基于綜合情緒Z值的小鼠觀察性恐懼習(xí)得性別差異研究

付 圓，石天堯，周文霞

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

恐懼是顯著而強烈的負(fù)性情緒狀態(tài)，通過觀察他人經(jīng)歷創(chuàng)傷痛苦而間接獲得對環(huán)境中潛在威脅的恐懼被稱為觀察性恐懼習(xí)得（observational fear learning，OFL），是獲得恐懼的主要途徑之一［1-2］。目睹和聽聞他人經(jīng)歷創(chuàng)傷事件可導(dǎo)致不同程度的惡劣心境和持續(xù)的恐懼，進而誘發(fā)恐懼相關(guān)的精神障礙，例如創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙［3-5］。如目睹或了解家庭成員的死亡或遭受攻擊，會增加罹患創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的風(fēng)險［6］。同樣的情況也發(fā)生在那些接觸到非親屬（即非家庭成員）經(jīng)歷創(chuàng)傷的專業(yè)人士，比如一線醫(yī)療救護者和地震救援人員等［7］。此外，這類精神創(chuàng)傷疾病可造成社交能力缺陷，增加患者社會生存的難度。因此，研究OFL 對于了解人類精神創(chuàng)傷的發(fā)生及對相關(guān)情緒障礙的干預(yù)和治療具有重要意義。

以往針對OFL 的研究大多以雄性動物或男性為受試對象［8-10］，而通過觀察獲得恐懼的性別差異則長期被忽視。在嚙齒類動物觀察性習(xí)得研究中，也只有少數(shù)研究對性別差異進行了統(tǒng)計分析。一項關(guān)于朗埃文斯大鼠OFL 的研究中，研究者利用貝葉斯統(tǒng)計方法和格蘭杰因果關(guān)系量化大鼠的僵住行為（freezing，F(xiàn)Z）反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該行為不存在性別差異［11］。這一結(jié)果得到相關(guān)研究支持［12-14］。然而，Pisansky等［15］研究表明，面對陌生的同類，雌性較雄性小鼠僵住時間更長；Mikosz 等［16］也發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)歷過恐懼條件反射的同類進行社會互動（social interaction，SI）對雄性大鼠的雙向回避學(xué)習(xí)有正向調(diào)節(jié)作用，但對雌性無影響，說明OFL 中的回避行為存在性別差異。這些結(jié)果表明，觀察性恐懼的行為表達在雄性和雌性之間是不同的，目前的研究對于OFL 是否存在性別差異并未達成共識［17］，而這些差異可能是由于采用了不同的行為范式，如FZ、回避反應(yīng)或SI［18］等，提示在進行性別比較時綜合考慮多種恐懼評價指標(biāo)的重要性。

演示動物的情緒狀態(tài)通過社會傳遞誘發(fā)觀察者的恐懼，而OFL 類的嚙齒動物情緒轉(zhuǎn)化模型需要捕捉社會情緒傳遞的各個方面，包括獲得恐懼后伴隨的焦慮和回避等行為表現(xiàn)。用于評估OFL 的任務(wù)類型是根據(jù)研究者為了探究動物恐懼狀態(tài)下某種行為表現(xiàn)而選定的，例如，F(xiàn)Z［18-19］代表動物在恐懼狀態(tài)下的被動防御，主動回避行為［20-21］代表動物在恐懼狀態(tài)下的主動防御，SI 行為［16，22］代表動物恐懼情緒的社會傳遞等。由于3種行為的性別差異測試結(jié)果并不完全一致，導(dǎo)致難以通過單一行為反映OFL 的性別差異。因此如何將多種行為結(jié)果進行整合，并且能通過1 個復(fù)合值去總體評價OFL 的性別差異是急需解決的問題。

