漢中地區(qū)漿水發(fā)酵過程中微生物群落演替及其功能預測

劉 陽，王珊珊，2，3*，高 琪，甄子辰，王 令，3，4，路宏朝，2，5，張 濤，3，4

（1.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723001；4.陜西理工大學 秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室（培育），陜西 漢中 723001；5.秦巴特色肉制品質(zhì)量提升與安全控制陜西省高校工程研究中心，陜西 漢中 723001）

漿水是一種在中國西北地區(qū)有兩千多年歷史的無鹽發(fā)酵蔬菜[1-2]，富含益生菌、維生素C、有機酸等多種易被人體消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)[3]，具有促進消化，降低膽固醇，改善腸道功能等益生作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，地域、原料和發(fā)酵階段的不同是微生物結(jié)構(gòu)存在差異的主要因素，這些差異同時與其安全性、益生特性和風味品質(zhì)形成密切相關(guān)[6]。因此，漿水中的微生物菌群結(jié)構(gòu)研究成為熱點，魏本良等[6-7]的研究通過高通量測序技術(shù)揭示了陜西、甘肅多個地區(qū)來源的漿水中優(yōu)勢細菌為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。LIU Z G等[8]比較了不同地區(qū)漿水和酸菜中細菌群落差異，發(fā)現(xiàn)酸菜中細菌多樣性高于漿水，且菌群結(jié)構(gòu)差異顯著。周書楠等[9]對琚灣酸漿面漿水中的微生物群落分析發(fā)現(xiàn)，細菌以乳酸桿菌屬為主；尚雪嬌等[10]研究了琚灣酸漿面漿水中的真菌群落，其中子囊菌門（Ascomycota）平均相對含量高達99.68%，主要是假絲酵母屬（Candida）和畢赤酵母屬（Pichia）。

目前對漿水的研究多圍繞陜西關(guān)中、甘肅等不同地區(qū)之間漿水中微生物結(jié)構(gòu)的差異比較，但是關(guān)于漿水發(fā)酵過程中微生物演替的研究鮮有報道。傳統(tǒng)漿水多為家庭作坊式生產(chǎn)，生產(chǎn)環(huán)境較為開放，發(fā)酵過程中有可能產(chǎn)生潛在致病菌或腐敗菌，隨著傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)標準逐步規(guī)范化，明確發(fā)酵過程中微生物組成及變化有利于其品質(zhì)的保證和提升。此外，漢中地處陜西南部，屬于北亞熱帶氣候區(qū)，北有秦嶺、南有大巴山脈兩大屏障，氣候溫和濕潤、干濕有度，與關(guān)中、甘肅等地區(qū)氣候差異明顯，這可能使?jié)h中漿水具有獨特的微生物群落[11]。

本研究采用Illumina MiSeq測序技術(shù)對發(fā)酵前期、中期和后期3個階段的漢中漿水樣品進行細菌16S rRNA V3-V4區(qū)與真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（internally transcribed spacer 1，ITS1）序列測序，解析發(fā)酵過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)動態(tài)變化并預測微生物功能分布，為深入挖掘功能微生物以及規(guī)模化生產(chǎn)高品質(zhì)漿水提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芥菜（Brassica juncea）：漢中市市售；發(fā)酵引子：2022年1月采集自陜西漢中市家庭自制（以芥菜和面湯為原料自然發(fā)酵10 d）的漿水；強力土壤脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國MOBioLaboratories公司；Monarch DNA膠回收試劑盒：美國NEB公司。

1.2 儀器與設備

Legend Micro 21高速離心機：德國EPPENDORF公司；G560E振蕩器：美國Scientific Industries公司；9902型96 well聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Applied Biosystems公司；1795型微型離心機：天根生化科技（北京）有限公司；Novaseq6000 PE250高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 漿水的制備

選擇漢中當?shù)匦迈r芥菜5 kg，清水洗凈，控干水分，開水燙菜后撈出晾涼控水，放入壇中，添加含0.5%面粉的面湯10L和200 mL發(fā)酵引子，密封后置于陰涼通風處自然發(fā)酵，每天打開瓦罐上下翻動一次，并觀察發(fā)酵狀態(tài)，分別在發(fā)酵第1、5、10天取樣（編號為D1、D5、D10），每次取3份平行樣（分別編號為D1S1、D1S2、D1S3，D5S1、D5S2、D5S3，D10S1、D10S2、D10S3）。漿水樣品經(jīng)紗布過濾后離心獲得菌體用于測序。

