河套地區(qū)中溫大曲細(xì)菌菌群多樣性解析及其風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)

鄒 銓?zhuān)瑥?敏，李 擎，郭 壯，王玉榮*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.內(nèi)蒙古河套酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015400）

中國(guó)白酒的傳統(tǒng)工藝主要包括大曲制備、淀粉糖化、酒精發(fā)酵、固態(tài)蒸餾和陳化[1]。白酒發(fā)酵過(guò)程中的品質(zhì)與釀酒大曲微生物類(lèi)群、釀酒原材料和釀造工藝息息相關(guān)[2]。大曲是中國(guó)傳統(tǒng)白酒發(fā)酵曲的一種，在白酒發(fā)酵過(guò)程中作為微生物載體之一，主要以高粱、大麥或豌豆等谷物為原料，經(jīng)過(guò)潤(rùn)糧粉碎、原料堆積、曲塊成型、固態(tài)培養(yǎng)和成熟干燥等步驟制成，可為白酒發(fā)酵提供豐富的微生物群和酶系，進(jìn)而影響發(fā)酵過(guò)程中乙醇和風(fēng)味的產(chǎn)生，對(duì)白酒的質(zhì)量有著決定性作用[3-4]。細(xì)菌是大曲微生物群落中的重要類(lèi)群之一，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）可以分泌多種酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，對(duì)大曲中微生物群落的調(diào)節(jié)和風(fēng)味化合物的生產(chǎn)具有重要作用[5]。因此，解析大曲中細(xì)菌類(lèi)群，探究Bacillus分布情況對(duì)白酒品質(zhì)的改善具有重要意義。

高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)具有通量高、測(cè)序快且無(wú)需培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，可以有效對(duì)樣品中屬水平及其以上分類(lèi)學(xué)地位的微生物進(jìn)行解析與注釋?zhuān)S多學(xué)者利用HTS技術(shù)解析釀酒大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)大曲中微生物資源的開(kāi)發(fā)與利用提供了參考與指導(dǎo)[6-7]。風(fēng)味是評(píng)價(jià)白酒質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，電子鼻則是模擬動(dòng)物嗅覺(jué)器官開(kāi)發(fā)的一種快速識(shí)別食品氣味的儀器，利用電子傳感器陣列的響應(yīng)值提供樣品的風(fēng)味信息[8]，具有操作簡(jiǎn)單、分析快速、成本低及結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)食品風(fēng)味的解析及品質(zhì)的改善具有重要作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品和飲料研究中[9]。因此，通過(guò)HTS和電子鼻技術(shù)聯(lián)合，解析大曲中微生物多樣性和風(fēng)味物質(zhì)對(duì)改善大曲品質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

內(nèi)蒙古自治區(qū)以溫帶大陸性氣候?yàn)橹?，地理環(huán)境和水資源獨(dú)特[10]?；诖?，本研究使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)采集自?xún)?nèi)蒙古河套地區(qū)中溫大曲的細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行分析，采用電子鼻技術(shù)對(duì)大曲風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行分析，并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬和風(fēng)味品質(zhì)之間的相關(guān)性進(jìn)行解析與探討，然后采用PICRUSt軟件對(duì)菌群基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)結(jié)合可培養(yǎng)技術(shù)對(duì)大曲中芽孢桿菌進(jìn)行分離鑒定，以期為進(jìn)一步解析內(nèi)蒙古地區(qū)中溫大曲微生物結(jié)構(gòu)和品質(zhì)提供參考，從而為改善大曲品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中溫大曲樣品：內(nèi)蒙古自治區(qū)河套地區(qū)H酒廠；DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：Axygen生物技術(shù)（杭州）有限公司；引物338F/806R、27F/1495R、M13F（-47）/M13R（-48）：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；5×TransStartTMFastPfu Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）、FastPfu Fly DNA Polymerase、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、2×PCR Buffer、rTaq酶和克隆載體pMDR18-T Vector：寶生物工程大連有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）top10感受態(tài)細(xì)胞：湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心制備；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BF-10小型高速粉碎機(jī)：河北本辰科技有限公司；5810R型離心機(jī)（冷凍型）：德國(guó)Eppendorf公司；DYY-12型電泳儀：北京六一儀器廠；veritiFAST梯度PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)AB公司；Fluor Chem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Protein Simple公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；R920型機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司；PEN3電子鼻：德國(guó)Airsense公司；HR40-IIB2生物安全柜：海爾集團(tuán)電子商務(wù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中溫大曲樣品采集和預(yù)處理