Z-score 是一種通常用于臨床研究［23］和量化動物行為［24-26］的數(shù)值計算方法，在動物行為量化研究中，使用該方法可將多個行為變量進行整合后獲得一個復(fù)合變量（即綜合情緒Z 值），從而代表一系列行為在情緒方面的整體描述。例如Huynh 等［27］在研究性別因素和光周期對大鼠焦慮和抑郁樣行為的影響時，通過束縛應(yīng)激后對大鼠進行了曠場、高架十字迷宮、強迫游泳和蔗糖偏好實驗，在單個行為實驗中得到的性別差異的結(jié)果不同，但采用Z-score 整合大鼠各項焦慮或抑郁樣行為測試結(jié)果，根據(jù)綜合情緒Z值來推斷大鼠的總體狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，光照下，慢性應(yīng)激會增加雄性大鼠的抑郁樣行為，但雌性不會。一般認(rèn)為，使用情緒Z-score 歸一化的行為參數(shù)都具有同樣的權(quán)重，因此小鼠在OFL 模型中的FZ、回避和SI 3種行為整合后是否存在性別差異，目前尚不清楚。

本研究采用實驗室前期建立的OFL模型［28］，通過觀察小鼠的FZ、曠場回避（open filed avoidance，OFA）和SI 行為綜合評價小鼠的OFL，引入Z-score 歸一化法整合雌性和雄性小鼠的行為參數(shù)，以綜合情緒Z 值評價和比較不同性別小鼠的恐懼反應(yīng)。此外，進一步通過去勢手術(shù)消除雌激素的影響，對比雌性去勢小鼠與雌性假手術(shù)小鼠在OFL中恐懼反應(yīng)特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6J 小鼠，雄性（6 周，18～20 g）84只和雌性（6周，15～17 g）96只，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。每籠4 只，飼養(yǎng)5 周，飼養(yǎng)環(huán)境濕度40%～60%，溫度24～26 ℃，光照和黑暗12 h 循環(huán)（光照時間8∶00～20∶00），小鼠自由攝食飲水。實驗前將同籠小鼠隨機分為演示鼠和觀察鼠，所有實驗均以觀察鼠作為研究對象。動物飼養(yǎng)及實驗操作過程均嚴(yán)格遵守軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心動物飼養(yǎng)和使用委員會的規(guī)定（動物倫理審批號：IACUC-DWZX-2022-929）。

1.2 主要儀器

曠場行為箱（型號：XR-XZ301）和導(dǎo)電金屬網(wǎng)，上海欣軟信息科技有限公司；高清USB 攝像頭，?？低晹?shù)字技術(shù)股份有限公司；Anymaze 行為學(xué)分析軟件，美國Stoelting 公司；可吸收外科縫合線（帶針），上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司。

1.3 小鼠觀察性恐懼習(xí)得范式

實驗室前期設(shè)計的行為裝置（40 cm×40 cm×40 cm），左上角有一圓柱形鏤空透明塑料演示籠（直徑10 cm，高20 cm）用以固定演示鼠，演示籠下有導(dǎo)電金屬網(wǎng)。采用高清USB 攝像頭對行為裝置內(nèi)部進行視頻記錄（圖1A）。

實驗小鼠經(jīng)同籠飼養(yǎng)5 周后進行OFL 實驗。實驗前，至少提前30 min 將小鼠置于實驗環(huán)境，以減輕其應(yīng)激反應(yīng)。實驗第1 天包括3 個階段：①適應(yīng)階段，演示籠中無演示鼠，將觀察鼠放入行為裝置的中心位置適應(yīng)環(huán)境4 min；②交互階段，將同籠演示鼠放入演示籠中，允許觀察鼠自由探索4 min；③OFL訓(xùn)練階段，將觀察鼠分為模型組和對照組，將同籠演示鼠放入演示籠中，模型組觀察鼠目睹演示鼠每隔10 s 遭受1 次足底電擊（1 mA，2 s），持續(xù)4 min；對照組觀察鼠觀察未受足底電擊的演示鼠。訓(xùn)練結(jié)束后，將小鼠放回原籠，24 h 后進行觀察性恐懼回憶測試。測試時，將觀察鼠放回原行為裝置中（此階段演示籠中無演示鼠），持續(xù)觀察4 min（圖1B，表1）。用Anymaze軟件分別記錄并分析觀察性恐懼訓(xùn)練階段和恐懼回憶階段的FZ，OFA 和SI行為。