1.3.2 漿水細菌和真菌Illumina MiSeq測序

使用強力土壤DNA提取試劑盒完成漿水發(fā)酵液中基因組DNA提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）、ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS1R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）分別擴增細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)基因。PCR擴增體系：上下游引物各0.9 μL，基因組DNA（50±10）ng，KOD FX Neo（TOYOBO）0.6 μL，KOD FX Neobuffer15μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTP）（2 mmol/L each）6 μL，雙蒸水ddH2O補至30 μL。PCR擴增條件：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30s，72℃延伸60s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。將PCR產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Monarch DNA膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。高通量測序委托北京擎科生物科技有限公司完成。

1.3.3 高通量測序數(shù)據(jù)分析

將高通量測序獲得的雙端序列數(shù)據(jù)，經(jīng)FLASH軟件拼接，后用Trimmomatic軟件進行質(zhì)量過濾，再使用UCHIME軟件去除嵌合體。通過USEARCH軟件在97%的相似水平下將所有樣本的有效序列聚類成操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）?；赟ilva數(shù)據(jù)庫（Relwese128）和Unite數(shù)據(jù)庫（Release 7.2），采用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）Classifier（version 2.2）對OTU代表序列進行物種分類注釋，并分別在各個分類水平統(tǒng)計樣本的群落組成，利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種分類圖，再利用R語言工具繪制群落結(jié)構(gòu)圖。使用QIIME軟件計算樣本的超1（Chao 1）指數(shù)和ACE指數(shù)（菌群豐度）、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)（菌群多樣性）等α多樣性指數(shù)；基于獨立OTU使用Bray-Curtis加權(quán)算法進行主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）比較不同樣品細菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異程度。利用微科盟生科云平臺（https：//www.bioincloud.tech）進行線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA），研究了不同發(fā)酵時期樣品中存在顯著差異的類群，在屬水平上采用t-test的方法兩兩進行比較。基于測序數(shù)據(jù)使用PICRUSt2、BugBase軟件進行功能預測，Prism 8.0軟件將結(jié)果可視化。實驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品16S rRNA和ITS基因序列質(zhì)量評估及α-多樣性分析

高通量測序結(jié)果顯示，取自3個發(fā)酵階段的9個漿水樣品中，共產(chǎn)生650 688條細菌有效序列，685 317條真菌有效序列。根據(jù)97%相似性水平，共得到605個細菌OTUs和9061個真菌OTUs。稀釋曲線反映了測序數(shù)據(jù)的合理性，漢中漿水發(fā)酵過程中樣品的微生物稀釋曲線見圖1。對有效序列進行α-多樣性分析，同時評估樣品的物種豐度和多樣性，結(jié)果見表1。由圖1、表1可知，所有樣品的稀釋曲線逐漸平坦并且全部樣品的OTU覆蓋率為99.86%～100%，說明測序結(jié)果基本涵蓋了樣品中的微生物種類，能夠準確反映全部樣品中的微生物組成。OTU數(shù)量與樣品中的微生物豐度呈正相關(guān)；Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)體現(xiàn)物種的豐富度信息，數(shù)值越大，多樣性越高；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度，數(shù)值越大，多樣性越高。在整個發(fā)酵過程中細菌的豐度較為穩(wěn)定，真菌在發(fā)酵后期多樣性和豐富度指數(shù)達到最高值，表明通過發(fā)酵真菌群落多樣性和豐富度得到提升。此外，整個發(fā)酵過程中的真菌Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均大于細菌，說明漿水中真菌多樣性與豐富度均大于細菌。

表1 漢中漿水發(fā)酵過程中細菌和真菌Alpha多樣性分析結(jié)果Table 1 Alpha diversity analysis reesults of bacteria and fungi in Hanzhong Jiangshui during fermentation process

圖1 漢中漿水樣品中細菌（a）和真菌（b）的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of bacteria and fungi in Hanzhong Jiangshui samples

