慢性間歇性低氧對大鼠腸道菌群與血糖的影響研究*

李 雯,劉婭欽,路 蘋,萬自芬,張湘燕,趙 丹△

(1.貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,貴陽550002;2.國家衛(wèi)生健康委員會肺臟免疫性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550000)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)是臨床常見的綜合征,目前普遍認(rèn)為OSAHS是一種全身性疾病,可致多器官損害,其是高血壓的致病因素,也是糖尿病、中風(fēng)、缺血性心肌病、心力衰竭、心律失常等疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。慢性間歇性低氧(chronic intermittent hyoxia,CIH)是OSAHS特有的病理生理改變,可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥、交感神經(jīng)過敏和內(nèi)皮功能障礙[2]。OSAHS發(fā)生并發(fā)癥病因的中心因素是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。動物模型顯示,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)增加活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),其可通過相關(guān)酶類的激活及磷酸化過程活化核因子-κB(NF-κB),后者將導(dǎo)致其下游大量促炎因子、黏附因子表達(dá)增強(qiáng),激活單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等引起內(nèi)皮功能受損和多系統(tǒng)疾病[3]。腸道菌群作為人或動物的“共生體”,可以輔助宿主進(jìn)行營養(yǎng)吸收和能量代謝[4]。正常情況下腸道菌群與機(jī)體處于平衡狀態(tài),通過腸道屏障將腸腔內(nèi)存在的大量細(xì)菌及毒素和機(jī)體內(nèi)環(huán)境分隔開,避免了細(xì)菌的滯留和移位,正常腸道內(nèi)的細(xì)菌及內(nèi)毒素并不致病。當(dāng)由于各種原因打破這種平衡時(shí),腸道屏障破壞,導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生結(jié)構(gòu)、功能變化或空間上的轉(zhuǎn)移,從而引發(fā)機(jī)體疾病。腸道黏膜在正常情況下處于高灌注狀態(tài),對缺血、缺氧極其敏感,無論是機(jī)體整體還是腸道缺血、缺氧都會直接損傷腸道黏膜,進(jìn)一步影響腸道微生物的定殖[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),長期處于CIH狀態(tài)下會引起腸道菌群改變、血糖調(diào)節(jié)紊亂,但其機(jī)制仍不清楚[6-7]。因此,本研究探討CIH對大鼠腸道菌群與血糖的作用機(jī)制,以期為改善患者預(yù)后提供潛在的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取健康雄性SD大鼠30只,6周齡,體重180～220 g,購自重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動物銷售有限公司。

1.2 主要試劑

大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、脂多糖(LPS)、血糖、胰島素(INS)的ELISA試劑盒購自上海研輝生物科技有限公司,NF-κB抗體兔多抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。純氮?dú)赓徸再F州省安順市特種氣體有限公司。

1.3 方法

1.3.1模型制作及分組

SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組(NC組)、CIH 4周組(CIH4組)、CIH 8周組(CIH8組),每組10只。誘導(dǎo)CIH模型:向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)?純度>99.9%)和空氣,氧氣分析儀持續(xù)檢測低氧艙內(nèi)氧氣濃度,確保低氧艙內(nèi)氧氣濃度維持在7%～21%;充入氮?dú)馐沟玫脱跖撗鯕鉂舛染S持在7%,持續(xù)時(shí)間30 s,恢復(fù)氧濃度21%,持續(xù)時(shí)間90 s,每次循環(huán)2 min[4]。CIH大鼠每天結(jié)束實(shí)驗(yàn)后將實(shí)驗(yàn)動物取出,放入飼養(yǎng)箱內(nèi)自由飲水與攝食,飼養(yǎng)條件及生活環(huán)境與NC組相同,實(shí)驗(yàn)過程中CIH8組大鼠死亡2只。分別在實(shí)驗(yàn)第4周結(jié)束時(shí)留取CIH4組大鼠糞便,實(shí)驗(yàn)第8周結(jié)束時(shí)留取CIH8組、NC組大鼠糞便。糞便采集方法:75%乙醇連續(xù)3次消毒大鼠肛周皮膚刺激大鼠排便,滅菌鑷子從大鼠肛門部取出糞便放入無菌EP管中-80 ℃冰箱保存。第4、8周結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí),于清晨保持空腹?fàn)顟B(tài),100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行常規(guī)麻醉大鼠,經(jīng)股動脈采血并處死大鼠,立即暴露胰腺組織及腸道組織并做好分離,室溫下4%多聚甲醛固定24 h。暴露腸道,尋找回盲部,摘取部分小腸段及大腸起始段,清水沖洗多次直至腸道無糞便殘?jiān)?放入無菌EP管中-80 ℃冰箱保存。離心血標(biāo)本(3 000 r/min,離心15 min),留取上清液。