1.3.1 僵住行為

FZ 表現(xiàn)為除呼吸運動外全身其余的肌肉運動均消失，記錄觀察鼠在上述行為裝置中的僵住時間，以評估其FZ。

1.3.2 曠場回避行為

記錄觀察鼠在角落區(qū)域（角落區(qū)面積為10 cm×10 cm，圖1A）的停留時間和運動路程百分比，以評估其回避行為。角落區(qū)運動路程百分比（%）=角落區(qū)的運動路程/曠場（包括角落區(qū)）總運動路程×100%。

1.3.3 社會交互行為

記錄觀察鼠在交互區(qū)域（距離演示籠2 cm范圍內(nèi)，圖1A）的停留時間和進入次數(shù)，以評估其SI行為。

1.4 小鼠OFL綜合恐懼情緒分?jǐn)?shù)計算

采用Guilloux 等［24］報道的Z-score 歸一化方法，以雌性對照組觀察鼠的觀察性恐懼反應(yīng)作為情緒基線，整合OFL訓(xùn)練階段和24 h后恐懼回憶階段觀察鼠FZ，SI 和OFA 行為指標(biāo)的綜合恐懼情緒分?jǐn)?shù)（即綜合情緒Z值）。分為以下3步進行：

首先，采用式①對各行為指標(biāo)的數(shù)據(jù)進行Z-score歸一化處理，計算Z值：

式中X表示雌、雄個體行為觀測數(shù)據(jù)，μ表示雌性對照組某一行為數(shù)據(jù)的均值，SD表示雌性對照組某一行為數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差。

其次，計算3 種行為的整合Z 值，分別以Z-FZ，Z-SI和Z-OFA 表示。其中Z-FZ 即由式①計算得到的Z值，Z-OFA和Z-SI分別是OFA和SI行為中2項行為觀察指標(biāo)Z值的平均值。

最后，采用式②計算3 種行為整合得到的綜合情緒Z值：

1.5 雌鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)（ovariectomy，OVX）

根據(jù)文獻［29］方法進行OVX 建立雌性去勢小鼠模型。雌性小鼠采用戊巴比妥鈉（80 mg·kg-1，ip）麻醉后將背部毛發(fā)剃除并用75%乙醇擦拭消毒；在無菌條件下，在背部中線下1/3 處兩側(cè)皮膚和肌肉組織中做一個腹膜后切口；分離脂肪團，摘除卵巢，結(jié)扎子宮角；術(shù)后將子宮角送回腹腔，用可吸收縫合線將肌肉和皮膚切口依次縫合。同法摘除另一側(cè)卵巢。假手術(shù)組只剪取卵巢周圍的脂肪組織而不摘除卵巢，其余操作與去勢組一致。小鼠術(shù)后恢復(fù)1 周后進行OFL 實驗（方法同1.3）。將去勢小鼠分為去勢對照組（行去勢手術(shù)后目睹未遭受電擊的同類）和去勢模型組（行去勢手術(shù)后目睹同類遭受電擊）；假手術(shù)小鼠分為假手術(shù)對照組（假手術(shù)后目睹未遭受電擊的同類）和假手術(shù)模型組（假手術(shù)后目睹同類遭受電擊）。

Fig.1 Procedures of observational fear learning（OFL）in mice. A and B：diagram of the apparatus used for observational fear learning and the scheme of the behavioral assay.

Tab.1 Behavioral parameters in training/24 h fear retrieval stage of OFL in mice

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

各組觀察鼠的所有行為結(jié)果數(shù)據(jù)均用Anymaze分析軟件采集，以±s表示，數(shù)據(jù)分析和圖形制作均使用GraphPad Prism 9.3.0 軟件，使用Shapiro-Wilk test 對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分析，采用單因素或雙因素方差分析，兩組間比較采用Sidak 多重比較檢驗或非配對t檢驗進行統(tǒng)計分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雌、雄小鼠在OFL模型中的行為表現(xiàn)