2.2 不同發(fā)酵階段菌群差異分析

對漢中漿水3個不同發(fā)酵階段的微生物進行β-多樣性分析，結(jié)果見圖2。基于Bray Curtis的主坐標分析（PCoA），樣本距離越接近表明樣品的群落組成越相似。在細菌方面（圖2a），PC1和PC2對細菌群落結(jié)構(gòu)的方差貢獻率分別為81.49%和10.27%，3組樣本之間距離較大，而組內(nèi)樣本間距離較小，說明3個發(fā)酵階段細菌群落組成存在一定差異。在真菌方面（圖2b），PC1和PC2對真菌群落結(jié)構(gòu)的方差貢獻率分別為64.93%和14.62%。D1和D5組內(nèi)樣本距離較大，D10組內(nèi)樣本間距較小，不同發(fā)酵時間的樣品存在一定差異。

圖2 漢中漿水樣品中細菌（a, c）和真菌（b, d）的主坐標分析和線性判別分析Fig.2 Principal coordinates analysis and linear discriminant analysis of bacteria(a,c)and fungi(b,d)in Hanzhong Jiangshui samples

線性判別分析效應大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度生物標識，先檢測并找到具有顯著豐度差異特征的類群，然后采用線性判別分析（LDA）估算每個組分豐度對差異效果影響的大小。判別分析結(jié)果表明，在LDA 閾值為4 的條件下，不同階段的樣本中細菌（圖2c）和真菌（圖2d）分別有3個和16個分類水平存在顯著性差異（P＜0.05）。D1階段的差異顯著菌屬為腐敗乳桿菌屬（Loigolactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）；D5階段的差異顯著菌屬為乳植桿菌屬（Lactiplantibacillus）、被孢霉屬（Mortierella）、鐮刀菌屬（Fusarium）；D10階段的差異顯著菌屬為德巴利酵母屬（Debaryomyces）。

2.3 微生物群落分布特征分析

2.3.1 細菌菌群結(jié)構(gòu)特性分析

經(jīng)注釋，漢中漿水樣品細菌分布在11個門、15個綱、24個目、35個科、54個屬。在門水平，厚壁菌門（Firmicutes（99.32%～99.47%））在發(fā)酵各個階段占據(jù)絕對優(yōu)勢地位（圖3a）。在屬水平，細菌優(yōu)勢微生物包括乳植桿菌屬（Lactiplantbacillus）、腐敗乳桿菌屬（Loigolactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、寡碳乳桿菌屬（Paucilactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）及發(fā)酵劑乳桿菌屬（Levilactobacillus）等。乳植桿菌屬相對豐度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，發(fā)酵前期（1 d）平均相對豐度為25.61%，中期（5 d）時增加至41.09%，后期（10 d）下降至34.33%；腐敗乳桿菌屬相對豐度從發(fā)酵前期的37.74%降至中期時的25.73%，后期時增加至30.69%。乳植桿菌屬和腐敗乳桿菌屬在發(fā)酵過程中的相對豐度和在63.65%～66.82%呈較小波動。魏斯氏菌和寡碳乳桿菌屬在整個發(fā)酵周期中含量呈現(xiàn)較小浮動，在各發(fā)酵階段的平均相對豐度分別為18.44%和6.85%。明串珠菌屬在整個發(fā)酵過程中呈下降趨勢，最終相對豐度為3.47%。發(fā)酵劑乳桿菌屬在發(fā)酵前期含量較低，隨著發(fā)酵時間的延長其相對豐度從2.5%增加至4.45%（圖3b）。

圖3 漢中漿水樣品中細菌在門（a）和屬（b）水平上的相對豐度及屬水平差異顯著細菌的t-test檢驗（c）Fig.3 Relative abundance of bacteria at phylum (a) and genus (b)levels and t-test of bacteria with significant difference at genus level (c) in Hanzhong Jiangshui samples

對3個發(fā)酵時期優(yōu)勢菌屬進一步進行t-test檢驗。乳植桿菌屬和腐敗乳桿菌屬在3個階段之間均存在極顯著差異（P＜0.01）；發(fā)酵劑乳桿菌屬發(fā)酵后期的相對豐度和另外兩個時期之間差異極顯著（P＜0.01），明串珠菌屬初期時的相對豐度和另外兩個時期之間差異極顯著（P＜0.01）；乳球菌屬（Lactococcus）在初期時顯著高于后期（P＜0.05），極顯著高于中期（P＜0.01）（圖3c）。