中溫大曲樣品于2022年10月采集自河套地區(qū)（111°45′20″E、39°54′39″N）H酒廠的制曲車(chē)間，以?xún)?yōu)質(zhì)冬小麥為制曲原料，經(jīng)過(guò)潤(rùn)糧、粉碎、拌料壓曲、入房臥曲、培曲翻曲和入庫(kù)貯存等工藝制成[11]，選擇同一批次、相同條件下制備的無(wú)斷裂[12]、表面無(wú)霉斑、厚度適中、有特殊香氣[13]的中溫大曲曲塊共5份，編號(hào)為BMZW1～BMZW5。在實(shí)驗(yàn)室條件下切割粉碎曲塊，并通過(guò)20目篩子處理大曲粉末，以獲取品質(zhì)均一的大曲粉樣品，將樣品轉(zhuǎn)移到無(wú)菌自封袋于4 ℃貯存。

1.3.2 中溫大曲樣品宏基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和Illumina MiSeq高通量測(cè)序

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的步驟，使用DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒對(duì)大曲樣品中宏基因組DNA進(jìn)行提取，以其為模板，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)檢測(cè)合格的宏基因組DNA的16S rRNA V3-V4區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14]，將合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

使用QIIME v1.9.1平臺(tái)對(duì)Illumina MiSeq測(cè)序返回的原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制和生物信息學(xué)分析，具體分析流程包括：對(duì)齊并合并雙端序列，刪減低質(zhì)量序列、引物序列和嵌合體序列[15]；劃分操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）[16]，通過(guò)RDPv11.5、Greengenev13.5和SILVA v132數(shù)據(jù)庫(kù)[17]進(jìn)行細(xì)菌物種注釋?zhuān)唤y(tǒng)計(jì)各樣品中細(xì)菌在門(mén)和屬水平的相對(duì)含量；計(jì)算相同測(cè)序深度下樣品的超1（Chao1）指數(shù)和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)[18]；使用PICRUSt軟件對(duì)中溫大曲中細(xì)菌菌群的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)[19]，參考蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（clusters of orthologous groups of proteins，COGs）進(jìn)行基因功能注釋[20]。

1.3.4 大曲風(fēng)味品質(zhì)分析

參考文獻(xiàn)[21]對(duì)中溫大曲樣品進(jìn)行預(yù)處理，測(cè)量樣品前，以空氣為載體清潔注射針95 s，調(diào)零時(shí)間5 s，預(yù)備時(shí)間5 s，具體測(cè)量參數(shù)參考趙慧君等[22]的研究并略做調(diào)整。樣品測(cè)試時(shí)間為60 s，選取49 s、50 s和51 s時(shí)的測(cè)試響應(yīng)值作為有效數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析，每個(gè)樣品測(cè)試3個(gè)平行。

1.3.5 大曲中芽孢桿菌的分離及鑒定

分離與純化：取10 g大曲粉末加入到裝有90 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中，置于37 ℃搖床中220 r/min振蕩30 min。采用梯度稀釋法和平板涂布法對(duì)樣品中可培養(yǎng)芽孢桿菌進(jìn)行分離[23]，并通過(guò)平板劃線法對(duì)分離株進(jìn)行多代純化[24]，根據(jù)菌落和細(xì)胞形態(tài)將純化菌株保藏于-80 ℃超低溫冰箱。

鑒定：參考文獻(xiàn)[25]提取分離株的DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、清潔、連接和轉(zhuǎn)化[26]，選取鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的單克隆委托上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將返回的測(cè)序序列進(jìn)行拼接與去引物后，提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對(duì)，明確分離株的分類(lèi)學(xué)地位。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與可視化

使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SAS軟件（v9.4）中的Spearman相關(guān)系數(shù)法計(jì)算優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和大曲風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)系數(shù)；使用R軟件繪制棒棒圖、瀑布圖和熱圖；使用jvenn（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制韋恩圖；使用在線網(wǎng)站（https：//www.genescloud.cn/chart/chartOverview）繪制箱型圖；使用MEGA7軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并采用R軟件包ggtree美化系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中溫大曲樣品中細(xì)菌菌群多樣性及組成分析