2.1.1 僵住行為

訓(xùn)練階段實驗結(jié)果（圖2A）表明，與同性別對照組相比，模型組雌、雄性觀察鼠的僵住時間均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），并且模型組雌、雄性之間僵住時間無性別差異，提示雌、雄觀察鼠在訓(xùn)練階段目睹同類遭受電擊均可誘發(fā)觀察性恐懼情緒，且在僵住時間上的表現(xiàn)并無差異。在24 h 后觀察性恐懼回憶階段（圖2B），與同性別對照組相比，模型組雄性僵住時間仍較長（P＜0.01），而雌性僵住時間無顯著差異，雄性比雌性觀察性恐懼反應(yīng)持續(xù)時間更長（P＜0.01），說明OFL訓(xùn)練后，模型組雌、雄觀察鼠FZ行為存在明顯的性別差異。

Fig.2 Freezing time（FT）in FZ. See Fig.1 for the mouse treatment. A：raw data of FT in the training stage；B：raw data of FT in the 24 h fear retrieval stage.±s，n=20/20（female/male in control group），n=28/22（female/male in model group）.＊P＜0.05，compared with the female control group；##P＜0.01，compared with the male control group；ΔΔP＜0.01，compared with the female model group.

2.1.2 曠場回避行為

訓(xùn)練階段實驗結(jié)果（圖3A1和B1）表明，與同性別對照組相比，模型組雌、雄小鼠在角落區(qū)的停留時間均顯著延長（P＜0.01）。此外，模型組雌性在角落區(qū)運動路程百分比較同性別對照組顯著增加（P＜0.01），但模型組雄性與同性別對照組無顯著差異。以各組小鼠在角落區(qū)停留時間和運動路程百分比的Z 值作圖（圖3A2 和B2）顯示，Z-score 歸一化未改變各組間的統(tǒng)計學(xué)差異。在24 h 后觀察性恐懼回憶階段（圖3C1 和D1），模型組雌、雄鼠在角落區(qū)停留時間和運動路程百分比較同性別對照組均無顯著差異。該階段2 個行為參數(shù)經(jīng)Z-score 歸一化后，各組間統(tǒng)計分析結(jié)果與歸一化前一致（圖3C2和D2）。

Fig.3 Avoidance behavior and its Z-scores in OFA. See Fig.1 for the mouse treatment. A1 and B1：raw data of CT and CDR in the training stage. A2 and B2：normalization of Z-score for the Z-CT and Z-CDR in the training stage. C1 and D1：raw data of CT and CDR in the 24 h fear retrieval stage. C2 and D2：normalization of Z-score for the Z-CT and Z-CDR in the 24 h fear retrieval stage. ±s，n=20/20（female/male in control group），n=28/22（female/male in model group）. ＊＊P＜0.01，compared with the female control group；##P＜0.01，compared with the male control group.

2.1.3 社會交互行為

觀察性恐懼訓(xùn)練階段數(shù)據(jù)（圖4A1和B1）表明，與雄性對照組相比，模型組雄性觀察鼠的交互次數(shù)無顯著差異，而模型組雌性交互次數(shù)較同性別對照組顯著減少（P＜0.01）。與同性別對照組相比，模型組雌、雄觀察鼠交互時間均無明顯差異，模型組雌、雄之間也無性別差異。分別將交互時間和交互次數(shù)數(shù)據(jù)進行Z-score 歸一化并統(tǒng)計分析（圖4A2 和B2）顯示，Z-score 歸一化前、后數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果無改變。24 h 后恐懼回憶階段（圖4C1 和D1），模型組雄性觀察鼠的交互次數(shù)較模型組雌性明顯減少（P＜0.01），但交互時間無顯著差異。經(jīng)Z-score歸一化處理（圖4C2 和D2）后，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果同樣無改變。

Fig.4 Social behavior and its Z-scores in Sl. See Fig.1 for the mouse treatment. A1 and B1：raw data of IE and IT in the training stage. A2 and B2：normalization of Z-score for the Z-IE and Z-IT in the training stage. C1 and D1：raw data of IE and IT in in the 24 h fear retrieval stage. C2 and D2：normalization of Z-score for the Z-IE and Z-IT in the 24 h fear retrieval stage. ±s，n=20/20（female/male in control group），n=28/22（female/male in model group）. ＊＊P＜0.01，compared with the female control group；ΔΔP＜0.01，compared with the female model group.