2.3.2 真菌菌群結(jié)構(gòu)特性分析

真菌分布在12個門、46個綱、100個目、191個科、367個屬。優(yōu)勢真菌門為擔子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門。擔子菌門在發(fā)酵前期的相對豐度為68.63%，隨著發(fā)酵時間的延長其相對豐度降低，在發(fā)酵至中期時下降至31.03%，子囊菌門從前期的26.79%增加至58.21%。發(fā)酵至后期時組內(nèi)樣品間各菌門占比均趨于穩(wěn)定，擔子菌門平均相對豐度為41.02%，子囊菌門平均相對豐度51.22%?？梢园l(fā)現(xiàn)，雖然不同樣品之間菌群結(jié)構(gòu)存在差異，但優(yōu)勢菌門均為擔子菌門和子囊菌門，說明擔子菌門和子囊菌門是漿水發(fā)酵過程中的主要真菌門（圖4a）。根據(jù)高通量測序結(jié)果，結(jié)合OTU聚類分析結(jié)果和研究需求，將真菌微生物在屬水平上相對豐度最大的菌屬進行統(tǒng)計分析。

圖4 漢中漿水樣品中真菌在門（a）和屬（b）水平上的相對豐度及屬水平差異顯著真菌的t-test檢驗（c）Fig.4 Relative abundance of fungi at phylum (a) and genus (b)levels and t-test of fungi with significant difference at genus level (c) in Hanzhong Jiangshui samples

在屬水平上，發(fā)酵前期雙胞菌屬（Cystofilobasidium）（29.28%）和白冬孢酵母屬（Leucosporidium）（20.25%）處于優(yōu)勢地位。發(fā)酵中期雙胞菌屬（9.36%）和白冬孢酵母屬（5.46%）的優(yōu)勢地位均下降，鐮刀菌屬（Fusarium）的相對豐度由初始的2.30%增加至5.99%。發(fā)酵后期德巴利酵母屬（Debaryomyces）的相對豐度由發(fā)酵前期的1.01%增加至9.7%，而雙胞菌屬和白冬孢酵母屬分別由29.28%和20.25%減少至14.98%和7.63%。樣品中檢測出的物種平均相對豐度＞1%的屬有9個，分別是雙胞菌屬（14.9%）、白冬孢酵母屬（7.63%）、鐮刀菌屬（4.26%）、德巴利酵母屬（9.70%）、Holtermanniella（4.53%）、被孢霉屬（Mortierella）（2.95%）、枝孢菌屬（Cladosporium）（2.23%）、擬青霉屬（Simplicillium）（2.16%）、曲菌屬（Aspergillus）（1.93%）（圖4b）。對3個發(fā)酵時期優(yōu)勢菌屬進一步進行t-test檢驗，結(jié)果顯示，德巴利酵母屬在發(fā)酵后期時顯著高于另外兩個階段（P＜0.05）（圖4c）。

2.4 功能預測

在對不同發(fā)酵時期的漢中漿水核心微生物群進行解析的基礎(chǔ)上，進一步預測菌群的潛在功能。使用BugBase基于16S rRNA序列OTU對3個階段細菌的需氧情況、革蘭氏陽性/陰性、潛在致病性、可移動原件、生物膜形成和耐受性等9個表型的生物水平覆蓋情況進行了預測，結(jié)果見表2。由表2可知，細菌類群主要為革蘭氏陽性菌，相對豐度為98.70～98.97%。隨發(fā)酵進程好氧菌豐度上升，厭氧菌與兼性厭氧菌的豐度降低，這可能與漿水為半開放式發(fā)酵且過程中需要定期上下攪動，氧氣充足有關(guān)。在微生物與宿主相互作用下，生物膜是由細菌及其所分泌的胞外多糖、蛋白質(zhì)和DNA所組織的致密胞外結(jié)構(gòu)，進而降低其生理活性，提高其抗生素耐藥水平，因此生物膜常被認為在微生物致病中發(fā)揮重要作用[12-13]。在漿水中生物膜形成和潛在致病性的豐度均較低，說明漿水具有較好的食品安全性。

表2 漢中漿水樣品發(fā)酵過程細菌表型預測的相對豐度Table 2 Predicted relative abundance of bacterial phenotypes during fermentation process of Hanzhong Jiangshui samples

運用PICRUSt2對不同發(fā)酵階段的細菌進行功能預測。漿水發(fā)酵過程中，在京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路level1上的功能分為六大類：代謝、遺傳信息處理、人類疾病、環(huán)境信息處理、細胞過程和有機系統(tǒng)，所占比例分別為（74.11±0.11）%、（12.07±0.19）%、（5.16±0.02）%、（3.71±0.1）%、（2.94±0.03）%、（2.03±0.05）%，其中代謝途徑占比最高，有機系統(tǒng)最低。