對(duì)采集自河套地區(qū)的5份中溫大曲細(xì)菌菌群的16S rRNA V3-V4區(qū)域基因序列進(jìn)行高通量測(cè)序，在測(cè)序量44 010 bp條件下獲得超1（Chao1）指數(shù)和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)，對(duì)樣品中細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性進(jìn)行解析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 中溫大曲樣品中細(xì)菌菌群的超1指數(shù)（A）和香農(nóng)指數(shù)（B）Fig.1 Chao 1 index (A) and shannon index (B) of bacterial groups in medium-temperature Daqu samples

由圖1可知，樣品BMZW1的超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均最小，表明樣品BMZW1的細(xì)菌物種數(shù)最少且物種多樣性最低；樣品BMZW2的超1指數(shù)最大，樣品BMZW5的香農(nóng)指數(shù)最大，表明樣品BMZW2細(xì)菌物種數(shù)最多，BMZW5細(xì)菌物種多樣性最高。由此表明，不同中溫大曲樣品之間細(xì)菌物種數(shù)和多樣性存在差異。

從不同中溫大曲樣品中選擇具有代表性的細(xì)菌OTU序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，完成OTU序列物種注釋。本研究將僅存在于其中一個(gè)樣品中的OTU稱(chēng)為特有OTU，將存在于所有樣品中的OTU稱(chēng)為核心OTU，將平均相對(duì)含量＞1%的核心OTU稱(chēng)為核心優(yōu)勢(shì)OTU。中溫大曲樣品中OTU分布及核心優(yōu)勢(shì)OTU分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 中溫大曲樣品的OTU韋恩圖（A）和核心優(yōu)勢(shì)OTU瀑布圖（B）Fig.2 OTU Venn diagram (A) and waterfall diagram of core advantage OTU (B) of medium-temperature Daqu samples

由圖2A可知，中溫大曲樣品中共注釋到3 094個(gè)OTU，包含197 041條有效序列。樣品中共含有612個(gè)特有OTU，包含2 999條序列，占總測(cè)序量的1.52%；核心OTU有96個(gè)，包含173 246條序列，占總測(cè)序量的87.92%。由此表明，河套中溫大曲樣品中核心細(xì)菌總量占較大比重。

為進(jìn)一步解析樣品中核心細(xì)菌類(lèi)群，對(duì)核心優(yōu)勢(shì)OTU進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析。由圖2B可知，核心優(yōu)勢(shì)OTU相對(duì)含量為73.10%，包括隸屬于高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）（32.80%）的OTU2759，隸屬于魏斯氏菌屬（Weissella）（6.62%）的OTU4389，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus）（8.12%）的OTU4590、OTU167和OTU672，隸屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）（7.27%）的OTU1612、OTU4041和OTU384，隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）（3.01%）的OTU2631，隸屬于明串珠球菌屬（Leuconostoc）（1.54%）的OTU2985，隸屬于糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）（4.52%）的OTU1261，隸屬于放線多孢菌科（Actinopolysporaceae）（2.32%）的OTU22，隸屬于水桿菌屬（Aquabacterium）（3.48%）的OTU3988和OTU4795，隸屬于嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）（2.22%）的OTU578和隸屬于青枯菌屬（Ralstonia）（1.21%）的OTU1271。綜上表明，河套中溫大曲樣品中優(yōu)勢(shì)菌群類(lèi)群豐富且相對(duì)含量較高。

為進(jìn)一步解析不同樣品中核心細(xì)菌類(lèi)群，基于細(xì)菌門(mén)和屬水平對(duì)樣品中細(xì)菌群落進(jìn)行分析。其中，本研究將樣品中平均相對(duì)含量＞1%的細(xì)菌門(mén)和屬稱(chēng)為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)和屬，各樣品中細(xì)菌門(mén)、屬分布見(jiàn)圖3。

圖3 基于門(mén)（A）和屬（B）水平中溫大曲樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure of medium-temperature Daqu samples based on phylum (A) and genus (B) levels

由圖3A可知，中溫大曲樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)主要隸屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes）（73.23%）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）（12.85%）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）（12.56%），累計(jì)平均相對(duì)含量達(dá)98.64%。Firmicutes是大曲中具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類(lèi)群，由此可推測(cè)，本研究河套中溫大曲的生產(chǎn)工藝、制曲原料等條件更適合Firmicutes類(lèi)細(xì)菌的富集。