2.2 雌、雄小鼠在OFL訓(xùn)練和24 h后回憶階段的綜合情緒Z值

在訓(xùn)練階段，將3 種行為進一步整合，以Z-FZ，Z-SI 和Z-OFA 值作圖并進行統(tǒng)計分析（圖5A1-3）發(fā)現(xiàn)，與同性別對照組相比，模型組雌、雄性Z-FZ值均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），且模型組雌、雄性別之間未見顯著差異。模型組雌性的社交回避（Z-SI值）顯著增加（P＜0.05），但雄性不明顯，兩性別之間無顯著差異。與同性別對照組相比，模型組雌（P＜0.01）、雄（P＜0.05）鼠OFA 行為Z-OFA 值均明顯增加，但兩性別之間的無顯著差異。基于3 種行為測試權(quán)重相同的前提，將Z-FZ，Z-SI 和Z-OFA 值綜合平均得到綜合情緒Z 值（圖5B），數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在訓(xùn)練階段模型組雌、雄觀察鼠的綜合情緒Z值均顯著高于其同性別對照組（P＜0.01），但模型組雌、雄之間未見性別差異。同法，將24 h 后恐懼回憶階段的3 種行為參數(shù)Z-score 歸一化后得到的整合Z 值（圖5C1-3）和綜合情緒Z 值（圖5D）表明，模型組雌性小鼠的恐懼反應(yīng)與其同性別對照組無顯著差異，但模型組雄性與其同性別對照組間存在顯著差異（P＜0.05），且顯著高于模型組雌性（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，雌、雄小鼠均可習(xí)得觀察性恐懼，但雄性小鼠OFL持續(xù)時間比雌性小鼠更長。

Fig.5 lntegrated emotionality Z-scores in mice on OFL. See Fig.1 for the mouse treatment. A1-3：Z-FZ，Z-SI，and Z-OFA were calculated by averaging individual Z-scores；B：averaged to obtain an integrated Z-emotionality in the tarining stage；C1-3：Z-24 h FZ，Z-24 h SI，and Z-24 h OFA were calculated by averaging individual Z-scores；D：averaged to obtain an integrated Z-emotionality in the 24 h fear retrieval stage. ±s，n=20/20（female/male in control group），n=28/22（female/male in model group）. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the female control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with the male control group；ΔΔP＜0.05，compared with the female model group.

