一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定連翹葉紅茶中5種指標(biāo)成分的含量

楊瑩瑩

（山西省藥品審評(píng)中心（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院），山西 太原 030006）

連翹葉為木犀科植物連翹（Forsythia suspense（Thunb.）Vahl）的干燥葉，具有清熱解毒之功效[1]。我國(guó)連翹葉資源豐富，在我國(guó)河北、山西、河南等地連翹葉歷來(lái)有作為保健茶飲用的傳統(tǒng)，具有良好的開(kāi)發(fā)前景?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，連翹葉具有抑菌[2-3]、抗氧化[4-6]、抗腫瘤[7]、護(hù)肝[8]、降血脂[9]、降血糖[10]等多種生物活性，含有木質(zhì)素類(lèi)、黃酮、三萜類(lèi)等活性成分，其中連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、連翹脂素和槲皮素含量較高[11]。同時(shí)還富含蛋白質(zhì)、氨基酸、膳食纖維、維生素及礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分[12-13]。

2018年連翹葉被批準(zhǔn)作為山西省特色地方食品管理，為連翹葉作為食品開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。因此，近年來(lái)連翹葉茶成為眾多研究學(xué)者的研究對(duì)象。原江鋒等[14]將一芽二葉至一芽三葉的連翹嫩葉加工成連翹葉綠茶，并對(duì)連翹葉綠茶的活性成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，連翹葉綠茶具有較強(qiáng)的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力。尤穎[15]以陰干的連翹葉、炒制殺青的連翹葉和殺青發(fā)酵的連翹葉作為原料，制備出三種連翹葉速溶茶，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了連翹葉速溶茶水提工藝。結(jié)果表明，殺青發(fā)酵的連翹葉制備速溶茶的感官評(píng)價(jià)得分最高。楊麗霞等[16-17]以連翹葉為主要原料，研制了連翹葉綠茶和連翹葉復(fù)合袋泡茶兩種產(chǎn)品。

目前，關(guān)于連翹葉茶的質(zhì)量控制研究相對(duì)較少，且多以1種或2種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定[18-19]，無(wú)法客觀反映產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。在對(duì)照品難以獲得、價(jià)格昂貴的前提下，多指標(biāo)含量質(zhì)量控制模式的發(fā)展在一定程度上受到了限制。本研究以連翹葉紅茶為研究對(duì)象，建立一測(cè)多評(píng)法[20-23]（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）測(cè)定連翹葉紅茶中的蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素、連翹苷和連翹脂素5種指標(biāo)成分含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察。采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，以連翹苷作為內(nèi)參物，建立其與蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素和連翹脂素的相對(duì)校正因子。利用一測(cè)多評(píng)法（QAMS）和外標(biāo)法（external standard method，ESM）同時(shí)測(cè)定5種指標(biāo)成分含量，并比較這2種方法檢測(cè)結(jié)果的差異，探索QAMS法在連翹葉紅茶質(zhì)量評(píng)價(jià)中的可行性，為連翹葉紅茶的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 材料

連翹葉紅茶樣品（產(chǎn)地為山西省長(zhǎng)治市）：由山西盤(pán)秀山農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司提供。樣品共10批，批號(hào)分別為①20200412、②20200413、③20200415、④20210411、⑤20210413、⑥20210416、⑦20220413、⑧20220415、⑨20220418、⑩20220420。

1.1.2 化學(xué)試劑

蘆丁對(duì)照品、槲皮素對(duì)照品、連翹苷對(duì)照品（純度均≥98%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；連翹酯苷A對(duì)照品（純度≥98%）、連翹脂素對(duì)照品（純度≥98%）：成都麥德生科技有限公司。乙腈（色譜純）：德國(guó)CNW科技公司；甲醇、乙醇、磷酸（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010A型高效液相色譜（HPLC）儀：日本島津公司；1260型高效液相色譜儀、ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：美國(guó)安捷倫公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；AR124CN型分析天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；Thermoscientific HyPURITY C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國(guó)Thermo Scientific公司；Athena C18-WP色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；UPHW-I-90T型優(yōu)普系列超純水系統(tǒng)：成都超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁、連翹苷、槲皮素、連翹酯苷A和連翹脂素對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為蘆丁101 μg/mL、連翹苷402 μg/mL、槲皮素102 μg/mL、連翹酯苷A 403 μg/mL和連翹脂素99 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