由圖3B可知，中溫大曲樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有11個(gè)，分別為T(mén)hermoactinomyces、Lactobacillus、Staphylococcus、Saccharopolyspora、Weissella、Aquabacterium、Bacillus、Pelomonas、Leuconostoc、片球菌屬（Pediococcus）和Ralstonia，平均相對(duì)含量分別為35.88%、12.29%、10.36%、10.07%、6.82%、3.78%、3.33%、2.22%、2 07%、1.28%和1.21%。馮佳婷等[27]通過(guò)對(duì)瀘州老窖大曲微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析顯示，Bacillus（63.53%）、Thermoactinomyces（7.0%）和Saccharopolyspora（9.7%）是高溫曲中高豐度菌群，Lactobacillus（35.8%）、Weissella（35.9%）和Thermoactinomyces（13.77%）是中溫曲中高豐度菌群。與本研究結(jié)論相比，釀酒大曲中菌群構(gòu)成具有一定的相似性，但菌群豐度受到制曲溫度、地域條件等因素的影響存在差異。

2.2 中溫大曲樣品風(fēng)味品質(zhì)電子鼻分析

為進(jìn)一步解析中溫大曲品質(zhì)，本研究基于電子鼻技術(shù)對(duì)大曲樣品中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 中溫大曲樣品風(fēng)味電子鼻分析結(jié)果Fig.4 Electronic nose analysis results of flavor of mediumtemperature Daqu samples

由圖4可知，W1W、W5S和W1S傳感器響應(yīng)值較大，表明大曲樣品中含量較高的風(fēng)味物質(zhì)包括有機(jī)硫化物、萜類(lèi)物質(zhì)、氮氧化物和甲烷，其次為乙醇和烷烴等風(fēng)味物質(zhì)。此外，對(duì)芳香類(lèi)物質(zhì)靈敏的傳感器W1C、W3C和W5C的響應(yīng)值偏低，表明大曲樣品中芳香類(lèi)物質(zhì)強(qiáng)度較低。

2.3 中溫大曲樣品風(fēng)味品質(zhì)與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬間相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探究大曲風(fēng)味品質(zhì)與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬之間的關(guān)聯(lián)性，本研究對(duì)其進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 中溫大曲樣品風(fēng)味品質(zhì)與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相關(guān)性分析熱圖Fig.5 Heatmap of correlation analysis between flavor quality and dominant bacterial genera in medium-temperature Daqu samples

由圖5可知，Bacillus與W3C和W5C呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與W5S呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與W1W呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），Saccharopolyspora與W2W呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。由此表明，Bacillus與大曲中有機(jī)硫化物、萜類(lèi)物質(zhì)、氮氧化物和芳香類(lèi)物質(zhì)等風(fēng)味物質(zhì)之間存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），這可能與芽孢桿菌可以分泌多種酶有關(guān)[28]，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，對(duì)大曲中風(fēng)味化合物的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用。Saccharopolyspora與有機(jī)硫化物之間存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），Saccharopolyspora中存在能產(chǎn)生抗生素、酶類(lèi)、免疫抑制劑等生物活性物質(zhì)的物種，是尋找新的生物活性物質(zhì)的重要菌源[29]。

2.4 細(xì)菌菌群的基因功能預(yù)測(cè)分析

本研究使用PICRUSt軟件對(duì)大曲樣品中細(xì)菌菌群的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而探索大曲微生物的潛在功能，所有細(xì)菌序列注釋到4 092個(gè)COG，分別隸屬于23個(gè)功能大類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，中溫大曲樣品中細(xì)菌菌群基因除了在轉(zhuǎn)錄、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生、復(fù)制、重組和修復(fù)等與自身生長(zhǎng)繁殖功能相關(guān)方面具有較高豐度（25.15%），在氨基酸運(yùn)輸與代謝、碳水化合物運(yùn)輸與代謝和能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)與代謝功能上也呈現(xiàn)高豐度分布狀態(tài)，占總豐度的22.03%。由此表明，大曲中細(xì)菌群落在原料降解和風(fēng)味物質(zhì)代謝方面具有較大潛力，且樣品中細(xì)菌基因的生長(zhǎng)繁殖功能具有較高豐度，伴隨著其能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換功能具有較高的豐度。CAI W C等[30]研究顯示，大曲的發(fā)酵依賴(lài)氨基酸和碳水化合物的運(yùn)輸與代謝，氨基酸作為微生物生長(zhǎng)所需的氮源，影響微生物的生長(zhǎng)和代謝，是大曲揮發(fā)性芳香物質(zhì)產(chǎn)生的基礎(chǔ)，同時(shí)氨基酸與碳水化合物反應(yīng)會(huì)賦予大曲獨(dú)特的香氣。大曲中的細(xì)菌還存在高豐度的一般功能預(yù)測(cè)和未知功能的基因，分別占總豐度的12.96%和10.16%。結(jié)合圖3B可知，大曲中存在一定豐度的未鑒定細(xì)菌屬，平均相對(duì)含量達(dá)6.58%。由此推測(cè)，樣品中未知功能的基因可能與這些未研究的細(xì)菌相關(guān)[31]。