2.3 去勢雌性小鼠在OFL 中的行為和綜合情緒Z值

在訓(xùn)練階段，F(xiàn)Z 結(jié)果（圖6A1）表明，與假手術(shù)對照組比較，假手術(shù)模型組的僵住時間顯著增加（P＜0.05），而OVX 模型組的僵住時間較OVX 對照組也明顯增加（P＜0.05）；SI 行為數(shù)據(jù)表明，假手術(shù)模型組較假手術(shù)對照組的交互次數(shù)顯著降低（P＜0.05，圖6A2-1），但假手術(shù)模型組與假手術(shù)對照組、OVX 模型組與OVX 對照組的交互時間均無顯著差異（圖6A2-2）；OFA 行為數(shù)據(jù)顯示，假手術(shù)模型組較假手術(shù)對照組的角落停留時間顯著增加（P＜0.01，圖6A3-1），而OVX 模型組較OVX 對照組無顯著差異。與假手術(shù)對照組相比，假手術(shù)模型組的角落區(qū)運動路程百分比均顯著增加（P＜0.05），且OVX 模型組較OVX 對照組也顯著增加（P＜0.05，圖6A3-2）。將3種行為整合后得到去勢小鼠在訓(xùn)練階段的恐懼反應(yīng)綜合情緒Z 值（圖6B）顯示，與假手術(shù)對照組相比，假手術(shù)模型組的觀察性恐懼反應(yīng)顯著增加（P＜0.01），且OVX 模型組的觀察性恐懼反應(yīng)也顯著高于OVX 對照組（P＜0.05），但OVX 模型組與假手術(shù)模型組之間無差異，說明雌性去勢小鼠在目睹熟悉同伴遭受電擊時也會習(xí)得觀察性恐懼，且這種恐懼習(xí)得與假手術(shù)小鼠無差異。在24 h 后觀察性恐懼回憶階段，F(xiàn)Z 數(shù)據(jù)（圖6C1）顯示，OVX 模型組較OVX對照組僵住時間顯著增加（P＜0.01），且OVX 模型組較假手術(shù)模型組僵住時間也顯著延長（P＜0.01）；SI行為數(shù)據(jù)表明，假手術(shù)模型組與假手術(shù)對照組、OVX模型組與OVX對照組的交互次數(shù)均無顯著差異（圖6C2-1），但OVX 模型組較假手術(shù)模型組的交互時間顯著縮短（P＜0.01，圖6C2-2）；OFA行為數(shù)據(jù)顯示，假手術(shù)模型組與假手術(shù)對照組、OVX模型組與OVX對照組的角落停留時間（圖6C3-1）和角落區(qū)運動路程百分比（圖6C3-2）均無顯著差異。去勢小鼠在24 h 后恐懼回憶階段的綜合情緒Z 值（圖6D）顯示，假手術(shù)模型組的觀察性恐懼反應(yīng)較假手術(shù)對照組無顯著差異，而OVX模型組仍顯著高于OVX 對照組（P＜0.05），且OVX 模型組的觀察性恐懼反應(yīng)較假手術(shù)模型組也顯著升高（P＜0.01）。提示去勢后的雌性小鼠OFL 與雄性小鼠類似，性激素在OFL的性別差異中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

Fig.6 lntegrated emotionality Z-scores in ovariectomized mice on OFL. The mice that witnessed their conspecifics without electric shock after sham ovariectomy were named the sham control group，while the sham model group was the sham-ovariectomized mice which witnessed their conspecifics suffering electric shock. The OVX control group was the ovariectomized mice that witnessed their conspecifics without electric shock，while the OVX model group was the ovariectomized mice which witnessed their conspecifics suffering electric shock. A1：row data of FT in the training stage；A2：row data from SI in the training stage included IE（A2-1）and IT（A2-2）；A3：row data from OFA in the training stage included CT（A3-1）and CDR（A3-2）；B：the integrated Z-emotionality in the training stage；C1：row data of FT in the 24 h fear retrieval stage；C2：row data from SI in the 24 h fear retrieval stage included 24 h-IE（C2-1）and 24 h-IT（C2-2）；C3：row data from OFA in the 24 h fear retrieval stage included 24 h-CT（C3-1）and 24 h-CDR（C3-2）；D：the integrated Z-emotionality in the 24 h fear retrieval stage. ±s，n=12/20（OVX/sham in control group），n=16/28（OVX/sham in model group）. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the sham control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with the OVX control group；ΔΔP＜0.01，compared with the sham model group.

3 討論

第5版《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》（DSM-5）強調(diào)了精神創(chuàng)傷的危害性，創(chuàng)傷后痛苦不僅局限于直接受害者，目睹創(chuàng)傷情景或獲悉發(fā)生于他人的悲劇，甚至對創(chuàng)傷事件的細(xì)節(jié)有明確的了解，都被證明會在不同程度上引起嚴(yán)重的、持續(xù)的無助、恐懼和消極認(rèn)知，但這類通過社會觀察獲得的精神創(chuàng)傷往往容易被忽略，最終發(fā)展為精神障礙疾病［6］。與人類相似，嚙齒類動物也可通過社會觀察間接習(xí)得恐懼，OFL 范式是研究嚙齒類動物恐懼社會傳遞的有效行為范式，其中觀察鼠是無先前痛苦經(jīng)歷的小鼠，僅僅通過目睹演示鼠遭受電擊痛苦而產(chǎn)生了與演示鼠類似的恐懼行為反應(yīng)如FZ，該行為是公認(rèn)的動物恐懼反應(yīng)評價指標(biāo)［9，30-31］。然而，當(dāng)嚙齒類動物接受恐懼的社會信號時，行為學(xué)測試通常會產(chǎn)生多種行為變量，除僵住不動以外，還包括快速躥行［32］、疼痛發(fā)聲［33-34］、排便［35］、回避［20-21］和SI［16，22］等行為。已有文獻表明，恐懼的行為表達存在性別差異［36-37］，如雌性比雄性表現(xiàn)出更少的FZ［32，38］。因此，在進行性別比較時使用多種恐懼評價指標(biāo)十分重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，在OFL 訓(xùn)練階段，雌、雄小鼠的FZ，OFA 和SI行為均無顯著差異，而在24 h后恐懼回憶階段，與雌鼠相比，雄鼠的FZ 顯著增加、OFA無差異、SI顯著降低。3種行為測量結(jié)果并不一致。為了將多個相關(guān)的行為變量綜合成更有意義的信息，有必要整合多個數(shù)據(jù)，對某個情緒維度或動機系統(tǒng)的總體描述。