1.3.2 樣品溶液的制備

本研究結(jié)合連翹葉茶的日常飲用習(xí)慣，采用水為溶劑，以加熱回流的方式進(jìn)行提取。提取條件考察了提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)。由于本方法為檢測(cè)方法，樣品制備方法要求操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠，因此綜合考慮方法的可操作性、系統(tǒng)誤差、時(shí)間成本等多種因素，最終確定提取時(shí)間為1 h、提取溫度為95 ℃、提取次數(shù)為1次。

精密稱取連翹葉紅茶粉末5.0 g，置于200 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，95 ℃恒溫水浴加熱回流1h，取出放涼，稱定質(zhì)量，用蒸餾水補(bǔ)足質(zhì)量損失，過(guò)濾，得連翹葉紅茶提取液。精密量取上述提取液1 mL置于10 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，得到樣品溶液，備用。

1.3.3 高效液相色譜條件

Thermoscientific HyPURITY C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0～20 min，A相為10%～25%；20～30 min，A相為25%～40%；30～35 min，A相為40%～60%；35～36 min，A相為60%～10%；36～40 min，A相為10%～10%。檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4 相對(duì)校正因子的計(jì)算

以連翹苷為內(nèi)參物，相對(duì)校正因子計(jì)算公式如下[24]：

式中：fs/i為內(nèi)參物與其他組分之間的相對(duì)校正因子；As為內(nèi)參物的峰面積；Cs為內(nèi)參物的質(zhì)量濃度，μg/mL；Ai為其他組分的峰面積；Ci為其他組分的質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.5 樣品的測(cè)定

精密稱取10批連翹葉紅茶樣品粉末各5.0 g，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，各平行制備3份，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算5種指標(biāo)成分的含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019和SPSS25.0軟件對(duì)2種方法檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合對(duì)照品及樣品中5種指標(biāo)成分高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果

混合對(duì)照品及樣品中5種指標(biāo)成分高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，5種指標(biāo)成分的色譜峰分離情況良好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）及樣品（B）中5種指標(biāo)成分高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of 5 indexes components in mixed standards (A) and samples (B)

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同流動(dòng)相體系的色譜峰分離情況，結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸溶液體系各色譜峰峰型良好、基線平穩(wěn)。因此，確定最適流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)5種指標(biāo)成分進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)掃描結(jié)果選擇各指標(biāo)成分的最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。本研究分別考察了254 nm、277 nm、330 nm和365 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜出峰情況。結(jié)果顯示，5種指標(biāo)成分在波長(zhǎng)277 nm條件下均有較強(qiáng)的紫外吸收。因此，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限

取混合對(duì)照品溶液適量，稀釋成6個(gè)不同質(zhì)量濃度水平的混合對(duì)照品溶液，分別置于進(jìn)樣瓶中，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。5種指標(biāo)成分以信噪比（S/N）=3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，S/N=10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5種指標(biāo)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限Table 1 Standard curve regression equations, correlation coefficients, linear range, detection limit and quantitative limit of 5 kinds of index components

由表1可知，5種指標(biāo)成分的質(zhì)量濃度和峰面積在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999），其檢出限范圍為0.45～0.78 μg/mL，定量限范圍為1.49～2.59 μg/mL。結(jié)果表明，檢出限和定量限均能滿足5種指標(biāo)成分的檢測(cè)分析要求。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取同一批次連翹葉紅茶粉末（批號(hào)：20220418）5份，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果表明，蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素、連翹苷和連翹脂素測(cè)定結(jié)果的RSD分別為2.24%、1.50%、2.06%、1.43%、2.39%，RSD均＜3.0%。結(jié)果表明，該方法的精密度良好。

2.3.3 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知5種指標(biāo)成分含量的連翹葉紅茶樣品（批號(hào)：20220418）約0.10 g，平行制備5份，分別加入適量混合對(duì)照品溶液，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種指標(biāo)成分的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 2 Results of standard recovery rate tests of 5 kinds of index components (n=5)