不同階段細菌在level2功能層上主要分布在44類通路，對D1與D5和D5與D10之間進行t-test檢驗，P閾值為0.05，差異分析見圖5。D1與D5階段間存在30個顯著差異功能。D5與D10階段間存在29個顯著差異功能。隨著發(fā)酵時間的延長，群落樣本為適應環(huán)境變化發(fā)生了代謝功能改變，豐度變化規(guī)律主要分為兩個類型：其一是在萜類化合物和聚酮類代謝、碳水化合物代謝、細胞群落-原核生物、信號轉(zhuǎn)導、跨膜運輸方面，相關(guān)細菌豐度在D1～D5階段先顯著增加，隨后在D5～D10階段又顯著降低。其二在核苷酸代謝、折疊、分類和降解、翻譯、能量代謝、復制和修復、輔因子和維生素代謝、脂質(zhì)代謝代謝通路中，隨著發(fā)酵時間的延長，相關(guān)細菌豐度先顯著降低后顯著增加。

圖5 漢中漿水樣品細菌功能通路KEGG功能預測分析Fig.5 KEGG function prediction analysis of bacterial functional pathway in Hanzhong Jiangshui samples

3 討論

漿水在制作時會加入一定比例陳漿水作為引子，為漿水接入部分微生物和生物酶作為漿水發(fā)酵的啟動助力。隨著發(fā)酵的進行，漿水中微生物群落結(jié)構(gòu)在不斷變化，微生物群體出現(xiàn)更迭。本研究通過高通量測序技術(shù)對漿水發(fā)酵過程中微生物群落變化特征進行了分析。細菌方面，隨著發(fā)酵的進行，不同發(fā)酵階段細菌的豐度和多樣性較為穩(wěn)定。在門水平，厚壁菌門相對豐度均高于99%，占據(jù)絕對主導地位，在屬水平各發(fā)酵階段優(yōu)勢屬均為乳植桿菌屬、腐敗乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、寡碳乳桿菌屬、明串珠菌屬和發(fā)酵劑乳桿菌屬。據(jù)此前研究報道，西北地區(qū)漿水主要菌群為乳酸桿菌屬，且占據(jù)主導地位，占比達80%以上，魏斯氏菌屬、乳球菌屬和明串珠菌屬在各地區(qū)的漿水中均有檢出[6-8]。采集自西安的漿水中檢測到獨特的醋酸桿菌屬（Acetobacter），采集自漢中的漿水含有較高豐度的片球菌屬（Pediococcus，57.34%），這些未在本研究中檢出或豐度較低。此前研究人員采集多地域來源的漿水，漿水樣品均已發(fā)酵結(jié)束，本研究則采集了不同發(fā)酵時期的漢中漿水，檢測到獨特的寡碳乳桿菌屬、發(fā)酵劑乳桿菌屬，推測這些群落差異可能與漿水制作的地理環(huán)境和蔬菜原料不同有關(guān)。REHMAT I等[14]發(fā)現(xiàn)篩選自漿水的乳酸菌具有降膽固醇功能且具有較強耐酸和耐膽鹽能力。研究表明乳酸菌產(chǎn)生多種生物活性代謝產(chǎn)物，包括脂肪酸、過氧化氫、有機酸、細菌素、蛋白質(zhì)化合物和酚酸等，具有抗真菌和抗氧化等潛在的生物活性[15-18]。乳植桿菌屬具有較強的還原能力、抑制脂質(zhì)過氧化、螯合Fe2+和清除自由基活性，其細胞勻漿還具有谷胱甘肽過氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性[19]。魏斯氏菌主要代謝產(chǎn)物為乳酸和乙酸，其還可以產(chǎn)生寡糖和胞外多糖，一些特定的魏斯氏菌被認為是潛在的益生菌[20]。腐敗乳桿菌屬具有抗黃曲霉毒素產(chǎn)生的作用，對漿水的安全性具有重要作用[21]。