2.5 中溫大曲樣品中芽孢桿菌的分離及鑒定

上述分析已表明，Bacillus是中溫大曲中的優(yōu)勢(shì)菌群，與大曲中多種風(fēng)味物質(zhì)具有顯著相關(guān)性，為進(jìn)一步解析中溫大曲中芽孢桿菌的分布情況，本研究對(duì)樣品中可培養(yǎng)芽孢桿菌進(jìn)行分離純化。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小和邊緣情況，從大曲樣品中共分離純化出30株疑似芽孢桿菌菌株，并對(duì)分離菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，經(jīng)同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，分離菌株隸屬于7個(gè)種，其菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖7。

圖7 7種分離菌株的菌落形態(tài)（A）和細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.7 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of 7 isolated strains

由圖7可知，隸屬于不同種的芽孢桿菌其菌落形態(tài)呈現(xiàn)明顯差異，細(xì)胞形態(tài)均呈現(xiàn)桿狀，但菌體粗細(xì)和長(zhǎng)短不盡相同。為進(jìn)一步呈現(xiàn)30株分離菌株中芽孢桿菌的分布情況，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 基于16S rRNA基因序列30株分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of 30 isolated strains based on 16S rRNA gene sequence

由圖8可知，分離菌株與其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株之間形成明顯的聚類(lèi)樹(shù)形，且位于同一聚類(lèi)的分離株與標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的相似度均≥99%。由此表明，30株分離菌株被鑒定為7個(gè)細(xì)菌種。其中，14株被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），占總分離株數(shù)的36.67%，為大曲中可培養(yǎng)芽孢桿菌的第一大優(yōu)勢(shì)菌種。8株被鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），占總分離株數(shù)的26.67%，為第二大優(yōu)勢(shì)菌種。3株被鑒定為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis），2株被鑒定為假蕈狀芽孢桿菌（Bacillus pseudomycoides），其余3株分別被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、索諾氏芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）和副地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）。不同芽孢桿菌可在大曲發(fā)酵中影響其特征風(fēng)味物質(zhì)的合成，HE G Q等[32]研究顯示，接種Bacillus subtilis和Bacillus velezensis可以增加大曲中己酸、己酸乙酯和己酸己基酯等風(fēng)味代謝物的含量，改善大曲品質(zhì)。XU B Y等[33]研究表明，接種Bacillus licheniformis和Bacillus velezensis可以改變大曲中微生物豐度，控制微生物代謝，使大曲中醇類(lèi)、酸類(lèi)和酮類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)的含量有所提高。

3 結(jié)論

納入研究的河套中溫大曲樣品細(xì)菌菌群豐富，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)包括Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要隸屬于Thermoactinomyces、Lactobacillus、Staphylococcus、Saccharopolyspora、Weissella、Aquabacteri um、Bacillus、Pelomonas、Leuconostoc、Pediococcus和Ralstonia。其中，Bacillus與有機(jī)硫化物、萜類(lèi)物質(zhì)、氮氧化物和芳香類(lèi)物質(zhì)之間存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），Saccharopolyspora與有機(jī)硫化物呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），且細(xì)菌菌群基因在氨基酸運(yùn)輸與代謝、碳水化合物運(yùn)輸與代謝和能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換功能上有較高豐度。大曲中可培養(yǎng)芽孢桿菌種類(lèi)豐富，分離的30株芽孢桿菌分別隸屬于7個(gè)種，其中Bacillus subtilis（36.67%）和Bacillus licheniformis（26.67%）相對(duì)含量較高，對(duì)大曲中風(fēng)味物質(zhì)的形成及中溫大曲品質(zhì)的改善具有不可忽視的作用。