn)出前15個(gè)在兩組泡菜樣品間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的微生物類群，P組及PS組分別鑒定出10個(gè)和5個(gè)生物標(biāo)志物，P組生物標(biāo)志物分類到屬水平的有乳球菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬、弧菌、乳桿菌屬和Castellaniella，只有一個(gè)標(biāo)志物分類到科水平（Enterobacteriaceae），其中LDA分值最高的生物標(biāo)志物是來(lái)自腸桿菌科（6.13）。PS組中有4個(gè)標(biāo)志物來(lái)自明串珠菌屬，剩余1個(gè)標(biāo)志物分類到科水平（Enterobacteriaceae）。LDA分值最高的生物標(biāo)志物來(lái)自明串珠菌屬（6.33）。

2.5.2 生物標(biāo)志物與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

為探究生物標(biāo)志物與理化指標(biāo)之間的聯(lián)系，繪制了生物標(biāo)志物與理化參數(shù)之間的Spearman相關(guān)性熱圖見(jiàn)圖6。由圖6可知，P組中LactobacillusKR107058.1.1463、VibrioKF799889.1.1509、PseudomonasEU539857.1.1397、PseudomonasAF534216.1.1462和Enterobacteriaceae KC555526.1.1442均與亞硝酸鹽含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而PS組中LeuconostocKC539103.1.1326、LeuconostocKX232108.1.1480和LeuconostocKX583579.1.1213與亞硝酸鹽含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），這解釋了表1中P組樣品中有亞硝酸鹽含量超標(biāo)而PS組遠(yuǎn)低于安全限量值的原因。P組的10個(gè)生物標(biāo)志物都與總酸呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其中LactobacillusKR107058.1.1463與總酸呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），PS組的LeuconostocKX232108.1.1480與總酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；P組中6個(gè)生物標(biāo)志物與pH呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），PS組中1個(gè)生物標(biāo)志物與pH呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)研究了香辛料對(duì)泡菜發(fā)酵中微生物多樣性的影響，并結(jié)合理化參數(shù)分析。其中P組優(yōu)勢(shì)菌屬為為腸桿菌、明串珠菌、乳球菌、假單胞菌、弧菌屬、乳酸桿菌屬、泛菌屬、氣單胞菌，而明串珠菌是PS組的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌；PCoA分析結(jié)果表明PS組中各樣品菌群差異較小，即添加香辛料能有效提高同批次泡菜中微生物群落的穩(wěn)定性；P組中8個(gè)生物標(biāo)志物與亞硝酸鹽的生成呈極顯著或顯著正相關(guān)（P＜0.01、P＜0.05），而PS組中來(lái)自明串珠菌屬的三個(gè)生物標(biāo)志物與亞硝酸鹽呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在傳統(tǒng)泡菜生產(chǎn)中添加香辛料能有效提高乳酸菌的相對(duì)豐度，使有益菌占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，顯著降低亞硝酸鹽含量，更能保證食用安全性。