真菌方面，在門水平，以擔子菌門和子囊菌門為主。雙孢菌屬和白冬孢酵母屬在發(fā)酵前期是主要的優(yōu)勢真菌，所占比例分別為29.28%和20.25%，隨發(fā)酵進行其豐度逐漸降低，但仍具有優(yōu)勢地位，同時真菌的多樣性也隨發(fā)酵進行而提高。鐮刀菌屬豐度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，可能在發(fā)酵過程中受到酸性環(huán)境或其他微生物的抑制[22-23]。德巴利酵母屬在發(fā)酵后期大量出現(xiàn)，這是奶制品中主要的酵母菌，目前研究表明德巴利酵母屬具有調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系，促進細胞增殖和分化以及改善消化功能等益生功能[24]。ZHAO C等[25]對黑糯米酒發(fā)酵過程中微生物組與代謝組變化關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)雙孢菌屬與辛酸乙酯、癸酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯和醋酸乙酯呈正相關(guān)，并確定了雙孢菌屬可以產(chǎn)生酯酶，催化酯類前體（醇和酸）反應產(chǎn)生酯，在黑糯米酒的風味形成中起著重要作用。Holtermanniella、白冬孢酵母屬和被孢霉屬可以代謝多種碳源積累脂類物質(zhì)[26-28]。

微生物的生態(tài)功能與其群落結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。對微生物表型和基因功能進行了預測，使用BugBase對細菌表型預測，與細菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相吻合，優(yōu)勢細菌多為革蘭氏陽性，潛在致病菌占比較低。運用PICRUSt2對細菌進行功能預測發(fā)現(xiàn)，與萜類化合物和聚酮類代謝、碳水化合物代謝、信號轉(zhuǎn)導、跨膜運輸?shù)裙δ芟嚓P(guān)特異性微生物豐度在D1至D5階段顯著增加，在此期間發(fā)酵體系中以漢中特色芥菜和面湯作為底物，富含淀粉、纖維素、果膠等多糖。分析發(fā)現(xiàn)細菌中優(yōu)勢菌屬多為乳酸菌，這類微生物可以產(chǎn)生多種水解酶，將這些多糖類底物代謝后形成成分更為豐富的發(fā)酵環(huán)境。聚酮類與微生物的防衛(wèi)和細胞間溝通相關(guān)，推測與信號轉(zhuǎn)導相關(guān)功能菌群的富集有一定相關(guān)性。萜類成分主要來源于植物，芥菜的加入促使了前期相關(guān)代謝菌群豐度的增加。D5至D10階段與核苷酸代謝、能量代謝、輔因子和維生素的代謝、脂質(zhì)代謝等功能相關(guān)特異性微生物豐度顯著增加，與發(fā)酵底物成分的變化相關(guān)。核苷酸、維生素、脂質(zhì)等物質(zhì)的積累以及微生物適應環(huán)境過程中釋放的信號分子促進了群落更迭。被孢霉屬等在前期積累脂類過程豐度增加，到D10階段豐度降低，此時能夠代謝脂類的相關(guān)微生物則開始富集。

通過解析漢中漿水發(fā)酵過程中的菌群結(jié)構(gòu)及微生物演替，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢細菌多為潛在益生菌，但仍檢測出部分致病菌。因此在漿水發(fā)酵過程中應注意控制發(fā)酵條件以減少致病菌污染?；贐ugBase、PICRUSt2雖然可以預測漿水中已知功能細菌群落的相對豐度，但仍有大量細菌功能未知，以及對部分優(yōu)勢物種的研究較少，今后將加強對該方面的研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時期差異顯著的菌門主要為被孢霉門（Mortierellomycota），差異菌屬主要為乳植桿菌屬（Lactiplantibacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、腐敗乳桿菌屬（Loigolactobacillus）、發(fā)酵劑乳桿菌屬（Levilactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、被孢霉屬（Mortierella）和鐮刀菌屬（Fusarium）。功能預測顯示微生物群落變化與發(fā)酵體系中底物成分息息相關(guān)，前期底物中主要是多糖等大分子，具有碳水化合物代謝功能的菌群富集，將底物代謝為核苷酸、維生素、脂質(zhì)等小分子底物，同時細胞間信號傳遞加強；在發(fā)酵后期微生物群落為適應這些底物環(huán)境變化發(fā)生更迭。本研究通過Illumina Mi Seq測序技術(shù)對漢中漿水發(fā)酵過程中的前期、中期、后期共3個時期進行微生物多樣性分析，并通過PICRUSt2預測相關(guān)功能分布解析了漢中漿水發(fā)酵過程中細菌和真菌菌群結(jié)構(gòu)組成及變化規(guī)律，為漢中漿水中功能微生物挖掘奠定研究基礎(chǔ)，也為漢中漿水的高品質(zhì)生產(chǎn)提供理論參考。