本研究參考Shi 等［28］的研究方法引入Z-score歸一化整合3 項行為測試結(jié)果，以綜合情緒Z 值反映不同性別小鼠的恐懼反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在OFL中，雌雄小鼠均能在訓(xùn)練階段通過目睹同類遭受痛苦而獲得恐懼，但雄性小鼠在24 h 后恐懼回憶階段比雌性表現(xiàn)出更高的恐懼反應(yīng)，說明雄性小鼠比雌性更容易形成持久的恐懼記憶。這一差異的原因可能是雌、雄小鼠對觀察性恐懼的情景學(xué)習(xí)能力存在差異。這一現(xiàn)象也得到了前人研究的支持，即雄性表現(xiàn)出更強的情境恐懼［40-43］。

使用綜合情緒Z值可進一步探究行為表型與潛在分子機制之間的關(guān)聯(lián)［26］。性腺類固醇激素受體的基因調(diào)節(jié)通常被認(rèn)為是研究性別差異的首選，月經(jīng)周期和更年期神經(jīng)精神癥狀的波動，都表明雌激素在神經(jīng)精神障礙疾病中可能發(fā)揮作用［44-45］。盡管本研究缺乏對性腺類固醇激素的檢測，但本研究發(fā)現(xiàn)，去勢后的雌鼠在OFL 中的行為表現(xiàn)以及綜合情緒Z值與雄鼠類似，可能是性激素如雌激素對神經(jīng)內(nèi)分泌或中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的結(jié)果。下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸在調(diào)節(jié)動物應(yīng)對應(yīng)激的能力中起著重要的作用，而HPA 軸功能的性別差異可能部分源于性腺類固醇激素環(huán)境的差異。在嚙齒類動物中，基礎(chǔ)和應(yīng)激誘導(dǎo)的腎上腺糖皮質(zhì)激素分泌，雌性大于雄性，雌激素誘導(dǎo)高水平的HPA 軸活性，而卵巢切除術(shù)后，小鼠靜息時血漿和腎上腺組織中皮質(zhì)酮水平較低［46-47］。此外，雌激素還可以通過影響與壓力反應(yīng)有關(guān)的腦區(qū)（杏仁核、海馬、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)和前扣帶皮質(zhì)等）來調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和情緒反應(yīng)［48-50］。雌激素對HPA 軸及壓力腦區(qū)的調(diào)節(jié)表明，類似的壓力暴露可能由于性激素的差異導(dǎo)致男性和女性的情緒反應(yīng)出現(xiàn)不同的結(jié)果，相關(guān)機制和潛在干預(yù)措施值得深入研究。

綜上所述，雄鼠的OFL 反應(yīng)比雌鼠更持久，且去勢雌鼠的OFL反應(yīng)與雄鼠相似，說明OFL確實存在性別差異，且這種差異可能與性激素有關(guān)。本研究數(shù)據(jù)有利于加深OFL 領(lǐng)域在性別差異的理解，而未來對這種性別差異背后的分子和神經(jīng)生物學(xué)機制的進一步研究，將為優(yōu)化臨床治療方案提供建議，也將推進診斷和治療中以性別為導(dǎo)向的個性化醫(yī)療的發(fā)展。