1.3.2檢測大鼠血清中TNF-α、LPS、INS及空腹血糖(FBG)水平

采用ELISA法檢測各組大鼠血清中TNF-α、LPS、INS及FBG水平,具體步驟參照試劑盒說明書。采用穩(wěn)態(tài)模型法計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。

1.3.3高通量測序

通過干冰將大鼠糞便轉(zhuǎn)運(yùn)至深圳微科服技術(shù)有限公司,后續(xù)大鼠腸道菌群測序工作交由該公司進(jìn)行。根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(杭州西頓生物科技有限公司)對大鼠腸道樣品進(jìn)行DNA抽提,NanoDrop2000對DNA濃度和純度進(jìn)行檢測,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量;338上游引物5′-ACT CCT ACG GGA GGA GCA G-3′和8806下游引物5′-GGA CTA CHV GGG TWT CAA T-3′對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美國Axygen公司)進(jìn)行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行定量檢測。根據(jù)IlluminaMiSeq平臺標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE300的文庫,美國Illumina公司的MiseqPE300平臺進(jìn)行測序。

1.3.4大鼠胰腺、腸道組織病理學(xué)改變及NF-κB表達(dá)

胰腺、腸道組織制作石蠟切片和蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察病理學(xué)改變。免疫組化測定大鼠胰腺、腸道組織NF-κB表達(dá)。復(fù)水,抗原修復(fù),3%過氧化氫室溫下孵育,加入NF-κBp65兔抗人單克隆抗體和生物素二抗,DAB顯色,復(fù)染脫水,中性樹膠封片固定、晾干后高倍視野顯微鏡下觀察,成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件分析,結(jié)果表示為目標(biāo)蛋白的平均光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中FBG、LPS、INS、HOMA-IR、TNF-α水平比較

CIH4、CIH8組血清中FBG、LPS、HOMA-IR、TNF-α水平均高于NC組(P<0.05),且CIH8組變化更明顯(P<0.05)。CIH8組大鼠INS水平均高于NC、CIH4組(P<0.05),但NC組與CIH4組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠血清中FBG、INS、HOMA-IR、LPS、TNF-α水平比較

2.2 各組大鼠腸道菌群種類及豐度表達(dá)

CIH大鼠腸道菌群門水平相對豐度主要集中在放線菌門、變形菌門,而NC組大鼠腸道菌群門水平相對豐度主要集中在厚壁菌門和擬桿菌門。CIH大鼠腸道菌群在屬水平隨著低氧時(shí)間的延長未指明的梭菌目細(xì)菌、瘤胃球菌屬細(xì)菌、未指明消化鏈球菌科細(xì)菌、密螺旋體屬細(xì)菌、擬桿菌屬細(xì)菌、蘇黎世桿菌屬細(xì)菌及棒狀桿菌屬細(xì)菌的相對豐度增加,乳酸菌屬細(xì)菌及普雷沃菌屬細(xì)菌的相對豐度減少,NC組大鼠腸道菌群屬水平相對豐度主要集中在乳酸菌屬細(xì)菌和普雷沃菌屬細(xì)菌。

2.3 各組大鼠胰腺和腸道組織病理學(xué)改變及NF-κB表達(dá)

NC組大鼠胰腺組織少量胰腺腺泡胞質(zhì)疏松,胞核居中,與周圍細(xì)胞產(chǎn)生間隔;有的胰島細(xì)胞胞質(zhì)疏松,未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。間歇性低氧可導(dǎo)致大鼠胰腺組織腺體杯狀細(xì)胞消失,有的地方可見腺體脫落,殘留基底組織。NC組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,有的地方可見腺體脫落,固有層少許炎性細(xì)胞浸潤。間歇性低氧可導(dǎo)致大鼠腸道組織廣泛黏膜糜爛,上皮細(xì)胞脫落,腺體杯狀細(xì)胞消失,有的地方可見腺體脫落,殘留基底組織,固有層廣泛可見較多炎性細(xì)胞浸潤,見圖1。

CIH8組胰腺和腸道組織中NF-κBp65表達(dá)高于NC組(P<0.05),其余組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2、表2。

圖2 各組大鼠胰腺和腸道組織免疫組化檢測(200×)