由表2可知，各成分加樣回收率為95.19%～101.77%，平均加樣回收率為98.25%～99.63%，RSD為1.34%～2.54%，RSD均＜3.0%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液（批號(hào)：20220418），樣品制備后分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果表明，蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素、連翹苷和連翹脂素檢測(cè)結(jié)果的RSD分別為2.05%、2.16%、2.53%、1.46%、2.44%，RSD均＜3.0%。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性良好。

2.4 相對(duì)校正因子的建立

2.4.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算

以連翹苷作為內(nèi)參物，根據(jù)公式分別計(jì)算連翹苷對(duì)蘆丁、槲皮素、連翹酯苷A和連翹脂素4種指標(biāo)成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4種指標(biāo)成分對(duì)連翹苷的相對(duì)校正因子Table 3 Relative correction factors of 4 kinds of index components to forsythin

由表3可知，各校正因子的RSD均＜2.0%。綜合比較影響校正因子的各個(gè)因素，最終確定取各校正因子的均值，即連翹苷對(duì)蘆丁、槲皮素、連翹酯苷A和連翹脂素的校正因子分別為1.091 4、1.257 5、1.019 1、1.373 7。

2.4.2 校正因子的耐用性考察

校正因子的耐用性可通過(guò)改變不同的色譜參數(shù)來(lái)考察各因素對(duì)校正因子的影響。通常用不同條件下各指標(biāo)成分校正因子之間的RSD表示。柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等條件的微小變化一般對(duì)耐用性影響較小，而不同品牌色譜柱和不同型號(hào)高效液相色譜儀對(duì)其影響較大，因此本研究選擇3種不同色譜柱和2種不同儀器進(jìn)行校正因子的耐用性考察。

取混合對(duì)照品溶液適量，精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，分別考察了HyPURITY C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Athena C18-WP色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）3種不同色譜柱、島津LC-2010A型液相色譜儀和安捷倫1260型液相色譜儀等2種色譜儀的耐用性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同色譜柱和不同儀器條件下4種指標(biāo)成分對(duì)連翹苷的相對(duì)校正因子比較Table 4 Comparison of relative correction factors of 4 kinds of index components to forsythin under different chromatographic columns and instruments conditions

由表4可知，4個(gè)指標(biāo)成分對(duì)連翹苷的相對(duì)校正因子變化較小，RSD均＜3.0%，表明不同色譜柱和不同儀器的耐用性良好。

2.5 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果比較

取10批連翹葉紅茶樣品，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定。利用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法分別計(jì)算連翹葉紅茶中蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素、連翹苷和連翹脂素的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，2種方法測(cè)得含量結(jié)果均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明QAMS法準(zhǔn)確度良好，可用于連翹葉紅茶的多指標(biāo)成分檢測(cè)。

表5 一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法5種指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果比較（n=3）Table 5 Comparison of determination results of 5 kinds of index components contents by quantitative analysis of multicomponents by single marker and external standard method (n=3)

3 結(jié)論

本研究以連翹葉紅茶為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法，以連翹苷為內(nèi)參物，計(jì)算其與蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素和連翹脂素的相對(duì)校正因子，建立一測(cè)多評(píng)法計(jì)算各指標(biāo)成分的含量，并與外標(biāo)法的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，5種指標(biāo)成分的質(zhì)量濃度和峰面積在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，其檢出限范圍為0.45～0.78 μg/mL，定量限范圍為1.49～2.59μg/mL，平均加標(biāo)回收率在98.25%～99.63%，加標(biāo)回收率、精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果RSD均＜3.0%，表明QAMS法精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性良好。一測(cè)多評(píng)法（QAMS）和外標(biāo)法（ESM）測(cè)定10批連翹葉紅茶中5種指標(biāo)成分含量結(jié)果之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明一測(cè)多評(píng)法用于連翹葉紅茶的多指標(biāo)質(zhì)量控制具有良好的可行性，可為連翹葉紅茶的質(zhì)量控制提供參考。