表2 各組不同組織中NF-κBp65表達(dá)比較

3 討 論

CIH是OSAHS最具特征性的病理生理改變,長期間歇性低氧狀態(tài)誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是OSAHS引起多系統(tǒng)并發(fā)癥的最重要機(jī)制。OSAHS由于反復(fù)發(fā)生低氧、復(fù)氧過程,可能引起類似缺血-再灌注的病理生理改變,產(chǎn)生大量ROS,進(jìn)一步激活炎癥因子,引起全身炎癥反應(yīng)[8]。人或動物的腸道黏膜處于高灌注狀態(tài),因此對缺血、缺氧十分敏感。機(jī)體整體或腸道缺血、缺氧的狀態(tài)會直接損傷腸道黏膜系統(tǒng),導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生改變、菌群移位[9-11]。腸道菌群主要位于結(jié)腸,機(jī)體內(nèi)外環(huán)境破壞均可導(dǎo)致腸道菌群紊亂[12]。CIH小鼠在全身炎癥因子水平升高的情況下,腸道菌群發(fā)生明顯改變,特別是擬桿菌屬、脫硫弧菌科增多,雙歧桿菌屬減少。有研究表明,腸道菌群發(fā)酵后的主要代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)如乙酸、丙酸、丁酸等參與調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、腸道免疫及炎癥反應(yīng)[13]。腸道免疫系統(tǒng)通過腸道微生物與先天性免疫系統(tǒng)的Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)的相互作用引發(fā)免疫信號,TLR可通過相關(guān)信號通路激活NF-κB途徑參與腸道的炎癥反應(yīng)[14-15]。而腸道菌群紊亂可通過引發(fā)機(jī)體慢性炎癥、代謝紊亂、改變SCFA等途徑進(jìn)一步促成糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[14]。NF-κB是哺乳動物的一種多效性轉(zhuǎn)錄因子,受氧化應(yīng)激、LPS、細(xì)胞因子等多種刺激而活化,有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB是介導(dǎo)OSAHS炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子[5]。機(jī)體在一般情況下NF-κB處于失活狀態(tài),CIH引起類似缺血-再灌注損傷的病理改變,產(chǎn)生大量ROS,激活相關(guān)信號通路和NF-κB途徑,進(jìn)而啟動基因的轉(zhuǎn)錄,使得下游的炎癥相關(guān)因子如白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、TNF-α等表達(dá)增加[16],引起血管內(nèi)皮功能損傷。有研究證實(shí),LPS可通過CD14/Toll受體通路激活NF-κB,進(jìn)入細(xì)胞核后與DNA結(jié)合,從而啟動炎性因子TNF-α、IL-6等的表達(dá),引發(fā)機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)和代謝紊亂[17]。有臨床試驗(yàn)研究將中重度OSAHS患者與健康對照進(jìn)行比較,分別檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及炎癥因子水平,3個(gè)月后重復(fù)檢測上述指標(biāo),發(fā)現(xiàn)中重度OSAHS患者氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及炎癥因子水平明顯升高[18]。有實(shí)驗(yàn)研究把大鼠至于間歇性低氧環(huán)境下生存4周,發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下大鼠的IL-6、TNF-α明顯升高[19]。有研究指出,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)使得機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS,其具有細(xì)胞毒性,可通過多種途徑促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡,直接導(dǎo)致胰腺細(xì)胞功能受損[20]。機(jī)體為適應(yīng)環(huán)境,大量表達(dá)炎癥因子,其中NF-κB由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞核,激活細(xì)胞炎性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,TNF-α、IL-6等炎性因子增加。TNF-α可誘導(dǎo)胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和INS受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)的絲氨酸磷酸化水平升高,而抑制正常的酪氨酸磷酸化,使INS受體與底物結(jié)合降低,信號傳導(dǎo)受抑制,INS不能發(fā)揮正常作用[21]。此外,TNF-α通過蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C,PP2C)的轉(zhuǎn)錄上調(diào),關(guān)鍵能量傳感器AMP依賴的蛋白激酶失活來抑制INS敏感性[22]。有研究顯示[23-24],小鼠皮下注射LPS 4周后血糖升高、糖耐量異常,并出現(xiàn)了IR等。PANOUTSOPOULOS等[25]發(fā)現(xiàn),給予OSAHS患者持續(xù)氣道正壓通氣(continues the positive pressure to ventilate,CPAP)治療后,體內(nèi)高水平的CRP及IL-6等明顯下降,IR緩解。有研究提示,短期的CPAP治療能夠降低睡眠期間或全天的血糖水平,改善IR[26]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低氧能造成腸道菌群改變,從而增加腸道通透性,改變血漿外泌體,誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞功能障礙,致使IR增加;已有動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),將OSAHS小鼠糞便微生物轉(zhuǎn)移至受體小鼠后,出現(xiàn)了IR[27-28]。因此,OSAHS引起的腸道菌群失調(diào)可以導(dǎo)致IR。本實(shí)驗(yàn)通過模擬OSAHS的間歇低氧狀態(tài),建立CIH大鼠模型,進(jìn)一步驗(yàn)證了其可引起腸道菌群失調(diào),體內(nèi)炎癥因子水平發(fā)生改變,LPS、TNF-α、NF-κB水平升高,腸道組織和部分胰腺組織腺體破壞,血糖水平改變,為OSAHS合并糖尿病患者的防治提供了新思路。